CN107602504A - 一种检测次氯酸的荧光探针及其制备方法与使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测次氯酸的荧光探针及其制备方法与使用方法。本发明利用2‑(2’‑羟基苯基)苯并噻唑构筑经典的ESIPT体系，并在5’‑位直接引入叠氮部分，使其更具生物和光学稳定性。探针本身的ESIPT效应被叠氮基团抑制而无荧光发射，但当存在次氯酸的条件下，叠氮基团被次氯酸氧化，进而使其抑制作用消失，探针分子发射出强荧光。本发明提供的2‑(2’‑羟基苯基)苯并噻唑‑叠氮染料的“开‑关”型次氯酸探针对次氯酸溶液具有良好的响应，能够实现对样品内微量次氯酸的灵敏定量检测，具有操作简便，成本低廉，响应灵敏，易于推广和应用等优点。

Description

一种检测次氯酸的荧光探针及其制备方法与使用方法

技术领域

本发明属于有机小分子荧光探针领域，具体涉及一种作为次氯酸荧光探针使用的叠氮类衍生物及其制备方法与使用方法。

背景技术

次氯酸是一种常见的非亲核性氧化剂，是工业和日常生活中广泛使用的清洁剂和抗菌剂的主要成分，也是生物体免疫系统最关键的活性氧物种(ROS)。在生命体内，次氯酸参与了细胞内氧化还原反应和多种信号传导过程，包括血管舒张、心肌收缩、神经传递和胰岛素分泌等。而当细胞内次氯酸处于非正常水平时将导致一系列生理疾病，例如关节炎、神经衰弱和癌症等。因此，有效地检测或监控生物样品或环境样品中的次氯酸已成为近年来相关领域的研究热点。

荧光检测法由于其优秀的检测灵敏度和选择性，并能实现对生物样品的实时、在线检测而受到研究者的广泛关注。2-(2’-羟基苯基)苯并噻唑类荧光分子因其具有良好的光稳定性、高摩尔消光系数和量子产率以及具有独特的激发态分子内质子转移(ESIPT)等独特光学性质而成为该方法最重要的荧光母体之一，在多种待测分子的荧光检测中得到了广泛的应用。

目前已开发的用于检测次氯酸的小分子荧光探针主要基于次氯酸与还原性官能团之间的特异性化学反应而设计的。当存在次氯酸的条件下，探针分子中的还原性官能团(如：硫醚，硒醚，肟，亚胺等等)被次氯酸氧化为高价态原子(如硫醚和硒醚等)或是发生键的断裂(如：肟，亚胺等等)，导致探针分子的荧光性质发生变化，从而实现对次氯酸的特异性设别。

然而，基于硫醚，硒醚为探针报告基团的探针(参见Yu,F.；Li,P.；Li,G.；Zhao,G.；Chu,T.；Han,K.J.Am.Chem.Soc.,2011,133,11030-11033；Manjare,S.T.；Kim,S.；Heo,W.D.；Churchill,D.G.Org.Lett.,2014,16,410-412)易受到生物体中其它活性氧物种(ROS)的影响。而基于肟，亚胺等为探针报告基团的探针由于亚胺在酸性条件下易于水解而易受到pH环境的影响，不利于其在复杂的生物体内进行检测。此外，目前的次氯酸荧光探针的检测限相对较高，难以对微量甚至极微量的次氯酸样品进行定量检测。

发明内容

为了克服现有技术中的上述缺陷，本发明提出了一种定量检测次氯酸的荧光探针(PHC)。利用本发明可对样品中极微量的次氯酸进行定量检测。

本发明的核心在于利用2-(2’-羟基苯基)苯并噻唑构筑经典的ESIPT体系，并在5’-位直接引入叠氮部分，使其更具生物和光学稳定性。探针本身的ESIPT效应被叠氮基团抑制而无荧光发射，但当存在次氯酸的条件下，叠氮基团被次氯酸氧化，进而使其抑制作用消失，探针分子发射出强荧光，通过上述方案，获得了“开-关”型的荧光响应，实现了对次氯酸的高灵敏、特异性检测。

本发明所述次氯酸荧光探针命名为2-(2’-羟基-5’-叠氮苯基)苯并噻唑，结构式如式(I)所示：

上述次氯酸荧光探针的制备方法如下：将邻氨基苯硫酚(1)和5-硝基水杨醛(2)溶于无水乙醇中，邻氨基苯硫酚与5-硝基水杨醛的质量比为23:30，常温搅拌至原料全部溶解。依次向溶液中缓慢滴加浓盐酸和双氧水后继续搅拌5小时，有固体析出，减压过滤，用无水乙醇洗涤，干燥得化合物2-(2’-羟基-5’-硝基苯基)苯并噻唑(3)。

将2-(2’-羟基-5’-硝基苯基)苯并噻唑(3)溶于无水乙醇中，加热回流搅拌至原料全部溶解，分批加入铁粉，再缓慢滴加浓盐酸，搅拌下加热回流2小时，趁热将铁粉滤出，向反应液中加入水，将反应混合液浓缩至一定体积，用饱和碳酸氢钠溶液调至中性，有固体析出，减压过滤，无水乙醇重结晶得到2-(2’-羟基-5’-氨基苯基)苯并噻唑(4)。在0℃下，将一定量2-(2’-羟基-5’-氨基苯基)苯并噻唑(4)置于反应瓶，依次加入水和浓盐酸，再向反应体系中缓慢滴加亚硝酸钠的饱和水溶液后，再分批加入叠氮化钠，室温搅拌1小时后，有固体析出、减压过滤，粗产物经柱色谱提纯得2-(2’-羟基-5’-叠氮苯基)苯并噻唑(5)，即：PHC。

上述探针的制备反应式如下：

上述次氯酸荧光探针的使用方法如下：

步骤1：向不同浓度次氯酸的缓冲溶液中加入相同浓度的式(I)所示化合物，配置至少5种不同次氯酸含量的含有式(I)所示化合物的标准溶液；

所示缓冲溶液可以是磷酸盐缓冲溶液、Tris-HCl缓冲溶液、HEPES缓冲溶液或硼酸-硼酸钠缓冲溶液；

所示标准溶液的pH值为5～11；

所示标准溶液中式(I)所示化合物的浓度为1nM～1μM；

所示标准溶液中次氯酸的含量为0.1nM～1mM；

步骤2：分别测定所述标准溶液的荧光发射光谱，激发波长为365nm，以次氯酸浓度为横坐标，以I₄₅₀为纵坐标，建立标准曲线；

I₄₅₀表示所述标准溶液在波长为450nm处的荧光发射峰强度值；

步骤3：向待测样品中加入式(I)所示化合物，控制其浓度与所述标准溶液中式(I)所示化合物的浓度相等；测定其在激发波长为365nm的激发光下的荧光发射谱，即根据标准曲线计算得出待测样品的次氯酸含量。

本发明具有如下特点：

1)本发明提供的荧光探针是黄色固体粉末，分子结构光学稳定性。

2)本发明提供的荧光探针，其溶液对次氯酸的浓度敏感，随着次氯酸浓度的增加，紫外灯下观察到其水溶液的荧光由无色变为蓝色。

3)本发明提供的荧光探针，其发射波长为450nm，为荧光“开-关”型响应，能大大消除检测时检测条件差异对结果的影响，提高检测的灵敏度。

4)本发明提供的荧光探针对次氯酸浓度呈线性关系，可用于次氯酸精确测量。

本发明提供的2-(2’-羟基苯基)苯并噻唑-叠氮染料的“开-关”型次氯酸探针对次氯酸溶液具有良好的响应，能够实现对样品内次氯酸的灵敏定量检测，具有操作简便，成本低廉，响应灵敏，易于推广和应用等优点。

附图说明

图1：荧光探针PHC的核磁共振氢谱。

图2：荧光探针PHC对次氯酸水溶液的颜色响应图。

图3：荧光探针PHC对次氯酸水溶液的荧光响应图。

图4：荧光探针PHC在缓冲液中次氯酸的紫外滴定曲线，其中探针浓度为1.0μM。

图5：荧光探针PHC在缓冲液中次氯酸的荧光滴定曲线，其中激发波长为365nm，探针浓度为1.0μM。

图6：荧光探针PHC对常见共存离子或生物小分子的荧光响应图，其中激发波长为365nm，探针浓度为1.0μM，离子浓度为10.0μM。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均从商业途径得到。

实施例中的化合物号码对应上述化合物中的号码。

实施例1、化合物PHC的合成

化合物2-(2’-羟基-5’-硝基苯基)苯并噻唑(3)的合成

将23g邻氨基苯硫酚(1)(0.18mol)和30g 5-硝基水杨醛(2)(0.18mol)溶于600mL无水乙醇中，常温搅拌至原料全部溶解。依次向溶液中缓慢滴加30mL浓盐酸和90mL双氧水后继续搅拌5小时后，有固体析出、减压过滤，用无水乙醇洗涤、干燥得化合物2-(2’-羟基-5’-硝基苯基)苯并噻唑(3)，该化合物可直接用于下一步反应。

化合物2-(2’-羟基-5’-氨基苯基)苯并噻唑(4)的合成

将10g 2-(2’-羟基-5’-硝基苯基)苯并噻唑(3)(37mmol)溶于200mL无水乙醇中，加热回流搅拌至原料全部溶解，分批加入20g铁粉，再缓慢滴加5mL浓盐酸，搅拌下加热回流2小时，趁热将铁粉滤出，向反应液中加入50mL水，将反应混合液浓缩至50mL，用饱和碳酸氢钠溶液调至中性，有固体析出、减压过滤，无水乙醇重结晶得到浅黄色固体2-(2’-羟基-5’-氨基苯基)苯并噻唑(4)，该化合物可直接用于下一步反应。

化合物2-(2’-羟基-5’-叠氮苯基)苯并噻唑(5)的合成

在0℃下，将2g 2-(2’-羟基-5’-氨基苯基)苯并噻唑(4)(8.3mmol)置于反应瓶，依次加入40mL水和40mL浓盐酸，再向反应体系中缓慢滴加0.68g亚硝酸钠的饱和水溶液后，再分批加入0.65g叠氮化钠，室温搅拌1小时后，有固体析出、减压过滤，粗产物经柱色谱提纯得2-(2’-羟基-5’-叠氮苯基)苯并噻唑(5)，即：PHC，产率70％。核磁共振图谱如图1。

¹H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ12.45(s,1H),7.99(d,J＝8.1Hz,1H),7.91(d,J＝8.0Hz,1H),7.52(t,J＝7.6Hz,1H),7.43(t,J＝7.5Hz,1H),7.27(s,1H),7.09(q,J＝8.8Hz,2H)。

实施例2、化合物PHC对次氯酸的颜色响应

配制浓度为1mM的本发明所述检测次氯酸的荧光探针PHC的二甲基亚砜(DMSO)的测试母液溶液待用。量取10μL的此母液滴加到一定浓度次氯酸的磷酸盐缓冲液中，并用相应的磷酸盐缓冲液定容到10mL，使得测试液中，探针的浓度为1.0μM，次氯酸浓度为10.0μM进行颜色响应测试。如图2和3所示，加入次氯酸水溶液后，肉眼观察到溶液的颜色由无色变为浅黄色，同时溶液的荧光也由几乎无荧光变为亮蓝色荧光，表明探针PHC对次氯酸具有直观的显色响应。

实施例3、不同浓度次氯酸对化合物PHC的紫外滴定检测

配制浓度为1mM的本发明所述检测次氯酸的荧光探针PHC的二甲基亚砜(DMSO)的测试母液溶液待用。量取10μL的此母液分别滴加到不同浓度次氯酸的磷酸盐缓冲液中，并用相应的磷酸盐缓冲液定容到10mL，使得测试液中，探针的浓度为1.0μM，次氯酸浓度为0-4.0μM进行吸收光谱测试。得各体系中紫外吸收曲线，建立吸光度与次氯酸浓度标准曲线。如图4所示，随着次氯酸浓度的增加，406nm处吸光度逐渐增加，并与次氯酸浓度(0-4.0μM)呈良好的线性关系。

实施例4、不同浓度次氯酸对化合物PHC的荧光滴定检测

配制浓度为1mM的本发明所述检测次氯酸的荧光探针PHC的二甲基亚砜(DMSO)的测试母液溶液待用。量取10μL的此母液分别滴加到不同浓度次氯酸的磷酸盐缓冲液中，并用相应的磷酸盐缓冲液定容到10mL，使得测试液中，探针的浓度为1.0μM，次氯酸浓度为0-20.0μM进行荧光检测(λex＝365nm,λem＝450nm)。得各体系中荧光强度，建立荧光强度与次氯酸浓度标准曲线。如图5所示，随着次氯酸浓度的增加，450nm处荧光强度逐渐增加，当次氯酸浓度达到10.0μM时，反应体系荧光强度达到饱和状态。此外，在低浓度下，荧光强度和次氯酸的浓度(0-4.0μM)之间呈现良好的线性关系(R²＝0.99)，探针PHC对次氯酸的检测限可达0.84nM。

实施例5、化合物PHC对不同氧化和还原性离子、小分子的选择性

配制浓度为1mM的本发明所述检测次氯酸的荧光探针PHC的二甲基亚砜(DMSO)的测试母液溶液待用。配制浓度为10mM的各种不同离子，小分子的溶液作为备用。量取10μL的此母液分别滴加到不同待测离子或小分子的磷酸盐缓冲液中，并用相应的磷酸盐缓冲液定容到10mL，使得测试液中，探针的浓度为1.0μM，待测离子或小分子的浓度为10.0μM进行荧光检测(λex＝365nm,λem＝450nm)。得各体系中荧光强度，建立荧光强度与各离子的柱状图。如图6所示，其他离子(或小分子)对探针PHC的荧光几乎没有影响。

Claims (3)

1.一种检测次氯酸的荧光探针,其特征在于：其分子式为C₁₃H₈N₄OS，简称PHC，结构式为式(I)；

2.根据权利要求1所述的一种检测次氯酸的荧光探针的制备方法，其特征在于，合成步骤如下：

1)将23g邻氨基苯硫酚和30g 5-硝基水杨醛溶于600mL无水乙醇中，常温搅拌至原料全部溶解；依次向溶液中缓慢滴加30mL浓盐酸和90mL双氧水后继续搅拌5小时后，有固体析出、减压过滤，用无水乙醇洗涤、干燥得化合物2-(2’-羟基-5’-硝基苯基)苯并噻唑；

2)将10g 2-(2’-羟基-5’-硝基苯基)苯并噻唑溶于200mL无水乙醇中，加热回流搅拌至原料全部溶解，分批加入20g铁粉，再滴加5mL浓盐酸，搅拌下加热回流2小时，趁热将铁粉滤出，向反应液中加入50mL水，将反应混合液浓缩至50mL，用饱和碳酸氢钠溶液调至中性，有固体析出、减压过滤，无水乙醇重结晶得到浅黄色固体2-(2’-羟基-5’-氨基苯基)苯并噻唑；

3)在0℃下，将2g 2-(2’-羟基-5’-氨基苯基)苯并噻唑置于反应瓶，依次加入40mL水和40mL浓盐酸，再向反应体系中滴加0.68g亚硝酸钠的饱和水溶液后，再分批加入0.65g叠氮化钠，室温搅拌1小时后，有固体析出、减压过滤，粗产物经柱色谱提纯得2-(2’-羟基-5’-叠氮苯基)苯并噻唑，即：PHC。

3.根据权利要求1所述的一种检测次氯酸的荧光探针的使用方法；其特征在于：

1)向不同浓度次氯酸的缓冲溶液中加入相同浓度的式(I)所示化合物，配置至少5种不同次氯酸含量的含有式(I)所示化合物的标准溶液；

所示缓冲溶液为磷酸盐缓冲溶液、Tris-HCl缓冲溶液、HEPES缓冲溶液或硼酸-硼酸钠缓冲溶液；

所示标准溶液的pH值为5～11；

所示标准溶液中式(I)所示化合物的浓度为1nM～1μM；

所示标准溶液中次氯酸的含量为0.1nM～1mM；

2)分别测定所述标准溶液的荧光发射光谱，激发波长为365nm，以次氯酸浓度为横坐标，以I₄₅₀为纵坐标，建立标准曲线；

I₄₅₀表示所述标准溶液在波长为450nm处的荧光发射峰强度值；

3)向待测样品中加入式(I)所示化合物，控制其浓度与所述标准溶液中式(I)所示化合物的浓度相等；测定其在激发波长为365nm的激发光下的荧光发射谱，即根据标准曲线计算得出待测样品的次氯酸含量。