CN105111464A - 一种土壤中腐殖酸的分级提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种土壤中腐殖酸的分级提取方法，所述分级提取方法包括如下步骤：步骤a：土壤预处理、步骤b：土壤酸洗、步骤c：提取土壤中腐殖酸、步骤d：腐殖酸除硅、步骤e：土壤腐殖酸除杂酸、步骤f：土壤腐殖酸的亚组分分级、步骤g：土壤腐殖酸除盐及固化。通过上述方式，本发明能够从土壤中提取腐殖酸溶液，并利用树脂分离技术对腐殖酸进行分级，纯化后，最终得到分级的腐殖酸亚组分。
Description
技术领域
本发明涉及腐殖酸分离提取技术，具体涉及一种土壤中腐殖酸的分级提取方法。
背景技术
腐殖酸（humicacid）是由动植物残体经过复杂的物理、化学、生物过程形成的大分子有机混合物，它广泛存在于土壤、水体、沉积物等环境介质中。腐殖酸能溶于碱性和中性溶液，不溶于酸，约占土壤有机质总量的60～80%，是土壤有机质最重要的组成部分。
腐殖酸可以促进土壤团粒体结构的形成，改善土壤透水性。腐殖酸通过自身的酸性和对植物根系的刺激作用改善土壤pH环境，在一定程度上减轻土壤板结和盐碱化。腐殖酸是土壤中重要的碳源，它还能增加土壤中的微生物数量和土壤酶活性，为作物生长提供碳源。腐殖酸能与铵盐、磷酸盐、钾离子及土壤微量元素相互作用增加土壤的养分保蓄和营养盐的可利用性。此外，腐殖酸能与环境中的有毒重金属离子和有机污染物（如农药，PPCPs和PAHs）发生相互作用，形成化学和生物稳定性的溶于水和不溶于水的物质，从而改变其迁移、转化规律和生物有效性。总之，土壤腐殖酸对土壤良好结构的形成、土壤酸碱度的调节、水土保持以及土壤中有毒有害污染物的清除、植物元素营养平衡，乃至全球碳平衡起着至关重要的作用。
人口的增加，化肥和农药的普遍使用及化学工业发展造成的环境污染日趋加剧，随之而来的是土地退化、土壤污染及粮食品质下降。实施可持续有机农业成为农业发展的趋向，因此，进行土壤腐殖酸的研究对农业和环境学的发展具有重要的意义。
现代仪器分析技术的发展，为土壤腐殖质的研究提供了先进的手段，使土壤腐殖质的研究有了许多新的突破。人们对腐殖酸结构特征的研究已有最初的元素含量等整体性质的研究，逐渐发展到精细结构的研究。红外光谱、紫外光谱、荧光光谱、核磁共振等研究方法的普及和使用，使人们对腐殖酸的化学结构有了更多的了解。但是由于腐殖酸的组成和结构及其复杂，它的元素组成、分子量、芳香度及官能团含量等随着时空不同而发生变化，因此成功分离腐殖酸及其亚组分具有重要的环境学意义。
为了更近一步的研究腐殖酸的结构和组成，前人将腐殖酸进行分级分离，从而减小其异质性，取得一些列成果。土壤腐殖酸的分级分离方法分为两类，一类是连续提取类方法，即连续向土壤中加入腐殖酸提取剂，实现腐殖酸的分级分离；一类是连续洗脱类方法，即将提取出的腐殖酸吸附到树脂柱上，用不同淋洗液进行淋洗，实现腐殖酸的分级分离。焦磷酸钠-氢氧化钠联用是一种典型的腐殖酸连续提取类放法，该方法依次使用焦磷酸钠和氢氧化钠在土壤中直接提取腐殖酸。如Kang等用同浓度的焦磷酸钠和氢氧化钠溶液从土壤中提取腐殖酸；施国兰等采用不同浓度的焦磷酸钠和氢氧化钠溶液从土壤中连续提取腐殖酸。焦磷酸钠和氢氧化钠联用法涉及利用不同溶液，从土壤中反复加入提取液，需处理液体体积巨大，中和及腐殖酸沉淀过程中使用大量盐酸等，具有明显的缺陷和局限性。Yonebayashi和Hattori使用连续洗脱类方法法进行腐殖酸的分离，该方法首先将腐殖酸吸附在XAD-8树脂上，利用有机混合缓冲剂（柠檬酸、磷酸钾、四硼酸钠、三异丙基乙磺酰、氯化钾）、水和甲醇连续洗脱获得腐殖酸样品。该方法在从XAD-8树脂上洗涤吸附腐殖酸时，涉及柠檬酸和三异丙基乙磺酰等有机溶剂，可能造成腐殖酸结构的改变，并且难以定量估算有机溶剂在腐殖酸样品中的残留量，存在巨大缺陷。
发明内容
本发明的目的是提供一种土壤中腐殖酸的分级提取方法，该方法能够克服现有技术对腐殖酸分级提取过程的不足，获得腐殖酸各级亚组分。
连续提取类方法涉及多次向土壤中加入提取液，需处理液体体积巨大，操作步骤繁杂，费时费力，提取液过程使用大量酸碱，产生药品浪费。本发明在对土壤进行酸洗的基础上，采用二次提取法既保证了土壤腐殖酸的全面提取，又避免了药品的浪费，且操作相对简单，费用大为降低。连续洗脱类方法涉及使用有机溶剂洗脱腐殖酸亚组分，有机溶剂可能造成腐殖酸结构的改变，并且难以定量估算有机溶剂在腐殖酸样品中的残留量。本发明在腐殖酸提取及分级过程中不涉及有机溶剂，在提取完成后，可以通过测定腐殖酸亚组分中各个元素含量，对可能的无机残留进行定量，保障了腐殖酸亚组分的纯净。
本发明公开的技术方案如下：一种土壤中腐殖酸的分级提取方法，所述分级提取方法包括如下步骤：
步骤a、土壤预处理：
称取天然土壤，剔除树根和石子等杂物，风干碾磨，得到土壤样品；
步骤b、土壤酸洗：
向土壤样品中加入去离子水，使固液比达到（1-3）：（5-8），用碱和酸调节其pH=1.0-3.0，得到固液混合物，向该固液混合物中加入酸，使其固液比为1:10，连续搅拌4-8h，静置20-28h后，离心后弃去上清液，得到酸洗土壤样品；
步骤c、提取土壤中腐殖酸：
向酸洗土壤样品中加入去离子水，使其固液比为（1-3）:（10-12），用酸和碱调节溶液pH=7，得到固液混合物，氮气保护条件下，向该固液混合物中加入焦磷酸钠溶液，并用去离子水稀释，使焦磷酸钠浓度为0.1-0.2mol/L且固液比为1:10，持续搅拌4-8h，静置20-28h后，离心得到上清液1和土壤样品1；
氮气保护条件下，向上清液1中加入酸，使其pH=1.0-3.0，搅拌15-30min，静置24-28h后，离心得固体，标记为腐殖酸1；
向步骤b中的土壤样品1中加入去离子水，使其固液比为（1-3）：（5-8），用酸和碱调节其pH=7，得到固液混合物，氮气保护条件下，向该固液混合物中加入氢氧化钠溶液，并用去离子水稀释，使氢氧化钠浓度为0.1-0.3mol/L且固液比为1:10，搅拌4-8h，静置20-28h后，离心得到上清液2和土壤残渣；
氮气保护条件下，向上清液2中加入盐酸，使其pH=1.0-3.0，搅拌15-30min，静置20-28h后，离心得固体，标记为腐殖酸2；
步骤d、腐殖酸除硅：
将腐殖酸1和腐殖酸2合并，氮气保护条件下，用含有0.1-0.3mol/L氢氧化钠和0.2-0.4mol/L氯化钠的溶液溶解，高速离心分离，得到上层清液；将该上层清液用盐酸酸化至pH=1.0-3.0，搅拌15-30min，静置20-28h，离心得固体，标记为腐殖酸3；
向腐殖酸3中加入含有0.1-0.3mol/L盐酸和0.2-0.4mol/L氢氟酸的溶液，使固液比为1:10，持续搅拌20-28h，离心分离得固体标记为无硅腐殖酸；
步骤e、土壤腐殖酸除杂酸：
向无硅腐殖酸中加入盐酸溶液，使其固液比为（1-3）:（10-12），持续搅拌4-8h，并静置20-28h后，离心得到上层清液及纯化腐殖酸；
步骤f、土壤腐殖酸的亚组分分级：
在氮气保护条件下，用氢氧化钠将步骤e中的纯化腐殖酸溶解，加入去离子水使溶液中腐殖酸浓度在1-3g/L，用盐酸和氢氧化钠调节溶液pH=1-3后，以10倍柱体积/h的速度流过XAD-8树脂柱，流出液弃去；
以5-10倍柱体积/h的速度，用pH=3的焦磷酸钠缓冲液淋洗XAD-8树脂柱，每收集2-50ml流出液，用特定波长紫外/可见光进行测定，流出液的紫外/可见吸光值先增大后减小，当流出液紫外/可见吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=3的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH=1，搅拌4h后，静置24h，离心得到固体，标记为腐殖酸pH3；
以5-10倍柱体积/h的速度，用pH=4的焦磷酸钠缓冲液淋洗XAD-8树脂柱，每收集2-50ml流出液，用特定波长紫外/可见光进行测定，流出液的紫外/可见吸光值先增大后减小，当流出液紫外/可见吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=4的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH=1，搅拌4h后，静置24h，离心得到固体，标记为腐殖酸pH4；
以5-10倍柱体积/h的速度，用pH=5的焦磷酸钠缓冲液淋洗XAD-8树脂柱，每收集2-50ml流出液，用特定波长紫外/可见光进行测定，流出液的紫外/可见吸光值先增大后减小，当流出液紫外/可见吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=5的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH=1，搅拌4h后，静置24h，离心得到固体，标记为腐殖酸pH5；
以5-10倍柱体积/h的速度，用pH=6的焦磷酸钠缓冲液淋洗XAD-8树脂柱，每收集2-50ml流出液，用特定波长紫外/可见光进行测定，流出液的紫外/可见吸光值先增大后减小，当流出液紫外/可见吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=6的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH=1，搅拌4h后，静置24h，离心得到固体，标记为腐殖酸pH6；
以5-10倍柱体积/h的速度，用pH=7的焦磷酸钠缓冲液淋洗XAD-8树脂柱，每收集2-50ml流出液，用特定波长紫外/可见光进行测定，流出液的紫外/可见吸光值先增大后减小，当流出液紫外/可见吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=7的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH=1，搅拌4h后，静置24h，离心得到固体，标记为腐殖酸pH7；
氮气保护下，以5-10倍柱体积/h的速度，用pH=8的焦磷酸钠缓冲液淋洗XAD-8树脂柱，每收集2-50ml流出液，用特定波长紫外/可见光进行测定，流出液的紫外/可见吸光值先增大后减小，当流出液紫外/可见吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=8的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH=1，搅拌4h后，静置24h，离心得到固体，标记为腐殖酸pH8；
氮气保护下，以5-10倍柱体积/h的速度，用pH=9的焦磷酸钠缓冲液淋洗XAD-8树脂柱，每收集2-50ml流出液，用特定波长紫外/可见光进行测定，流出液的紫外/可见吸光值先增大后减小，当流出液紫外/可见吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=9的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH1，搅拌4h后，静置24h，离心得到固体，标记为腐殖酸pH9；
氮气保护下，以5-10倍柱体积/h的速度，用pH=10的焦磷酸钠缓冲液淋洗XAD-8树脂柱，每收集2-50ml流出液，用特定波长紫外/可见光进行测定，流出液的紫外/可见吸光值先增大后减小，当流出液紫外/可见吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=10的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH=1，搅拌4h后，静置24h，离心得到固体，标记为腐殖酸pH10；
氮气保护下，以5-10倍柱体积/h的速度，用pH=11的焦磷酸钠缓冲液淋洗XAD-8树脂柱，每收集2-50ml流出液，用特定波长紫外/可见光进行测定，流出液的紫外/可见吸光值先增大后减小，当流出液紫外/可见吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=11的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH=1，搅拌4h后，静置24h，离心得到固体，标记为腐殖酸pH11；
氮气保护下，以5-10倍柱体积/h的速度，用pH=12的焦磷酸钠缓冲液淋洗XAD-8树脂柱，每收集2-50ml流出液，用特定波长紫外/可见光进行测定，流出液的紫外/可见吸光值先增大后减小，当流出液紫外/可见吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=12的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH=1，搅拌4h后，静置24h，离心得到固体，标记为腐殖酸pH12；
氮气保护下，以5-10倍柱体积/h的速度，用pH=13的焦磷酸钠缓冲液淋洗XAD-8树脂柱，每收集2-50ml流出液，用特定波长紫外/可见光进行测定，流出液的紫外/可见吸光值先增大后减小，当流出液紫外/可见吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=13的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH=1，搅拌4h后，静置24h，离心得到固体，标记为腐殖酸pH13；
步骤g、土壤腐殖酸除盐及固化：
在氮气保护下，用0.1-0.3mol/L的氢氧化钠分别溶解腐殖酸pH3-腐殖酸pH13，使每份溶液固液体积比均为1:2，用浓盐酸分别调节溶液pH=4-9，共计得到11份腐殖酸亚组分溶液；
将11份腐殖酸亚组分溶液分别置入11个截留分子量为10000道尔顿透析袋中，并将每个透析袋置于超纯水中，组成透析体系，搅拌20—40h后，将每个透析袋中的腐殖酸亚组分溶液冷冻干燥得到11份腐殖酸亚组分，命名为腐殖酸亚组分pH3-pH13。
优选的，所述分级提取方法中，所述步骤e中所得上层清液用溶解有机碳测定仪器测定其溶解有机碳含量，如果上清液中溶解有机碳TOC>5mg/L，则重复步骤e，直到TOC<5mg/L后，再进行步骤f。
优选的，所述步骤g中透析体系搅拌20—40h后，用钼酸铵分光光度法和硝酸银法分别测定步骤g中透析袋外溶液的磷含量和氯离子含量，如果总磷含量>0.01mg/L或者有氯化银存在，则多次更换透析体系中的超纯水，每次加入去离子水，搅拌20—40h后，再次测定，直到磷含量<0.01mg/L且检测不到氯离子。
优选的，所述分级提取方法还包括步骤h：在80-100℃下烘干20-40h后，在550℃下灼烧5-10h，测定步骤g所得的11份腐殖酸亚组分pH3-pH13的灰分；
如果其中某份腐殖酸亚组分以干重计灰分大于1.0%，则将该腐殖酸亚组分在氮气保护条件下，在容器中，用氢氧化钠溶解，加入去离子水使溶液腐殖酸浓度=1—3g/L后，调节pH=3-9，再加入浓盐酸、浓氢氟酸和去离子水，使固液比为1:10且盐酸浓度为0.1mol/L，氢氟酸浓度为0.3mol/L，持续搅拌20-28h，离心分离得固体后重复操作步骤g。
更进一步详细的，本发明公开的土壤中腐殖酸的分级提取方法，所述分级提取方法包括如下步骤：
步骤a、土壤预处理：称取天然土壤，剔除树根和石子等杂物，风干碾磨后过2.0mm的筛，得到土壤样品；
步骤b、土壤酸洗：向土壤样品中加入去离子水，使固液比达到1：5，用氢氧化钠和盐酸调节其pH=1.0，得到固液混合物，向该固液混合物中加0.1mol/L的盐酸溶液，使其固液比为1:10，连续搅拌4h，静置24h后，离心后弃去上清液，得到酸洗土壤样品；
步骤c、提取土壤中腐殖酸：向酸洗土壤样品中加入去离子水，使其固液比为1:3，用盐酸和氢氧化钠调节溶液pH=7，得到固液混合物，氮气保护条件下，向该固液混合物中加入焦磷酸钠溶液，并用去离子水稀释，使焦磷酸钠浓度为0.1mol/L且固液比为1:10，持续搅拌4h，静置24h后，离心得到上清液1和土壤样品1；
氮气保护条件下，向上清液1中加入6mol/L盐酸，使其pH=1.0，搅拌30min，静置24后，离心得固体，标记为腐殖酸1；
向步骤b中的土壤样品1中加入去离子水，使其固液比为1：3，用盐酸和氢氧化钠调节其pH=7，得到固液混合物，氮气保护条件下，向该固液混合物中加入氢氧化钠溶液，并用去离子水稀释，使氢氧化钠浓度为0.1mol/L且固液比为1:10，搅拌4h，静置24h后，离心得到上清液2和土壤残渣；
氮气保护条件下，向上清液2中加入6mol/L盐酸，使其pH=1.0，搅拌30min，静置24h后，离心得固体，标记为腐殖酸2；
步骤d、腐殖酸除硅：将腐殖酸1和腐殖酸2合并，氮气保护条件下，用含有0.1mol/L氢氧化钠和0.3mol/L氯化钠的溶液溶解，高速离心分离，得到上层清液；将该上层清液用盐酸酸化至pH=1.0，搅拌30min，静置24h，离心得固体，标记为腐殖酸3；
向腐殖酸3中加入含有0.1mol/L盐酸和0.3mol/L氢氟酸的溶液，使其固液比为1:10，持续搅拌24h，高速离心分离得固体标记为无硅腐殖酸；
步骤e、土壤腐殖酸除杂酸：向无硅腐殖酸中加入0.1mol/L盐酸溶液，使其固液比为1:10，持续搅拌4h，并静置24h后，离心得到上层清液及纯化腐殖酸；
步骤f、土壤腐殖酸的亚组分分级：在氮气保护条件下，用氢氧化钠将步骤e中的纯化腐殖酸溶解，加入去离子水使溶液中腐殖酸浓度在1-3g/L，用盐酸和氢氧化钠调节溶液pH=2后，以10倍柱体积/h的速度流过XAD-8树脂柱，流出液弃去；
以10柱体积/h的速度，用pH=3的焦磷酸钠缓冲液淋洗XAD-8树脂柱，每收集2-50ml流出液，用特定波长紫外/可见光进行测定，流出液的紫外/可见吸光值先增大后减小，当流出液紫外/可见吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=3的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH=1，搅拌4h后，静置24h，离心得到固体，标记为腐殖酸pH3；
以10柱体积/h的速度，用pH=4的焦磷酸钠缓冲液淋洗XAD-8树脂柱，每收集2-50ml流出液，用特定波长紫外/可见光进行测定，流出液的紫外/可见吸光值先增大后减小，当流出液紫外/可见吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=4的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH=1，搅拌4h后，静置24h，离心得到固体，标记为腐殖酸pH4；
以10柱体积/h的速度，用pH=5的焦磷酸钠缓冲液淋洗XAD-8树脂柱，每收集2-50ml流出液，用特定波长紫外/可见光进行测定，流出液的紫外/可见吸光值先增大后减小，当流出液紫外/可见吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=5的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH=1，搅拌4h后，静置24h，离心得到固体，标记为腐殖酸pH5；
以10柱体积/h的速度，用pH=6的焦磷酸钠缓冲液淋洗XAD-8树脂柱，每收集2-50ml流出液，用特定波长紫外/可见光进行测定，流出液的紫外/可见吸光值先增大后减小，当流出液紫外/可见吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=6的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH=1，搅拌4h后，静置24h，离心得到固体，标记为腐殖酸pH6；
以10柱体积/h的速度，用pH=7的焦磷酸钠缓冲液淋洗XAD-8树脂柱，每收集2-50ml流出液，用特定波长紫外/可见光进行测定，流出液的紫外/可见吸光值先增大后减小，当流出液紫外/可见吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=7的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH=1，搅拌4h后，静置24h，离心得到固体，标记为腐殖酸pH7；
氮气保护下，以10柱体积/h的速度，用pH=8的焦磷酸钠缓冲液淋洗XAD-8树脂柱，每收集2-50ml流出液，用特定波长紫外/可见光进行测定，流出液的紫外/可见吸光值先增大后减小，当流出液紫外/可见吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=8的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH=1，搅拌4h后，静置24h，离心得到固体，标记为腐殖酸pH8；
氮气保护下，以10柱体积/h的速度，用pH=9的焦磷酸钠缓冲液淋洗XAD-8树脂柱，每收集2-50ml流出液，用特定波长紫外/可见光进行测定，流出液的紫外/可见吸光值先增大后减小，当流出液紫外/可见吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=9的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH=1，搅拌4h后，静置24h，离心得到固体，标记为腐殖酸pH9；
氮气保护下，以10柱体积/h的速度，用pH=10的焦磷酸钠缓冲液淋洗XAD-8树脂柱，每收集2-50ml流出液，用特定波长紫外/可见光进行测定，流出液的紫外/可见吸光值先增大后减小，当流出液紫外/可见吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=10的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH=1，搅拌4h后，静置24h，离心得到固体，标记为腐殖酸pH10；
氮气保护下，以10柱体积/h的速度，用pH=11的焦磷酸钠缓冲液淋洗XAD-8树脂柱，每收集2-50ml流出液，用特定波长紫外/可见光进行测定，流出液的紫外/可见吸光值先增大后减小，当流出液紫外/可见吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=11的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH=1，搅拌4h后，静置24h，离心得到固体，标记为腐殖酸pH11；
氮气保护下，以10柱体积/h的速度，用pH=12的焦磷酸钠缓冲液淋洗XAD-8树脂柱，每收集2-50ml流出液，用特定波长紫外/可见光进行测定，流出液的紫外/可见吸光值先增大后减小，当流出液紫外/可见吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=12的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH=1，搅拌4h后，静置24h，离心得到固体，标记为腐殖酸pH12；
氮气保护下，以10柱体积/h的速度，用pH=13的焦磷酸钠缓冲液淋洗XAD-8树脂柱，每收集2-50ml流出液，用特定波长紫外/可见光进行测定，流出液的紫外/可见吸光值先增大后减小，当流出液紫外/可见吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=13的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH=1，搅拌4h后，静置24h，离心得到固体，标记为腐殖酸pH13；
步骤g、土壤腐殖酸除盐及固化：在氮气保护下，用0.1-0.3mol/L的氢氧化钠分别溶解腐殖酸pH3-腐殖酸pH13，使每份溶液固液体积比均为1:2，用浓盐酸分别调节溶液pH=4-9，共计得到11份腐殖酸亚组分溶液；
将11份腐殖酸亚组分溶液分别置入11个截留分子量为10000道尔顿透析袋，并将每个透析袋置于超纯水中，组成透析体系，搅拌24h，盐分通过透析袋进入超纯水，将每个透析袋中的腐殖酸亚组分溶液冷冻干燥得到11份腐殖酸亚组分，命名为腐殖酸亚组分pH3-pH13。
优选的，所述分级提取方法中，所述步骤e中所得上层清液用溶解有机碳测定仪器测定其溶解有机碳含量，如果上清液中溶解有机碳TOC>5mg/L，则重复步骤e，直到TOC<5mg/L后，再进行步骤f。
优选的，所述步骤g中透析体系搅拌20—40h后，用钼酸铵分光光度法和硝酸银法测定g中透析袋外溶液的磷含量和氯离子含量，如果总磷含量>0.01mg/L或者有氯化银存在,则多次更换透析体系中的超纯水，每次加入去离子水，搅拌20—40h后，再次测定，直到磷含量<0.01mg/L且检测不到氯离子。本发明中所述的钼酸铵分光光度法可采用GB11893-89中规定的方法。
优选的，所述分级提取方法还包括步骤h：在80-100℃下烘干20-40h后，在550℃下灼烧5-10h，测定步骤g所得的11份腐殖酸亚组分腐殖酸pH3-pH13的灰分；
如果某腐殖酸亚组分以干重计灰分大于1.0%，则将该腐殖酸亚组分在氮气保护条件下，在容器中，用氢氧化钠溶解，加入去离子水使溶液腐殖酸浓度=1—3g/L后，调节pH=3-9；加入浓盐酸、浓氢氟酸和去离子水，使其固液比为1:10且盐酸浓度为0.1mol/L，氢氟酸浓度为0.3mol/L，持续搅拌20-28h，离心分离得固体后重复操作步骤g。优选的，容器可采用塑料容器。
本发明中步骤b完成对土壤的酸洗，去除了酸溶性钙镁离子，减少了钙镁离子对焦磷酸钠和氢氧化钠提取过程的影响，增加了腐殖酸的暴露；
步骤c再连续用焦磷酸钠和氢氧化钠提取腐殖酸和富里酸亚组分，将钙、镁、铝、铁等结合的腐殖酸与富里酸亚组分溶出；
步骤d使用高速离心法和氢氟酸去除硅酸盐。步骤e利用pH=1.0条件下，富里酸溶解而腐殖酸沉淀的特点，用酸洗腐殖酸方法，去除富里酸；
步骤f利用不同腐殖酸组分在XAD-8树脂上的吸附差异，进行亚组分分级；
步骤g为腐殖酸亚组分的除盐分和固化过程。
本发明中步骤b中，利用在pH=1.0的条件下，腐殖酸为固态，部分杂质（如富里酸、钙镁离子）等杂质可溶等特点，对土壤和腐殖酸进行酸洗，具有以下优点：1）pH=1.0时，腐殖酸为沉淀，土壤酸洗过程中不会损失土壤中腐殖酸；2）pH=1.0时，富里酸可溶，去除部分酸溶性富里酸；3）pH=1.0条件下，能够去除酸溶性钙镁离子，减少了钙镁对焦磷酸钠和氢氧化钠的干扰；4）盐酸与土壤矿物中的铁、铝、锰反应，减少自由态和酸溶性铁、铝、锰离子浓度，降低铁、铝、锰对焦磷酸钠和氢氧化钠提取过程的影响；5）酸洗后，部分腐殖酸进一步暴露出来。
本发明中步骤c利用焦磷酸钠和氢氧化钠提取土壤中腐殖酸。由于在此之前，溶液中加入的有盐酸（土壤酸洗），自由态和酸溶态金属离子已经去除，在酸性条件下土壤中的腐殖酸亚组分进一步暴露，故焦磷酸钠主要与有机质结合态钙、镁、铁、铝等反应，涉及主要反应有：
2[R(COO)]2Ca+Na4P2O7→R(COONa)4+Ca2P2O7(沉淀)
4[R(COO)]3Fe+3Na4P2O7→3R(COONa)4+Fe4(P2O7)3(沉淀)
4[R(COO)]3Al+3Na4P2O7→3R(COONa)4+Al4(P2O7)3(沉淀)
由于土壤酸洗过程除去部分钙、镁、铁、铝，加入焦磷酸钠后产生的沉淀焦磷酸钙、焦磷酸铁、焦磷酸铝等不会将富里酸亚组分包裹起来，从而利于腐殖酸亚组分的提取。
R(COOH)+NaOHA(COONa)+H2O
土壤酸洗过程除去部分钙、镁、铁、铝，加入焦磷酸钠后产生的沉淀氢氧化钙、氢氧化铁、氢氧化铝等不会将腐殖酸包裹起来，从而利于腐殖酸的提取。
本发明步骤d中将用含有0.1mol/L氢氧化钠和0.3mol/L氯化钠的溶液溶解腐殖酸后，高速离心分离，是为了去除碱不溶的腐殖酸杂质；
本发明步骤d中加入氢氟酸的操作是：利用氢氟酸和硅酸盐及硅单质反应，生产四氟合硅气体，从而去除富里酸亚组分样品中的含硅杂质。
本发明的有益效果是：本发明土壤中腐殖酸的分级提取方法能够克服现有技术对腐殖酸分级提取过程的不足，获得纯度较高的腐殖酸各级亚组分，便于对土壤的研究。
具体实施方式
下面对本发明的较佳实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。
实施例1：北京郊区森林土壤中富里酸的提取：
于2013年6月份取北京郊区森林土壤样品，土壤中含有大量植物根茎，石子、和土壤微生物等；
XAD-8树脂柱；Sigma公司；
氢氧化钠：分析纯；盐酸：分析纯；
本实施例的具体提取步骤如下：
一种土壤中腐殖酸的分级提取方法，所述分级提取方法包括如下步骤：
步骤a、土壤预处理：称取天然土壤，剔除树根和石子等杂物，风干碾磨后过2.0mm的筛，得到土壤样品；
步骤b、土壤酸洗：向10000g土壤样品中加入去离子水50L，使固液比达到1：5，用6mol/L氢氧化钠和盐酸调节其pH=1.0，得到固液混合物，向该固液混合物中加0.1mol/L的盐酸溶液，使其固液比为1:10，连续搅拌4h，静置24h后，离心后弃去上清液，得到酸洗土壤样品；
步骤c、提取土壤中腐殖酸：向酸洗土壤样品中加入去离子水30L，使其固液比为1:3，用6mol/L氢氧化钠和盐酸调节溶液pH=7，得到固液混合物，氮气保护条件下，向该固液混合物中加入0.2mol/L焦磷酸钠溶液50L，并用去离子水稀释，使焦磷酸钠浓度为0.1mol/L且固液比为1:10，持续搅拌4h，静置24h后，离心得到100L上清液1和土壤样品1；
氮气保护条件下，向上清液1中加入6mol/L盐酸，使其pH=1.0，搅拌30min，静置24后，离心得固体，标记为腐殖酸1，湿重157g；
向步骤b中的土壤样品1中加入30L去离子水，使其固液比为1：3，用6mol/L氢氧化钠和盐酸调节其pH=7，得到固液混合物，氮气保护条件下，向该固液混合物中加入0.2mol/L氢氧化钠溶液，并用去离子水稀释，使氢氧化钠浓度为0.1mol/L且固液比为1:10，搅拌4h，静置24h后，离心得到上清液2和土壤残渣；
氮气保护条件下，向上清液2中加入6mol/L盐酸，使其pH=1.0，搅拌30min，静置24h后，离心得固体，标记为腐殖酸2，湿重239g；；
步骤d、腐殖酸除硅：将腐殖酸1和腐殖酸2合并，氮气保护条件下，用含有0.1mol/L氢氧化钠和0.3mol/L氯化钠的溶液溶解，高速离心分离，得到上层清液；将该上层清液用2mol/L盐酸酸化至pH=1.0，搅拌30min，静置24h，离心得固体，标记为腐殖酸3，湿重395g；
在塑料容器中，向腐殖酸3中加入含有用含有0.1mol/L盐酸和0.3mol/L氢氟酸的溶液，使其固液比为1:10，持续搅拌24h，离心分离得固体标记为无硅腐殖酸，湿重395g；
步骤e、腐殖酸除杂酸：向无硅腐殖酸中加入0.1mol/L盐酸溶液，使其固液比为1:10，持续搅拌4h，并静置24h后，离心得到上层清液及纯化腐殖酸，湿重394g；
步骤f、土壤腐殖酸的亚组分分级：在氮气保护条件下，用0.1mol/L氢氧化钠将步骤e中的纯化腐殖酸溶解，加入去离子水使溶液体积为100L，用盐酸和氢氧化钠调节溶液pH=2.0后，以10柱体积/h的速度流过XAD-8树脂柱，流出液弃去；
以10柱体积/h的速度，用pH=3的焦磷酸钠缓冲液淋洗XAD-8树脂柱，每收集50ml流出液，在650nm处测定流出液吸光值，流出液的紫外/可见吸光值先增大后减小，当流出液紫外/可见吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=3的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液共计，立即酸化至pH=1，搅拌4h后，静置24h，离心得到固体，标记为腐殖酸pH3；
以10柱体积/h的速度，用pH=4的焦磷酸钠缓冲液淋洗XAD-8树脂柱，每收集2-50ml流出液，在650nm处测定流出液吸光值，流出液的紫外/可见吸光值先增大后减小，当流出液紫外/可见吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=4的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH=1，搅拌4h后，静置24h，离心得到固体，标记为腐殖酸pH4；
以10柱体积/h的速度，用pH=5的焦磷酸钠缓冲液淋洗XAD-8树脂柱，每收集2-50ml流出液，在650nm处测定流出液吸光值，流出液的紫外/可见吸光值先增大后减小，当流出液紫外/可见吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=5的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH=1，搅拌4h后，静置24h，离心得到固体，标记为腐殖酸pH5；
以10柱体积/h的速度，用pH=6的焦磷酸钠缓冲液淋洗XAD-8树脂柱，每收集2-50ml流出液，在650nm处测定流出液吸光值，流出液的紫外/可见吸光值先增大后减小，当流出液紫外/可见吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=6的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH=1，搅拌4h后，静置24h，离心得到固体，标记为腐殖酸pH6；
氮气保护下，以10柱体积/h的速度，用pH=7的焦磷酸钠缓冲液淋洗XAD-8树脂柱，每收集2-50ml流出液，在650nm处测定流出液吸光值，流出液的紫外/可见吸光值先增大后减小，当流出液紫外/可见吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=7的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH1，搅拌4h后，静置24h，离心得到固体，标记为腐殖酸pH7；
氮气保护下，以10柱体积/h的速度，用pH=8的焦磷酸钠缓冲液淋洗XAD-8树脂柱，每收集2-50ml流出液，在650nm处测定流出液吸光值，流出液的紫外/可见吸光值先增大后减小，当流出液紫外/可见吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=8的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH1，搅拌4h后，静置24h，离心得到固体，标记为腐殖酸pH8；
氮气保护下，以10柱体积/h的速度，用pH=9的焦磷酸钠缓冲液淋洗XAD-8树脂柱，每收集2-50ml流出液，在650nm处测定流出液吸光值，流出液的紫外/可见吸光值先增大后减小，当流出液紫外/可见吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=9的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH=1，搅拌4h后，静置24h，离心得到固体，标记为腐殖酸pH9；
氮气保护下，以10柱体积/h的速度，用pH=10的焦磷酸钠缓冲液淋洗XAD-8树脂柱，每收集2-50ml流出液，在650nm处测定流出液吸光值，流出液的紫外/可见吸光值先增大后减小，当流出液紫外/可见吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=10的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH=1，搅拌4h后，静置24h，离心得到固体，标记为腐殖酸pH10；
氮气保护下，以10柱体积/h的速度，用pH=11的焦磷酸钠缓冲液淋洗XAD-8树脂柱，每收集2-50ml流出液，在650nm处测定流出液吸光值，流出液的紫外/可见吸光值先增大后减小，当流出液紫外/可见吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=11的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH=1，搅拌4h后，静置24h，离心得到固体，标记为腐殖酸pH11；
氮气保护下，以10柱体积/h的速度，用pH=12的焦磷酸钠缓冲液淋洗XAD-8树脂柱，每收集2-50ml流出液，在650nm处测定流出液吸光值，流出液的紫外/可见吸光值先增大后减小，当流出液紫外/可见吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=12的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH=1，搅拌4h后，静置24h，离心得到固体，标记为腐殖酸pH12；
氮气保护下，以10柱体积/h的速度，用pH=13的焦磷酸钠缓冲液淋洗XAD-8树脂柱，每收集2-50ml流出液，在650nm处测定流出液吸光值，流出液的紫外/可见吸光值先增大后减小，当流出液紫外/可见吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=13的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH=1，搅拌4h后，静置24h，离心得到固体，标记为腐殖酸pH13；
步骤g、土壤腐殖酸除盐及固化：
在氮气保护下，用0.1mol/L的氢氧化钠分别溶解腐殖酸pH3-腐殖酸pH13，使其固液体积比为1:2，用浓盐酸调节其pH=4-9，共计得到11份腐殖酸亚组分溶液；
将11份腐殖酸亚组分溶液分别置入11个截留分子量为10000道尔顿透析袋，并将每个透析袋置于超纯水中，组成透析体系，搅拌24h，盐分通过透析袋进入超纯水，将每个透析袋中的腐殖酸亚组分溶液冷冻干燥得到11份腐殖酸亚组分，命名为腐殖酸亚组分pH3-腐殖酸pH13。本实施例中，所述分级提取方法还包括步骤h：在80-100℃下烘干20-40h后，测定步骤g所得的11份腐殖酸亚组分pH3-pH13的灰分；
如果其中某份腐殖酸亚组分以干重计灰分大于1.0%，则将该腐殖酸亚组分在氮气保护条件下，在容器中，用氢氧化钠溶解，加入去离子水使溶液腐殖酸浓度=1—3g/L后，调节pH=3-9，再加入浓盐酸、浓氢氟酸和去离子水，使固液比为1:10且盐酸浓度为0.1mol/L，氢氟酸浓度为0.3mol/L，持续搅拌20-28h，离心分离得固体后重复操作步骤g。
本实施例中，步骤e中所得上层清液用溶解有机碳测定仪器测定其溶解有机碳含量，如果上清液中溶解有机碳TOC>5mg/L，则重复步骤e，直到TOC<5mg/L后，再进行步骤f；步骤g中透析体系搅拌20—40h后，用钼酸铵分光光度法和硝酸银法分别测定步骤g中透析袋外溶液的磷含量和氯离子含量，如果磷含量>0.01mg/L或者有氯化银存在，则多次更换透析体系中的超纯水，每次加入去离子水，搅拌20—40h后，再次测定，直到总磷含量<0.01mg/L且检测不到氯离子。
本实施例中，最终得到土壤腐殖酸pH3亚组分83.5g、腐殖酸pH4亚组分62.4g、腐殖酸pH5亚组分28.5g、腐殖酸pH6亚组分15.5g、腐殖酸pH7亚组分5.7g、腐殖酸pH8亚组分4.8g、腐殖酸pH9亚组分3.9g、腐殖酸pH10亚组分0.58g、腐殖酸pH11亚组分0.35g、腐殖酸pH12亚组分0.14g、腐殖酸pH13亚组分0.09g。
结合腐殖酸自身特点，利用元素分析法和13C-NMR光谱分析法对腐殖酸亚组分进行定量-半定量分析；利用FTIR、UV-Vis和三维荧光光谱对腐殖酸亚组分进行定性分析，结果如下：
元素分析结果显示，该方法提取的土壤腐殖酸亚组分中碳、氢、氧、硫元素含量及碳氢元素比、碳氧元素比，符合国际腐殖酸协会标准腐殖酸元素含量要求。FTIR光谱分析显示，该方法提取的土壤腐殖酸亚组分均包含羟基、烷基和羧基等官能团，这与国际腐殖酸协会标准腐殖酸红外光谱结论一致。UV-Vis光谱分析显示，该方法提取的土壤腐殖酸亚组分紫外吸光度均随着紫外波长增大而降低，紫外光谱符合指数递减规律，这与国际腐殖酸协会标准腐殖酸紫外光谱结论一致。13C-NMR光谱分析显示，该方法提取的土壤腐殖酸亚组分均包含饱和脂肪碳峰、烷氧基碳、芳香碳、羧基碳，这与国际腐殖酸协会标准腐殖酸一致。三维荧光光谱分析显示，该方法提取的土壤腐殖酸亚组分的三维荧光光谱峰均坐落于土壤类腐殖酸荧光峰范围，与国际腐殖酸协会标准腐殖酸一致。
进一步分析表明：该方法提取的不同腐殖酸亚组分中的氢碳元素比存在明显变化，腐殖酸亚组分pH3-腐殖酸亚组分pH13的氢碳元素比分别为1.04、0.99、0.94、0.90、0.87、0.74、0.70、0.68、0.69、0.66、0.64；
13C-NMR光谱分析结果显示，该方法提取的不同腐殖酸亚组分中的羧基碳比例存在明显变化，腐殖酸亚组分pH3-腐殖酸pH13的羧基碳比例为20.8、19.9、19.5、18.9、15.1、14.1、13.7、13.1、12.0、12.1、11.3；
该方法提取的不同腐殖酸亚组分中的芳香碳含量存在明显变化，腐殖酸亚组分pH3--腐殖酸pH13的芳香碳比例为32.3、35.2、38.9、36.1、32.7、40.9、42.1、40.8、31.9、32.5、32.5。
实施例2：本实施例公开了一种土壤中腐殖酸的分级提取方法，具体包括如下步骤：
步骤a、土壤预处理：称取天然土壤，剔除树根和石子等杂物，风干碾磨后过2.0mm的筛，得到土壤样品；
步骤b、土壤酸洗：向土壤样品中加入去离子水，使固液比达到（1-3）：（5-8），用氢氧化钠和盐酸调节其pH=1.0-3.0，得到固液混合物，向该固液混合物中加0.1mol/L的盐酸溶液，使其固液比为1:10，连续搅拌4-8h，静置20-28h后，离心后弃去上清液，得到酸洗土壤样品；
步骤c、提取土壤中腐殖酸：向酸洗土壤样品中加入去离子水，使其固液比为（1-3）:（10-12），用盐酸和氢氧化钠调节溶液pH=7，得到固液混合物，氮气保护条件下，向该固液混合物中加入焦磷酸钠溶液，并用去离子水稀释，使焦磷酸钠浓度为0.1-0.2mol/L且固液比为1:10，持续搅拌4-8h，静置20-28h后，离心得到上清液1和土壤样品1；
氮气保护条件下，向上清液1中加入6mol/L盐酸，使其pH=1.0-3.0，搅拌15-30min，静置24-28后，离心得固体，标记为腐殖酸1；
向步骤b中的土壤样品1中加入去离子水，使其固液比为（1-3）：（5-8），用盐酸和氢氧化钠调节其pH=7，得到固液混合物，氮气保护条件下，向该固液混合物中加入氢氧化钠溶液，并用去离子水稀释，使氢氧化钠浓度为0.1-0.3mol/L且固液比为1:10，搅拌4-8h，静置20-28h后，离心得到上清液2和土壤残渣；
氮气保护条件下，向上清液2中加入6mol/L盐酸，使其pH=1.0-3.0，搅拌30min，静置20-28h后，离心得固体，标记为腐殖酸2；
步骤d、腐殖酸除硅：将腐殖酸1和腐殖酸2合并，氮气保护条件下，用含有0.1-0.3mol/L氢氧化钠和0.2-0.4mol/L氯化钠的溶液溶解，高速离心分离，得到上层清液；将该上层清液用盐酸酸化，使其pH=1.0-3.0，搅拌15-30min，静置20-28h，离心得固体，标记为腐殖酸3；
在容器中，向腐殖酸3中加入含有0.1-0.3mol/L盐酸和0.2-0.4mol/L氢氟酸的溶液，使其固液比为1:10，持续搅拌20-28h，离心分离得固体标记为无硅腐殖酸；
步骤e、土壤腐殖酸除杂酸：向无硅腐殖酸中加入0.1mol/L盐酸溶液，使其固液比为（1-3）:（10-12），持续搅拌4-8h，并静置20-28h后，离心得到上层清液及纯化腐殖酸；
步骤f、土壤腐殖酸的亚组分分级：：在氮气保护条件下，用氢氧化钠将步骤e中的纯化腐殖酸溶解，加入去离子水使溶液中腐殖酸浓度在1-3g/L，用盐酸和氢氧化钠调节溶液pH=1-3后，以10倍柱体积/h的速度流过XAD-8树脂柱，流出液弃去；
以5-10柱体积/h的速度，用pH=3的焦磷酸钠缓冲液淋洗XAD-8树脂柱，每收集2-50ml流出液，用特定波长紫外/可见光进行测定，流出液的紫外/可见吸光值先增大后减小，当流出液紫外/可见吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=3的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH=1，搅拌4h后，静置24h，离心得到固体，标记为腐殖酸pH3；
以5-10柱体积/h的速度，用pH=4的焦磷酸钠缓冲液淋洗XAD-8树脂柱，每收集2-50ml流出液，用特定波长紫外/可见光进行测定，流出液的紫外/可见吸光值先增大后减小，当流出液紫外/可见吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=4的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH=1，搅拌4h后，静置24h，离心得到固体，标记为腐殖酸pH4；
以5-10柱体积/h的速度，用pH=5的焦磷酸钠缓冲液淋洗XAD-8树脂柱，每收集2-50ml流出液，用特定波长紫外/可见光进行测定，流出液的紫外/可见吸光值先增大后减小，当流出液紫外/可见吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=5的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH=1，搅拌4h后，静置24h，离心得到固体，标记为腐殖酸pH5；
以5-10柱体积/h的速度，用pH=6的焦磷酸钠缓冲液淋洗XAD-8树脂柱，每收集2-50ml流出液，用特定波长紫外/可见光进行测定，流出液的紫外/可见吸光值先增大后减小，当流出液紫外/可见吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=6的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH=1，搅拌4h后，静置24h，离心得到固体，标记为腐殖酸pH6；
以5-10柱体积/h的速度，用pH=7的焦磷酸钠缓冲液淋洗XAD-8树脂柱，每收集2-50ml流出液，用特定波长紫外/可见光进行测定，流出液的紫外/可见吸光值先增大后减小，当流出液紫外/可见吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=7的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH=1，搅拌4h后，静置24h，离心得到固体，标记为腐殖酸pH7；
氮气保护下，以5-10柱体积/h的速度，用pH=8的焦磷酸钠缓冲液淋洗XAD-8树脂柱，每收集2-50ml流出液，用特定波长紫外/可见光进行测定，流出液的紫外/可见吸光值先增大后减小，当流出液紫外/可见吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=8的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH=1，搅拌4h后，静置24h，离心得到固体，标记为腐殖酸pH8；
氮气保护下，以5-10柱体积/h的速度，用pH=9的焦磷酸钠缓冲液淋洗XAD-8树脂柱，每收集2-50ml流出液，用特定波长紫外/可见光进行测定，流出液的紫外/可见吸光值先增大后减小，当流出液紫外/可见吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=9的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH=1，搅拌4h后，静置24h，离心得到固体，标记为腐殖酸pH9；
氮气保护下，以5-10柱体积/h的速度，用pH=10的焦磷酸钠缓冲液淋洗XAD-8树脂柱，每收集2-50ml流出液，用特定波长紫外/可见光进行测定，流出液的紫外/可见吸光值先增大后减小，当流出液紫外/可见吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=10的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH1，搅拌4h后，静置24h，离心得到固体，标记为腐殖酸pH10；
氮气保护下，以10柱体积/h的速度，用pH=11的焦磷酸钠缓冲液淋洗XAD-8树脂柱，每收集2-50ml流出液，用特定波长紫外/可见光进行测定，流出液的紫外/可见吸光值先增大后减小，当流出液紫外/可见吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=11的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH1，搅拌4h后，静置24h，离心得到固体，标记为腐殖酸pH11；
氮气保护下，以10柱体积/h的速度，用pH=12的焦磷酸钠缓冲液淋洗XAD-8树脂柱，每收集2-50ml流出液，用特定波长紫外/可见光进行测定，流出液的紫外/可见吸光值先增大后减小，当流出液紫外/可见吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=12的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH1，搅拌4h后，静置24h，离心得到固体，标记为腐殖酸pH12；
氮气保护下，以10柱体积/h的速度，用pH=13的焦磷酸钠缓冲液淋洗XAD-8树脂柱，每收集2-50ml流出液，用特定波长紫外/可见光进行测定，流出液的紫外/可见吸光值先增大后减小，当流出液紫外/可见吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=13的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH1，搅拌4h后，静置24h，离心得到固体，标记为腐殖酸pH13；
步骤g、土壤腐殖酸除盐及固化：在氮气保护下，用0.1-0.3mol/L的氢氧化钠分别溶解腐殖酸pH3-腐殖酸pH13，使每份溶液固液体积比均为1:2，用浓盐酸分别调节溶液pH=4-9，共计得到11份腐殖酸亚组分溶液；
将11份腐殖酸亚组分溶液分别置入11个截留分子量为10000道尔顿透析袋，并将每个透析袋置于超纯水中，组成透析体系，搅拌24h，盐分通过透析袋进入超纯水，将每个透析袋中的腐殖酸亚组分溶液冷冻干燥得到11份腐殖酸亚组分，命名为腐殖酸亚组分pH3-13。
实施例3：本实施例公开了一种土壤中腐殖酸的分级提取方法，具体包括如下步骤：
步骤a、土壤预处理：称取天然土壤，剔除树根和石子等杂物，风干碾磨后过2.0mm的筛，得到土壤样品；
步骤b、土壤酸洗：向土壤样品中加入去离子水，使固液比达到3：8，用氢氧化钠和盐酸调节其pH=3.0，得到固液混合物，向该固液混合物中加0.1mol/L的盐酸溶液，使其固液比为1:10，连续搅拌8h，静置28h后，离心后弃去上清液，得到酸洗土壤样品；
步骤c、提取土壤中腐殖酸：向酸洗土壤样品中加入去离子水，使其固液比为1：12，用盐酸和氢氧化钠调节溶液pH=7，得到固液混合物，氮气保护条件下，向该固液混合物中加入焦磷酸钠溶液，并用去离子水稀释，使焦磷酸钠浓度为0.2mol/L且固液比为1:10，持续搅拌8h，静置28h后，离心得到上清液1和土壤样品1；
氮气保护条件下，向上清液1中加入6mol/L盐酸，使其pH=3.0，搅拌15min，静置28后，离心得固体，标记为腐殖酸1；
向步骤b中的土壤样品1中加入去离子水，使其固液比为3：8，用盐酸和氢氧化钠调节其pH=7，得到固液混合物，氮气保护条件下，向该固液混合物中加入氢氧化钠溶液，并用去离子水稀释，使氢氧化钠浓度为0.3mol/L且固液比为1:10，搅拌8h，静置28h后，离心得到上清液2和土壤残渣；
氮气保护条件下，向上清液2中加入6mol/L盐酸，使其pH=3.0，搅拌30min，静置28h后，离心得固体，标记为腐殖酸2；
步骤d、腐殖酸除硅：将腐殖酸1和腐殖酸2合并，氮气保护条件下，用含有0.3mol/L氢氧化钠和0.2mol/L氯化钠的溶液溶解，高速离心分离，得到上层清液；将该上层清液用盐酸酸化，使其pH=3.0，搅拌15min，静置28h，离心得固体，标记为腐殖酸3；
在容器中，向腐殖酸3中加入含有0.3mol/L盐酸和0.4mol/L氢氟酸的溶液，使其固液比为1:10，持续搅拌20h，离心分离得固体标记为无硅腐殖酸；
步骤e、土壤腐殖酸除杂酸：向无硅腐殖酸中加入0.1mol/L盐酸溶液，使其固液比为3：12，持续搅拌8h，并静置28h后，离心得到上层清液及纯化腐殖酸；
步骤f、土壤腐殖酸的亚组分分级：：在氮气保护条件下，用氢氧化钠将步骤e中的纯化腐殖酸溶解，加入去离子水使溶液中腐殖酸浓度在3g/L，用盐酸和氢氧化钠调节溶液pH=3后，以10倍柱体积/h的速度流过XAD-8树脂柱，流出液弃去；
以5-10柱体积/h的速度，用pH=3的焦磷酸钠缓冲液淋洗XAD-8树脂柱，每收集2-50ml流出液，用特定波长紫外/可见光进行测定，流出液的紫外/可见吸光值先增大后减小，当流出液紫外/可见吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=3的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH=1，搅拌4h后，静置24h，离心得到固体，标记为腐殖酸pH3；
以5-10柱体积/h的速度，用pH=4的焦磷酸钠缓冲液淋洗XAD-8树脂柱，每收集2-50ml流出液，用特定波长紫外/可见光进行测定，流出液的紫外/可见吸光值先增大后减小，当流出液紫外/可见吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=4的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH=1，搅拌4h后，静置24h，离心得到固体，标记为腐殖酸pH4；
以5-10柱体积/h的速度，用pH=5的焦磷酸钠缓冲液淋洗XAD-8树脂柱，每收集2-50ml流出液，用特定波长紫外/可见光进行测定，流出液的紫外/可见吸光值先增大后减小，当流出液紫外/可见吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=5的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH=1，搅拌4h后，静置24h，离心得到固体，标记为腐殖酸pH5；
以5-10柱体积/h的速度，用pH=6的焦磷酸钠缓冲液淋洗XAD-8树脂柱，每收集2-50ml流出液，用特定波长紫外/可见光进行测定，流出液的紫外/可见吸光值先增大后减小，当流出液紫外/可见吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=6的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH=1，搅拌4h后，静置24h，离心得到固体，标记为腐殖酸pH6；
以5-10柱体积/h的速度，用pH=7的焦磷酸钠缓冲液淋洗XAD-8树脂柱，每收集2-50ml流出液，用特定波长紫外/可见光进行测定，流出液的紫外/可见吸光值先增大后减小，当流出液紫外/可见吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=7的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH=1，搅拌4h后，静置24h，离心得到固体，标记为腐殖酸pH7；
氮气保护下，以5-10柱体积/h的速度，用pH=8的焦磷酸钠缓冲液淋洗XAD-8树脂柱，每收集2-50ml流出液，用特定波长紫外/可见光进行测定，流出液的紫外/可见吸光值先增大后减小，当流出液紫外/可见吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=8的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH=1，搅拌4h后，静置24h，离心得到固体，标记为腐殖酸pH8；
氮气保护下，以5-10柱体积/h的速度，用pH=9的焦磷酸钠缓冲液淋洗XAD-8树脂柱，每收集2-50ml流出液，用特定波长紫外/可见光进行测定，流出液的紫外/可见吸光值先增大后减小，当流出液紫外/可见吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=9的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH=1，搅拌4h后，静置24h，离心得到固体，标记为腐殖酸pH9；
氮气保护下，以5-10柱体积/h的速度，用pH=10的焦磷酸钠缓冲液淋洗XAD-8树脂柱，每收集2-50ml流出液，用特定波长紫外/可见光进行测定，流出液的紫外/可见吸光值先增大后减小，当流出液紫外/可见吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=10的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH=1，搅拌4h后，静置24h，离心得到固体，标记为腐殖酸pH10；
氮气保护下，以10柱体积/h的速度，用pH=11的焦磷酸钠缓冲液淋洗XAD-8树脂柱，每收集2-50ml流出液，用特定波长紫外/可见光进行测定，流出液的紫外/可见吸光值先增大后减小，当流出液紫外/可见吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=11的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH=1，搅拌4h后，静置24h，离心得到固体，标记为腐殖酸pH11；
氮气保护下，以10柱体积/h的速度，用pH=12的焦磷酸钠缓冲液淋洗XAD-8树脂柱，每收集2-50ml流出液，用特定波长紫外/可见光进行测定，流出液的紫外/可见吸光值先增大后减小，当流出液紫外/可见吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=12的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH=1，搅拌4h后，静置24h，离心得到固体，标记为腐殖酸pH12；
氮气保护下，以10柱体积/h的速度，用pH=13的焦磷酸钠缓冲液淋洗XAD-8树脂柱，每收集2-50ml流出液，用特定波长紫外/可见光进行测定，流出液的紫外/可见吸光值先增大后减小，当流出液紫外/可见吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=13的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH=1，搅拌4h后，静置24h，离心得到固体，标记为腐殖酸pH13；
步骤g、土壤腐殖酸除盐及固化：在氮气保护下，用0.1-0.3mol/L的氢氧化钠分别溶解腐殖酸pH3-腐殖酸pH13，使每份溶液固液体积比均为1:2，用浓盐酸分别调节溶液pH=4-9，共计得到11份腐殖酸亚组分溶液；
将11份腐殖酸亚组分溶液分别置入11个截留分子量为10000道尔顿透析袋，并将每个透析袋置于超纯水中，组成透析体系，搅拌24h，盐分通过透析袋进入超纯水，将每个透析袋中的腐殖酸亚组分溶液冷冻干燥得到11份腐殖酸亚组分，命名为腐殖酸亚组分pH3-13。
实施例4：本实施例中公开了一种土壤中腐殖酸的分级提取方法，所述分级提取方法包括如下步骤：
步骤a、土壤预处理：称取天然土壤，剔除树根和石子等杂物，风干碾磨后过2.0mm的筛，得到土壤样品；
步骤b、土壤酸洗：向土壤样品中加入去离子水，使固液比达到1：5，用氢氧化钠和盐酸调节其pH=1.0，得到固液混合物，向该固液混合物中加0.1mol/L的盐酸溶液，使其固液比为1:10，连续搅拌4h，静置24h后，离心后弃去上清液，得到酸洗土壤样品；
步骤c、提取土壤中腐殖酸：向酸洗土壤样品中加入去离子水，使其固液比为1:3，用盐酸和氢氧化钠调节溶液pH=7，得到固液混合物，氮气保护条件下，向该固液混合物中加入焦磷酸钠溶液，并用去离子水稀释，使焦磷酸钠浓度为0.1mol/L且固液比为1:10，持续搅拌4h，静置24h后，离心得到上清液1和土壤样品1；
氮气保护条件下，向上清液1中加入6mol/L盐酸，使其pH=1.0，搅拌30min，静置24后，离心得固体，标记为腐殖酸1；
向步骤b中的土壤样品1中加入去离子水，使其固液比为1：3，用盐酸和氢氧化钠调节其pH=7，得到固液混合物，氮气保护条件下，向该固液混合物中加入氢氧化钠溶液，并用去离子水稀释，使氢氧化钠浓度为0.1mol/L且固液比为1:10，搅拌4h，静置24h后，离心得到上清液2和土壤残渣；
氮气保护条件下，向上清液2中加入6mol/L盐酸，使其pH=1.0，搅拌30min，静置24h后，离心得固体，标记为腐殖酸2；
步骤d、腐殖酸除硅：将腐殖酸1和腐殖酸2合并，氮气保护条件下，用含有0.1mol/L氢氧化钠和0.3mol/L氯化钠的溶液溶解，高速离心分离，得到上层清液；将该上层清液用盐酸酸化，使其pH=1.0，搅拌30min，静置24h，离心得固体，标记为腐殖酸3；
在容器中，向腐殖酸3中加入含有用含有0.1mol/L盐酸和0.3mol/L氢氟酸的溶液，使其固液比为1:10，持续搅拌24h，离心分离得固体标记为无硅腐殖酸；
步骤e、土壤腐殖酸除杂酸：向无硅腐殖酸中加入0.1mol/L盐酸溶液，使其固液比为1:10，持续搅拌4h，并静置24h后，离心得到上层清液及纯化腐殖酸；
步骤f、土壤腐殖酸的亚组分分级：：在氮气保护条件下，用氢氧化钠将步骤e中的纯化腐殖酸溶解，加入去离子水使溶液中腐殖酸浓度在1-3g/L，用盐酸和氢氧化钠调节溶液pH值=2后，以10倍柱体积/h的速度流过XAD-8树脂柱，流出液弃去；
以10柱体积/h的速度，用pH=3的焦磷酸钠缓冲液淋洗XAD-8树脂柱，每收集2-50ml流出液，用特定波长紫外/可见光进行测定，流出液的紫外/可见吸光值先增大后减小，当流出液紫外/可见吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=3的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH=1，搅拌4h后，静置24h，离心得到固体，标记为腐殖酸pH3；
以10柱体积/h的速度，用pH=4的焦磷酸钠缓冲液淋洗XAD-8树脂柱，每收集2-50ml流出液，用特定波长紫外/可见光进行测定，流出液的紫外/可见吸光值先增大后减小，当流出液紫外/可见吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=4的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH=1，搅拌4h后，静置24h，离心得到固体，标记为腐殖酸pH4；
以10柱体积/h的速度，用pH=5的焦磷酸钠缓冲液淋洗XAD-8树脂柱，每收集2-50ml流出液，用特定波长紫外/可见光进行测定，流出液的紫外/可见吸光值先增大后减小，当流出液紫外/可见吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=5的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH=1，搅拌4h后，静置24h，离心得到固体，标记为腐殖酸pH5；
以10柱体积/h的速度，用pH=6的焦磷酸钠缓冲液淋洗XAD-8树脂柱，每收集2-50ml流出液，用特定波长紫外/可见光进行测定，流出液的紫外/可见吸光值先增大后减小，当流出液紫外/可见吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=6的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH=1，搅拌4h后，静置24h，离心得到固体，标记为腐殖酸pH6；
以10柱体积/h的速度，用pH=7的焦磷酸钠缓冲液淋洗XAD-8树脂柱，每收集2-50ml流出液，用特定波长紫外/可见光进行测定，流出液的紫外/可见吸光值先增大后减小，当流出液紫外/可见吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=7的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH=1，搅拌4h后，静置24h，离心得到固体，标记为腐殖酸pH7；
氮气保护下，以10柱体积/h的速度，用pH=8的焦磷酸钠缓冲液淋洗XAD-8树脂柱，每收集2-50ml流出液，用特定波长紫外/可见光进行测定，流出液的紫外/可见吸光值先增大后减小，当流出液紫外/可见吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=8的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH=1，搅拌4h后，静置24h，离心得到固体，标记为腐殖酸pH8；
氮气保护下，以10柱体积/h的速度，用pH=9的焦磷酸钠缓冲液淋洗XAD-8树脂柱，每收集2-50ml流出液，用特定波长紫外/可见光进行测定，流出液的紫外/可见吸光值先增大后减小，当流出液紫外/可见吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=9的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH=1，搅拌4h后，静置24h，离心得到固体，标记为腐殖酸pH9；
氮气保护下，以10柱体积/h的速度，用pH=10的焦磷酸钠缓冲液淋洗XAD-8树脂柱，每收集2-50ml流出液，用特定波长紫外/可见光进行测定，流出液的紫外/可见吸光值先增大后减小，当流出液紫外/可见吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=10的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH=1，搅拌4h后，静置24h，离心得到固体，标记为腐殖酸pH10；
氮气保护下，以10柱体积/h的速度，用pH=11的焦磷酸钠缓冲液淋洗XAD-8树脂柱，每收集2-50ml流出液，用特定波长紫外/可见光进行测定，流出液的紫外/可见吸光值先增大后减小，当流出液紫外/可见吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=11的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH=1，搅拌4h后，静置24h，离心得到固体，标记为腐殖酸pH11；
氮气保护下，以10柱体积/h的速度，用pH=12的焦磷酸钠缓冲液淋洗XAD-8树脂柱，每收集2-50ml流出液，用特定波长紫外/可见光进行测定，流出液的紫外/可见吸光值先增大后减小，当流出液紫外/可见吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=12的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH=1，搅拌4h后，静置24h，离心得到固体，标记为腐殖酸pH12；
氮气保护下，以10柱体积/h的速度，用pH=13的焦磷酸钠缓冲液淋洗XAD-8树脂柱，每收集2-50ml流出液，用特定波长紫外/可见光进行测定，流出液的紫外/可见吸光值先增大后减小，当流出液紫外/可见吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=13的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH=1，搅拌4h后，静置24h，离心得到固体，标记为腐殖酸pH13；
步骤g、土壤腐殖酸除盐及固化：在氮气保护下，用0.1-0.3mol/L的氢氧化钠分别溶解腐殖酸pH3-13，使每份溶液固液体积比均为1:2，用浓盐酸分别调节溶液pH=4-9，共计得到11份腐殖酸亚组分溶液；
将11份腐殖酸亚组分溶液分别置入11个截留分子量为10000道尔顿透析袋，并将每个透析袋置于超纯水中，组成透析体系，搅拌24h，盐分通过透析袋进入超纯水，将每个透析袋中的腐殖酸亚组分溶液冷冻干燥得到11份腐殖酸亚组分，命名为腐殖酸亚组分pH3-pH13。
本实施例中，所述步骤e中所得上层清液用溶解有机碳测定仪器测定其溶解有机碳含量，如果上清液中溶解有机碳TOC>5mg/L，则重复步骤e，直到TOC<5mg/L后，再进行步骤f。
本实施例中，所述步骤g中透析体系搅拌20—40h后，用钼酸铵分光光度法和硝酸银法分别测定步骤g中透析袋外溶液的磷的含量和氯离子含量，如果总磷含量>0.01mg/L或者有氯化银存在，则多次更换透析体系中的超纯水，每次加入去离子水，搅拌20—40h后，再次测定，直到总磷含量<0.01mg/L且检测不到氯离子。
本实施例中，还包括步骤h：在80-100℃下烘干20-40h后，测定步骤g所得的11份腐殖酸亚组分pH3-pH13的灰分；
如果其中某份腐殖酸亚组分以干重记灰分大于1.0%，则将该腐殖酸亚组分在氮气保护条件下，在容器中，用氢氧化钠溶解，加入去离子水使溶液腐殖酸浓度=1—3g/L后，调节pH=3-9，再加入浓盐酸、浓氢氟酸和去离子水，使固液比为1:10且盐酸浓度为0.1mol/L，氢氟酸浓度为0.3mol/L，持续搅拌20-28h，离心分离得固体后重复操作步骤g。
实施例5，本实施例中一种土壤中腐殖酸的分级提取方法，所述分级提取方法包括如下步骤：
步骤a、土壤预处理：称取天然土壤，剔除树根和石子等杂物，风干碾磨后过2.0mm的筛，得到土壤样品；
步骤b、土壤酸洗：向土壤样品中加入去离子水，使固液比达到3：5，用氢氧化钠和盐酸调节其pH=2.0，得到固液混合物，向该固液混合物中加0.1mol/L的盐酸溶液，使其固液比为1:10，连续搅拌6h，静置28h后，离心后弃去上清液，得到酸洗土壤样品；
步骤c、提取土壤中腐殖酸：向酸洗土壤样品中加入去离子水，使其固液比为1:4，用盐酸和氢氧化钠调节溶液pH=7，得到固液混合物，氮气保护条件下，向该固液混合物中加入焦磷酸钠溶液，并用去离子水稀释，使焦磷酸钠浓度为0.2mol/L且固液比为1:10，持续搅拌4h，静置24h后，离心得到上清液1和土壤样品1；
氮气保护条件下，向上清液1中加入6mol/L盐酸，使其pH=2.0，搅拌30min，静置24后，离心得固体，标记为腐殖酸1；
向步骤b中的土壤样品1中加入去离子水，使其固液比为3：5，用盐酸和氢氧化钠调节其pH=7，得到固液混合物，氮气保护条件下，向该固液混合物中加入氢氧化钠溶液，并用去离子水稀释，使氢氧化钠浓度为0.3mol/L且固液比为1:10，搅拌8h，静置24h后，离心得到上清液2和土壤残渣；
氮气保护条件下，向上清液2中加入6mol/L盐酸，使其pH=2.0，搅拌15min，静置24h后，离心得固体，标记为腐殖酸2；
步骤d、腐殖酸除硅：将腐殖酸1和腐殖酸2合并，氮气保护条件下，用含有0.2mol/L氢氧化钠和0.4mol/L氯化钠的溶液溶解，高速离心分离，得到上层清液；将该上层清液用盐酸酸化至pH=3.0，搅拌30min，静置24h，离心得固体，标记为腐殖酸3；
向腐殖酸3中加入含有用含有0.2mol/L盐酸和0.4mol/L氢氟酸的溶液，使其固液比为1:10，持续搅拌28h，高速离心分离得固体标记为无硅腐殖酸；
步骤e、土壤腐殖酸除杂酸：向无硅腐殖酸中加入0.1mol/L盐酸溶液，使其固液比为3:10，持续搅拌6h，并静置24h后，离心得到上层清液及纯化腐殖酸；
步骤f、土壤腐殖酸的亚组分分级：在氮气保护条件下，用氢氧化钠将步骤e中的纯化腐殖酸溶解，加入去离子水使溶液中腐殖酸浓度在1-3g/L，用盐酸和氢氧化钠调节溶液pH=2后，以10倍柱体积/h的速度流过XAD-8树脂柱，流出液弃去；
以10柱体积/h的速度，用pH=3的焦磷酸钠缓冲液淋洗XAD-8树脂柱，每收集2-50ml流出液，用特定波长紫外/可见光进行测定，流出液的紫外/可见吸光值先增大后减小，当流出液紫外/可见吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=3的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH=1，搅拌4h后，静置24h，离心得到固体标记为腐殖酸pH3；
以10柱体积/h的速度，用pH=4的焦磷酸钠缓冲液淋洗XAD-8树脂柱，每收集2-50ml流出液，用特定波长紫外/可见光进行测定，流出液的紫外/可见吸光值先增大后减小，当流出液紫外/可见吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=4的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH=1，搅拌4h后，静置24h，离心得到固体，标记为腐殖酸pH4；
以10柱体积/h的速度，用pH=5的焦磷酸钠缓冲液淋洗XAD-8树脂柱，每收集2-50ml流出液，用特定波长紫外/可见光进行测定，流出液的紫外/可见吸光值先增大后减小，当流出液紫外/可见吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=5的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH=1，搅拌4h后，静置24h，离心得到固体，标记为腐殖酸pH5；
以10柱体积/h的速度，用pH=6的焦磷酸钠缓冲液淋洗XAD-8树脂柱，每收集2-50ml流出液，用特定波长紫外/可见光进行测定，流出液的紫外/可见吸光值先增大后减小，当流出液紫外/可见吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=6的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH=1，搅拌4h后，静置24h，离心得到固体，标记为腐殖酸pH6；
以10柱体积/h的速度，用pH=7的焦磷酸钠缓冲液淋洗XAD-8树脂柱，每收集2-50ml流出液，用特定波长紫外/可见光进行测定，流出液的紫外/可见吸光值先增大后减小，当流出液紫外/可见吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=7的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH=1，搅拌4h后，静置24h，离心得到固体，标记为腐殖酸pH7；
氮气保护下，以10柱体积/h的速度，用pH=8的焦磷酸钠缓冲液淋洗XAD-8树脂柱，每收集2-50ml流出液，用特定波长紫外/可见光进行测定，流出液的紫外/可见吸光值先增大后减小，当流出液紫外/可见吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=8的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH=1，搅拌4h后，静置24h，离心得到固体，标记为腐殖酸pH8；
氮气保护下，以10柱体积/h的速度，用pH=9的焦磷酸钠缓冲液淋洗XAD-8树脂柱，每收集2-50ml流出液，用特定波长紫外/可见光进行测定，流出液的紫外/可见吸光值先增大后减小，当流出液紫外/可见吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=9的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH=1，搅拌4h后，静置24h，离心得到固体，标记为腐殖酸pH9；
氮气保护下，以10柱体积/h的速度，用pH=10的焦磷酸钠缓冲液淋洗XAD-8树脂柱，每收集2-50ml流出液，用特定波长紫外/可见光进行测定，流出液的紫外/可见吸光值先增大后减小，当流出液紫外/可见吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=10的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH=1，搅拌4h后，静置24h，离心得到固体，标记为腐殖酸pH10；
氮气保护下，以10柱体积/h的速度，用pH=11的焦磷酸钠缓冲液淋洗XAD-8树脂柱，每收集2-50ml流出液，用特定波长紫外/可见光进行测定，流出液的紫外/可见吸光值先增大后减小，当流出液紫外/可见吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=11的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH=1，搅拌4h后，静置24h，离心得到固体，标记为腐殖酸pH11；
氮气保护下，以10柱体积/h的速度，用pH=12的焦磷酸钠缓冲液淋洗XAD-8树脂柱，每收集2-50ml流出液，用特定波长紫外/可见光进行测定，流出液的紫外/可见吸光值先增大后减小，当流出液紫外/可见吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=12的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH=1，搅拌4h后，静置24h，离心得到固体，标记为腐殖酸pH12；
氮气保护下，以10柱体积/h的速度，用pH=13的焦磷酸钠缓冲液淋洗XAD-8树脂柱，每收集2-50ml流出液，用特定波长紫外/可见光进行测定，流出液的紫外/可见吸光值先增大后减小，当流出液紫外/可见吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=13的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH=1，搅拌4h后，静置24h，离心得到固体，标记为腐殖酸pH13；
步骤g、土壤腐殖酸除盐及固化：在氮气保护下，用0.1-0.3mol/L的氢氧化钠分别溶解腐殖酸pH3-腐殖酸pH13，使每份溶液固液体积比均为1:2，用浓盐酸分别调节溶液pH=4-9，共计得到11份腐殖酸亚组分溶液；
将11份腐殖酸亚组分溶液分别置入11个截留分子量为10000道尔顿透析袋，并将每个透析袋置于超纯水中，组成透析体系，搅拌24h，盐分通过透析袋进入超纯水，将每个透析袋中的腐殖酸亚组分溶液冷冻干燥得到11份腐殖酸亚组分，命名为腐殖酸亚组分pH3-pH13。
本实施例所述分级提取方法中，步骤e中所得上层清液用溶解有机碳测定仪器测定其溶解有机碳含量，如果上清液中溶解有机碳TOC>5mg/L，则重复步骤e，直到TOC<5mg/L后，再进行步骤f。
本实施例步骤g中透析体系搅拌20—40h后，用钼酸铵分光光度法和硝酸银法分别测定步骤g中透析袋外溶液的磷的含量和氯离子含量，如果磷含量>0.01mg/L或者有氯化银存在，则多次更换透析体系中的超纯水，每次加入去离子水，搅拌20—40h后，再次测定，直到总磷含量<0.01mg/L且检测不到氯离子。
本实施例所述分级提取方法还包括步骤h：在80-100℃下烘干20-40h后，测定步骤g所得的11份腐殖酸亚组分pH3-pH13的灰分；
如果其中某份腐殖酸亚组分以干重计灰分大于1.0%，则将该腐殖酸亚组分在氮气保护条件下，在容器中，用氢氧化钠溶解，加入去离子水使溶液腐殖酸浓度=1—3g/L后，调节pH=3-9，再加入浓盐酸、浓氢氟酸和去离子水，使固液比为1:10且盐酸浓度为0.1mol/L，氢氟酸浓度为0.3mol/L，持续搅拌20-28h，离心分离得固体后重复操作步骤g。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (5)
1.一种土壤中腐殖酸的分级提取方法，其特征在于，所述分级提取方法包括如下步骤：
步骤a、土壤预处理：
称取天然土壤，剔除树根和石子等杂物，风干碾磨，得到土壤样品；
步骤b、土壤酸洗：
向土壤样品中加入去离子水，使固液比达到（1-3）：（5-8），用碱和酸调节其pH=1.0-3.0，得到固液混合物，向该固液混合物中加入酸，使其固液比为1:10，连续搅拌4-8h，静置20-28h后，离心后弃去上清液，得到酸洗土壤样品；
步骤c、提取土壤中腐殖酸：
向酸洗土壤样品中加入去离子水，使其固液比为（1-3）:（10-12），用酸和碱调节溶液pH=7，得到固液混合物，氮气保护条件下，向该固液混合物中加入焦磷酸钠溶液，并用去离子水稀释，使溶液中焦磷酸钠浓度为0.1-0.2mol/L且固液比为1:10，持续搅拌4-8h，静置20-28h后，离心得到上清液1和土壤样品1；
氮气保护条件下，向上清液1中加入酸，使其pH=1.0-3.0，搅拌15-30min，静置24-28h后，离心得固体，标记为腐殖酸1；
向步骤b中的土壤样品1中加入去离子水，使其固液比为（1-3）：（5-8），用酸和碱调节其pH=7，得到固液混合物，氮气保护条件下，向该固液混合物中加入氢氧化钠溶液，并用去离子水稀释，使氢氧化钠浓度为0.1-0.3mol/L且固液比为1:10，搅拌4-8h，静置20-28h后，离心得到上清液2和土壤残渣；
氮气保护条件下，向上清液2中加入盐酸，使其pH=1.0-3.0，搅拌15-30min，静置20-28h后，离心得固体，标记为腐殖酸2；
步骤d、腐殖酸除硅：
将腐殖酸1和腐殖酸2合并，氮气保护条件下，用含有0.1-0.3mol/L氢氧化钠和0.2-0.4mol/L氯化钠的溶液溶解，高速离心分离，得到上层清液；将该上层清液用盐酸酸化至pH=1.0-3.0，搅拌15-30min，静置20-28h，离心得固体，标记为腐殖酸3；
向腐殖酸3中加入含有0.1-0.3mol/L盐酸和0.2-0.4mol/L氢氟酸的溶液，使固液比为1:10，持续搅拌20-28h，离心分离得固体标记为无硅腐殖酸酸；
步骤e、土壤腐殖酸除杂酸：
向无硅腐殖酸中加入盐酸溶液，使其固液比为（1-3）:（10-12），持续搅拌4-8h，并静置20-28h后，离心得到上层清液及纯化腐殖酸；
步骤f、土壤腐殖酸的亚组分分级：
在氮气保护条件下，用氢氧化钠将步骤e中的纯化腐殖酸溶解，加入去离子水使溶液中腐殖酸浓度在1-3g/L，用盐酸和氢氧化钠调节溶液pH=1-3后，以10倍柱体积/h的速度流过XAD-8树脂柱，流出液弃去；；
以5-10倍柱体积/h的速度，用pH=3的焦磷酸钠缓冲液淋洗XAD-8树脂柱，每收集2-50ml流出液，用特定波长紫外/可见光进行测定，流出液的紫外/可见吸光值先增大后减小，当流出液紫外/可见吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=3的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH=1，搅拌4h后，静置24h，离心得到固体，标记为腐殖酸pH3；
以5-10倍柱体积/h的速度，用pH=4的焦磷酸钠缓冲液淋洗XAD-8树脂柱，每收集2-50ml流出液，用特定波长紫外/可见光进行测定，流出液的紫外/可见吸光值先增大后减小，当流出液紫外/可见吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=4的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH=1，搅拌4h后，静置24h，离心得到固体，标记为腐殖酸pH4；
以5-10倍柱体积/h的速度，用pH=5的焦磷酸钠缓冲液淋洗XAD-8树脂柱，每收集2-50ml流出液，用特定波长紫外/可见光进行测定，流出液的紫外/可见吸光值先增大后减小，当流出液紫外/可见吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=5的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH=1，搅拌4h后，静置24h，离心得到固体，标记为腐殖酸pH5；
以5-10倍柱体积/h的速度，用pH=6的焦磷酸钠缓冲液淋洗XAD-8树脂柱，每收集2-50ml流出液，用特定波长紫外/可见光进行测定，流出液的紫外/可见吸光值先增大后减小，当流出液紫外/可见吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=6的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH=1，搅拌4h后，静置24h，离心得到固体，标记为腐殖酸pH6；
以5-10倍柱体积/h的速度，用pH=7的焦磷酸钠缓冲液溶液淋洗XAD-8树脂柱，每收集2-50ml流出液，用特定波长紫外/可见光进行测定，流出液的紫外/可见吸光值先增大后减小，当流出液紫外/可见吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=7的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH=1，搅拌4h后，静置24h，离心得到固体，标记为腐殖酸pH7；
氮气保护下，以5-10倍柱体积/h的速度，用pH=8的焦磷酸钠缓冲液淋洗XAD-8树脂柱，每收集2-50ml流出液，用特定波长紫外/可见光进行测定，流出液的紫外/可见吸光值先增大后减小，当流出液紫外/可见吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=8的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH=1，搅拌4h后，静置24h，离心得到固体，标记为腐殖酸pH8；
氮气保护下，以5-10倍柱体积/h的速度，用pH=9的焦磷酸钠缓冲液淋洗XAD-8树脂柱，每收集2-50ml流出液，用特定波长紫外/可见光进行测定，流出液的紫外/可见吸光值先增大后减小，当流出液紫外/可见吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=9的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH=1，搅拌4h后，静置24h，离心得到固体，标记为腐殖酸pH9；
氮气保护下，以5-10倍柱体积/h的速度，用pH=10的焦磷酸钠缓冲液淋洗XAD-8树脂柱，每收集2-50ml流出液，用特定波长紫外/可见光进行测定，流出液的紫外/可见吸光值先增大后减小，当流出液紫外/可见吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=10的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH=1，搅拌4h后，静置24h，离心得到固体，标记为腐殖酸pH10；
氮气保护下，以5-10倍柱体积/h的速度，用pH=11的焦磷酸钠缓冲液淋洗XAD-8树脂柱，每收集2-50ml流出液，用特定波长紫外/可见光进行测定，流出液的紫外/可见吸光值先增大后减小，当流出液紫外/可见吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=11的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH=1，搅拌4h后，静置24h，离心得到固体，标记为腐殖酸pH11；
氮气保护下，以5-10倍柱体积/h的速度，用pH=12的焦磷酸钠缓冲液淋洗XAD-8树脂柱，每收集2-50ml流出液，用特定波长紫外/可见光进行测定，流出液的紫外/可见吸光值先增大后减小，当流出液紫外/可见吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=12的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH=1，搅拌4h后，静置24h，离心得到固体，标记为腐殖酸pH12；
氮气保护下，以5-10倍柱体积/h的速度，用pH=13的焦磷酸钠缓冲液淋洗XAD-8树脂柱，每收集2-50ml流出液，用特定波长紫外/可见光进行测定，流出液的紫外/可见吸光值先增大后减小，当流出液紫外/可见吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=13的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH=1，搅拌4h后，静置24h，离心得到固体，标记为腐殖酸pH13；
步骤g、土壤腐殖酸除盐及固化：
在氮气保护下，用0.1-0.3mol/L的氢氧化钠分别溶解腐殖酸pH3-腐殖酸pH13，使每份溶液固液体积比均为1:2，用浓盐酸分别调节溶液pH=4-9，共计得到11份腐殖酸亚组分溶液；
将11份腐殖酸亚组分溶液分别置入11个截留分子量为10000道尔顿透析袋中，并将每个透析袋置于超纯水中，组成透析体系，搅拌20—40h后，将每个透析袋中的腐殖酸亚组分溶液冷冻干燥得到11份腐殖酸亚组分，命名为腐殖酸亚组分pH3-pH13。
2.根据权利要求1所述的土壤中腐殖酸的分级提取方法，其特征在于，所述分级提取方法中，所述步骤e中所得上层清液用溶解有机碳测定仪器测定其溶解有机碳含量，如果上清液中溶解有机碳TOC>5mg/L，则重复步骤e，直到TOC<5mg/L后，再进行步骤f。
3.根据权利要求1所述的土壤中腐殖酸的分级提取方法，其特征在于，所述步骤g中透析体系搅拌20—40h后，用钼酸铵分光光度法和硝酸银法分别测定步骤g中透析袋外溶液的磷含量和氯离子含量，如果磷含量>0.01mg/L或者有氯化银存在，则多次更换透析体系中的超纯水，每次加入去离子水，搅拌20—40h后，再次测定，直到磷含量<0.01mg/L且检测不到氯离子。
4.根据权利要求1所述的土壤中腐殖酸的分级提取方法，其特征在于，所述分级提取方法还包括步骤h：在80-100℃下烘干20-40h后，在550℃下灼烧5-10h，测定步骤g所得的11份腐殖酸亚组分pH3-pH13的灰分；
如果其中某份腐殖酸亚组分以干重计灰分大于1.0%，则将该腐殖酸亚组分在氮气保护条件下，在容器中，用氢氧化钠溶解，加入去离子水使溶液腐殖酸浓度=1—3g/L后，调节pH=3-9，再加入浓盐酸、浓氢氟酸和去离子水，使固液比为1:10且盐酸浓度为0.1mol/L，氢氟酸浓度为0.3mol/L，持续搅拌20-28h，离心分离得固体后重复操作步骤g。
5.根据权利要求1所述的土壤中腐殖酸的分级提取方法，其特征在于，所述分级提取方法包括如下步骤：
步骤a、土壤预处理：称取天然土壤，剔除树根和石子等杂物，风干碾磨后过2.0mm的筛，得到土壤样品；
步骤b、土壤酸洗：向土壤样品中加入去离子水，使固液比达到1：5，用氢氧化钠和盐酸调节其pH=1.0，得到固液混合物，向该固液混合物中加0.1mol/L的盐酸溶液，使其固液比为1:10，连续搅拌4h，静置24h后，离心后弃去上清液，得到酸洗土壤样品；
步骤c、提取土壤中腐殖酸：向酸洗土壤样品中加入去离子水，使其固液比为1:3，用盐酸和氢氧化钠调节溶液pH=7，得到固液混合物，氮气保护条件下，向该固液混合物中加入焦磷酸钠溶液，并用去离子水稀释，使焦磷酸钠浓度为0.1mol/L且固液比为1:10，持续搅拌4h，静置24h后，离心得到上清液1和土壤样品1；
氮气保护条件下，向上清液1中加入6mol/L盐酸，使其pH=1.0，搅拌30min，静置24后，离心得固体，标记为腐殖酸1；
向步骤b中的土壤样品1中加入去离子水，使其固液比为1：3，用盐酸和氢氧化钠调节其pH=7，得到固液混合物，氮气保护条件下，向该固液混合物中加入氢氧化钠溶液，并用去离子水稀释，使氢氧化钠浓度为0.1mol/L且固液比为1:10，搅拌4h，静置24h后，离心得到上清液2和土壤残渣；
氮气保护条件下，向上清液2中加入6mol/L盐酸，使其pH=1.0，搅拌30min，静置24h后，离心得固体，标记为腐殖酸2；
步骤d、腐殖酸除硅：将腐殖酸1和腐殖酸2合并，氮气保护条件下，用含有0.1mol/L氢氧化钠和0.3mol/L氯化钠的溶液溶解，高速离心分离，得到上层清液；将该上层清液用盐酸酸化至pH=1.0，搅拌30min，静置24h，离心得固体，标记为腐殖酸3；
向腐殖酸3中加入含有0.1mol/L盐酸和0.3mol/L氢氟酸的溶液，使其固液比为1:10，持续搅拌24h，高速离心分离得固体标记为无硅腐殖酸；
步骤e、土壤腐殖酸除杂酸：向无硅腐殖酸中加入0.1mol/L盐酸溶液，使其固液比为1:10，持续搅拌4h，并静置24h后，离心得到上层清液及纯化腐殖酸；
步骤f、土壤腐殖酸的亚组分分级：在氮气保护条件下，用氢氧化钠将步骤e中的纯化腐殖酸溶解，加入去离子水使溶液中腐殖酸浓度在1-3g/L，用盐酸和氢氧化钠调节溶液pH=2后，以10倍柱体积/h的速度流过XAD-8树脂柱，流出液弃去；
以10柱体积/h的速度，用pH=3的焦磷酸钠缓冲液淋洗XAD-8树脂柱，每收集2-50ml流出液，用特定波长紫外/可见光进行测定，流出液的紫外/可见吸光值先增大后减小，当流出液紫外/可见吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=3的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH=1，搅拌4h后，静置24h，离心得到固体，标记为腐殖酸pH3；
以10柱体积/h的速度，用pH=4的焦磷酸钠缓冲液淋洗XAD-8树脂柱，每收集2-50ml流出液，用特定波长紫外/可见光进行测定，流出液的紫外/可见吸光值先增大后减小，当流出液紫外/可见吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=4的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH=1，搅拌4h后，静置24h，离心得到固体，标记为腐殖酸pH4；
以10柱体积/h的速度，用pH=5的焦磷酸钠缓冲液淋洗XAD-8树脂柱，每收集2-50ml流出液，用特定波长紫外/可见光进行测定，流出液的紫外/可见吸光值先增大后减小，当流出液紫外/可见吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=5的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH=1，搅拌4h后，静置24h，离心得到固体，标记为腐殖酸pH5；
以10柱体积/h的速度，用pH=6的焦磷酸钠缓冲液淋洗XAD-8树脂柱，每收集2-50ml流出液，用特定波长紫外/可见光进行测定，流出液的紫外/可见吸光值先增大后减小，当流出液紫外/可见吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=6的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH=1，搅拌4h后，静置24h，离心得到固体，标记为腐殖酸pH6；
以10柱体积/h的速度，用pH=7的焦磷酸钠缓冲液淋洗XAD-8树脂柱，每收集2-50ml流出液，用特定波长紫外/可见光进行测定，流出液的紫外/可见吸光值先增大后减小，当流出液紫外/可见吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=7的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH=1，搅拌4h后，静置24h，离心得到固体，标记为腐殖酸pH7；
氮气保护下，以10柱体积/h的速度，用pH=8的焦磷酸钠缓冲液淋洗XAD-8树脂柱，每收集2-50ml流出液，用特定波长紫外/可见光进行测定，流出液的紫外/可见吸光值先增大后减小，当流出液紫外/可见吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=8的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH=1，搅拌4h后，静置24h，离心得到固体，标记为腐殖酸pH8；
氮气保护下，以10柱体积/h的速度，用pH=9的焦磷酸钠缓冲液淋洗XAD-8树脂柱，每收集2-50ml流出液，用特定波长紫外/可见光进行测定，流出液的紫外/可见吸光值先增大后减小，当流出液紫外/可见吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=9的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH=1，搅拌4h后，静置24h，离心得到固体，标记为腐殖酸pH9；
氮气保护下，以10柱体积/h的速度，用pH=10的焦磷酸钠缓冲液淋洗XAD-8树脂柱，每收集2-50ml流出液，用特定波长紫外/可见光进行测定，流出液的紫外/可见吸光值先增大后减小，当流出液紫外/可见吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=10的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH=1，搅拌4h后，静置24h，离心得到固体，标记为腐殖酸pH10；
氮气保护下，以10柱体积/h的速度，用pH=11的焦磷酸钠缓冲液淋洗XAD-8树脂柱，每收集2-50ml流出液，用特定波长紫外/可见光进行测定，流出液的紫外/可见吸光值先增大后减小，当流出液紫外/可见吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=11的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH=1，搅拌4h后，静置24h，离心得到固体，标记为腐殖酸pH11；
氮气保护下，以10柱体积/h的速度，用pH=12的焦磷酸钠缓冲液淋洗XAD-8树脂柱，每收集2-50ml流出液，用特定波长紫外/可见光进行测定，流出液的紫外/可见吸光值先增大后减小，当流出液紫外/可见吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=12的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH=1，搅拌4h后，静置24h，离心得到固体，标记为腐殖酸pH12；
氮气保护下，以10柱体积/h的速度，用pH=13的焦磷酸钠缓冲液淋洗XAD-8树脂柱，每收集2-50ml流出液，用特定波长紫外/可见光进行测定，流出液的紫外/可见吸光值先增大后减小，当流出液紫外/可见吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=13的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH=1，搅拌4h后，静置24h，离心得到固体，标记为腐殖酸pH13；
步骤g、土壤腐殖酸除盐及固化：在氮气保护下，用0.1-0.3mol/L的氢氧化钠分别溶解腐殖酸pH3-腐殖酸pH13，使每份溶液固液体积比均为1:2，用浓盐酸分别调节溶液pH=4-9，共计得到11份腐殖酸亚组分溶液；
将11份腐殖酸亚组分溶液分别置入11个截留分子量为10000道尔顿透析袋，并将每个透析袋置于超纯水中，组成透析体系，搅拌24h，盐分通过透析袋进入超纯水，将每个透析袋中的腐殖酸亚组分溶液冷冻干燥得到11份腐殖酸亚组分，命名为腐殖酸亚组分pH3-pH13。
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