CN105037748A - 一种藻体中腐殖酸的分级提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种藻体中腐殖酸的分级提取方法，所述分级提取方法包括如下步骤：藻体预处理、藻体索氏提取、藻体氯化钙及酸洗、藻体碳酸钠处理、藻体碱液提取、藻体腐殖酸除硅、藻体腐殖酸除富里酸、藻体腐殖酸除盐及固化。通过上述方式，本发明能够从藻体中提取腐殖酸，并利用XAD-8树脂分离技术进行亚组分分离，最终得到分级的藻体腐殖酸亚组分。
Description
技术领域
本发明涉及腐殖酸分离提取技术，具体涉及一种藻体中腐殖酸的分级提取方法。
背景技术
腐殖酸（humicacid）是一种广泛存在于土壤、水体、沉积物等环境介质中的大分子有机混合物。腐殖酸能溶于碱性和中性溶液，不溶于酸。腐殖酸中含有大量活性官能团如羧基、酚羟基、羰基、氨基和巯基，从而具有很高的反应活性。例如在天然环境中，能与环境中的有毒重金属离子和有机污染物（如农药，PPCPs和PAHs）发生相互作用，形成化学和生物稳定性的溶于水和不溶于水的物质，从而改变其迁移、转化规律和生物有效性。
一般认为，腐殖酸是由动植物及其残体经过复杂的物理、化学、生物过程形成的，但大量研究表明海洋藻体中含有一定量的腐殖酸。活体生物中，特别是藻体中腐殖酸的提取对研究腐殖酸来源和归趋具有重要意义。现代仪器分析技术的发展，为腐殖质的研究提供了先进的手段，取得大量突破性创新。人们已经熟知腐殖酸元素组成，光谱特征等基本理化性质。但是由于腐殖酸的组成和结构及其复杂，它的元素组成、分子量、芳香度及官能团含量等结构随着时空不同而发生变化，因此成功分离腐殖酸及其亚组分具有重要的环境学意义。然而藻体腐殖酸的分级分离尚未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种藻体中腐殖酸的分级提取方法，该方法能够克服现有技术对腐殖酸分级提取过程的不足，获得腐殖酸各级亚组分。
为实现上述目的，本发明公开了一种藻体中腐殖酸的分级提取方法，所述分级提取方法包括如下步骤：
步骤a、藻体预处理：
取风干后的藻体剔除杂物，下烘干碾磨后过筛，得到藻体粉末；
步骤b、藻体索氏提取：
将藻体粉末置于索式提取器中，依次用乙醚、丙酮、95%乙醇、二氧杂环己烷和去离子水为提取液进行索氏提取，所得固体标记为索提藻体；
步骤c、藻体氯化钙及酸洗：
用氯化钙溶液连续三次提取索提藻体，每次提取时固液比为1：10，在40-60oC条件下连续搅拌15-30min后，离心所得固体标记为氯化钙处理藻体；
用盐酸连续三次提取氯化钙处理藻体，每次提取时固液比为1：10，连续搅拌10-30min后，离心所得固体标记为盐酸处理藻体；
向盐酸处理藻体中加入去离子水，使固液比达到1：10，连续搅拌10-30min后，离心所得固体标记为水洗盐酸处理藻体；
步骤d、藻体碳酸钠处理：
用碳酸钠溶液连续三次提取水洗盐酸处理藻体，每次提取固液比为1：10，在30-45oC条件下连续搅拌30-60min后，离心所得固体标记为碳酸钠处理藻体；
向碳酸钠处理藻体中加入去离子水，使固液比达到1：10，连续搅拌10-30min后，离心所得固体标记为水洗碳酸钠处理藻体；
步骤e、藻体碱液提取：
向水洗碳酸钠处理藻体中加入去离子水，使溶液固液比达到1:3，用盐酸和氢氧化钠调节溶液pH值=6.0-8.0，在氮气保护下，向溶液中加入焦磷酸钠溶液，使溶液固液比为1:10且焦磷酸钠浓度为0.1mol/L，然后将溶液连续搅拌4-6h，静置20-28h后，离心分离，得到上层清液1及固体焦磷酸钠提取藻体1；
在氮气保护下，向焦磷酸钠提取藻体1中加入焦磷酸钠溶液，使溶液固液比为1:10且焦磷酸钠浓度为0.1mol/L，然后将溶液连续搅拌4-6h，静置20-28h后，离心分离，得到上层清液2及固体焦磷酸钠提取藻体2；
在氮气保护下，向焦磷酸钠提取藻体2中加入焦磷酸钠溶液，使溶液固液比为1:10且焦磷酸钠浓度为0.1mol/L，然后将溶液连续搅拌4-6h，静置20-28h后，离心分离，得到上层清液3及固体焦磷酸钠提取藻体3；
在氮气保护下，向焦磷酸钠提取藻体3中加入去离子水，使溶液固液比达到1:5，用盐酸和氢氧化钠调节溶液pH值=6.0-8.0，向溶液中加入氢氧化钠溶液，使溶液固液比为1:10且氢氧化钠浓度为0.1mol/L，然后将溶液连续搅拌4-6h，静置20-28h后，离心分离，得到上层清液4及固体氢氧化钠提取藻体1；
在氮气保护下，向氢氧化钠提取藻体1中加入氢氧化钠溶液，使溶液固液比为1:10且氢氧化钠浓度为0.1mol/L，然后将溶液连续搅拌4-6h，静置20-28h后，离心分离，得到上层清液5及固体氢氧化钠提取藻体2；
在氮气保护下，向氢氧化钠提取藻体2中加入氢氧化钠溶液，使溶液固液比为1:10且氢氧化钠浓度为0.1mol/L，然后将溶液连续搅拌4-6h，静置20-28h后，离心分离，得到上层清液6及固体氢氧化钠提取藻体3；
步骤f、藻体腐殖酸除硅：
用盐酸将步骤e中上层清液1-上层清液6进行酸化，分别调节每份溶液pH值=1.0，再分别向其中加入氢氟酸，使每份酸化液中的氢氟酸浓度为0.3mol/L，再分别搅拌4-6h，分别静置20-28h，离心所得固体标记为无硅腐殖酸亚组分溶液1～无硅腐殖酸亚组分溶液6，共计六份无硅腐殖酸亚组分溶液；
步骤g、藻体腐殖酸除富里酸：
向六份无硅腐殖酸亚组分溶液中分别加入0.1mol/L盐酸溶液，使溶液固液比均为1:10，持续搅拌4-6h，并静置20-28h后，再将每份溶液离心分离得到富里酸溶液及对应的固态纯化腐殖酸亚组分；其中，无硅腐殖酸亚组分溶液1得到离心分离的富里酸溶液1及对应的固态纯化腐殖酸亚组分1；无硅腐殖酸亚组分溶液2得到离心分离的富里酸溶液2及对应的固态纯化腐殖酸亚组分2；无硅腐殖酸亚组分溶液3得到离心分离的富里酸溶液3及对应的固态纯化腐殖酸亚组分3；无硅腐殖酸亚组分溶液4得到离心分离的富里酸溶液4及对应的固态纯化腐殖酸亚组分4；无硅腐殖酸亚组分溶液5得到离心分离的富里酸溶液5及对应的固态纯化腐殖酸亚组分5；无硅腐殖酸亚组分溶液6得到离心分离的富里酸溶液6及对应的固态纯化腐殖酸亚组分6；
步骤h、藻体腐殖酸除盐及固化：
在氮气保护下，用氢氧化钠分别溶解固态纯化腐殖酸亚组分1至固态纯化腐殖酸亚组分6，用盐酸调节每份溶解液至pH=5-9，使每份溶解液的固液比均为1:2，共计得到六份腐殖酸亚组分溶液；
将六份腐殖酸亚组分溶液分别置入六个7000道尔顿透析袋，并将每个透析袋置于超纯水中，组成透析体系，每个透析体系均搅拌10-24h；再将每个透析袋中的腐殖酸亚组分溶液冷冻干燥，分别得到六份腐殖酸亚组分固体，分别命名为藻体腐殖酸亚组分1、藻体腐殖酸亚组分2、藻体腐殖酸亚组分3、藻体腐殖酸亚组分4、藻体腐殖酸亚组分5、藻体腐殖酸亚组分6。
优选的，所述步骤b中，索提过程中，当采用其中一种索提液索提时，则每隔3-5h，在220nm波长的紫外可见光下测定索提液的吸光度，当测得的索提液的吸光度大于或等于0.01时，则继续该索提过程；当测得的吸光度小于0.01时，更换下一个索提液进行索提。
优选的，所述步骤g中，离心分离得到每份富里酸溶液时，则将所得的富里酸溶液用溶解有机碳测定仪器测定其溶解有机碳含量，若测得的溶解有机碳TOC>5mg/L，则将该离心分离的富里酸溶液对应的固态纯化腐殖酸亚组分重复步骤g的加酸搅拌静置操作，直到TOC<5mg/L后，再进行步骤h。
优选的，所述分级提取方法还包括步骤i：将藻体腐殖酸亚组分1至藻体腐殖酸亚组分6分别在80-100℃下烘干24h后，测定所得的的灰分；如果其中某份藻体腐殖酸亚组分以干重计灰分大于0.1%，则将该藻体腐殖酸亚组分在氮气保护条件下，用0.1mol/L氢氧化钠溶解，加入去离子水使溶液腐殖酸浓度=1—3g/L后，调节pH=5-9，再加入浓盐酸、浓氢氟酸和去离子水，使固液比为1:10且盐酸浓度为0.1mol/L，氢氟酸浓度为0.3mol/L，持续搅拌4h，静置24h后，离心分离得固体后重复测定灰分，直到测得的灰分小于等于0.1%。
优选的，所述步骤c中氯化钙溶液的质量百分数是1%。
优选的，所述步骤d中碳酸钠溶液的质量百分数是0.5%。
本发明中步骤b中，乙醚、丙酮、95%乙醇、二氧杂环己烷、去离子水提取液依次进行索氏提取，其目的是去除藻体中非腐殖物质；
本发明中步骤c中，用氯化钙溶液处理索提藻体的目的是去除藻体中的多糖，用盐酸酸洗处理藻体的目的是去除剩余氯化钙及部分金属离子；
本发明中步骤d中，用碳酸钠溶液处理的目的是去除藻体中的藻酸；
本发明中步骤e中，利用焦磷酸钠和氢氧化钠混合提取藻体中腐殖酸，与单一氢氧化钠或焦磷酸钠提取相比，本发明步骤e的速度更快、效率更高，提取更完全；
本发明步骤f中加入氢氟酸的操作是：利用氢氟酸和硅酸盐及硅单质反应，生产四氟合硅气体，从而去除腐殖酸亚组分样品中的含硅杂质。
本发明中利用在pH=1.0的条件下，腐殖酸为固态，部分杂质（如富里酸、钙镁离子）可溶的等特点，在步骤g中对无硅腐殖酸进行酸洗，该步骤操作具有以下优点：（1）pH=1.0时，腐殖酸为沉淀，藻体酸洗过程中不会损失腐殖酸组分；（2）pH=1.0时，富里酸可溶，去除部分酸溶性富里酸；
本发明的有益效果是：本发明藻体中腐殖酸的分级提取方法能够克服现有技术对腐殖酸分级提取过程的不足，获得纯度较高的腐殖酸各级亚组分，便于对藻体的研究。
具体实施方式
下面对本发明的较佳实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。
实施例1：胶州湾褐藻样品中腐殖酸的分级提取：
于2014年6月份取胶州湾褐藻样品；
XAD-8树脂柱；Sigma公司；
氢氧化钠：分析纯；盐酸：分析纯；
本实施例的具体操作如下：
步骤a、藻体预处理：取风干后的藻体剔除杂物，在40℃下烘干碾磨后过40目筛，得到4Kg藻体粉末；
步骤b、藻体索氏提取：
将4Kg藻体粉末置于索式提取器中，依次用乙醚、丙酮、95%乙醇、二氧杂环己烷和去离子水为提取液进行索氏提取，最终得到3.45Kg固体，标记为索提藻体；在索提过程中，首先采用乙醚作为索提液索提时，每隔3-5h，在220nm波长的紫外可见光下测定索提液的吸光度，当测得的索提液的吸光度大于或等于0.01时，则继续该索提过程；当测得的吸光度小于0.01时，则更换丙酮索提液进行索提；以此类推，依次利用乙醚、丙酮、95%乙醇、二氧杂环己烷和去离子水进行索提；
步骤c、藻体氯化钙及酸洗：
用质量百分数为1%的氯化钙溶液连续三次提取步骤b中的索提藻体，每次提取固液比均为1：10，在60oC条件下连续搅拌15min后，离心所得固体标记为氯化钙处理藻体；
利用0.1mol/L的盐酸连续三次提取氯化钙处理藻体，每次提取固液比为1：10，连续搅拌10min后，离心所得固体标记为盐酸处理藻体；
向盐酸处理藻体中加入去离子水，使固液比达到1：10，连续搅拌10min后，离心得到3.2Kg固体，标记为水洗盐酸处理藻体；
步骤d、藻体碳酸钠处理：
用质量百分比为0.5%的碳酸钠连续三次提取水洗盐酸处理藻体，每次提取固液比为1：10，在45oC条件下连续搅拌0.5h后，离心所得固体标记为碳酸钠处理藻体；
向碳酸钠处理藻体中加入去离子水，使固液比达到1：10，连续搅拌10min后，离心得到2.89Kg固体，标记为水洗碳酸钠处理藻体；
步骤e、藻体碱液提取：
向2.89Kg水洗碳酸钠处理藻体中加入去离子水，使其固液比达到1:3，用6mol/L盐酸和6mol/L氢氧化钠调节其pH值介于6.0～8.0之间，在氮气保护下，向溶液中加入0.2mol/L焦磷酸钠溶液，使其固液比为1:10且焦磷酸钠浓度为0.1mol/L，然后将溶液连续搅拌4h，静置24h后，离心分离，得到上清液1及固体焦磷酸钠提取藻体1；
在氮气保护下，向焦磷酸钠提取藻体1中加入0.2mol/L焦磷酸钠溶液并稀释，使溶液固液比为1:10且焦磷酸钠浓度为0.1mol/L，然后将溶液连续搅拌4h，静置24h后，离心分离，得到上清液2及固体焦磷酸钠提取藻体2；
在氮气保护下，向焦磷酸钠提取藻体2中加入0.2mol/L焦磷酸钠溶液并稀释，使溶液固液比为1:10且焦磷酸钠浓度为0.1mol/L，然后将溶液连续搅拌4h，静置24h后，离心分离，得到上清液3及固体焦磷酸钠提取藻体3；
在氮气保护下，向焦磷酸钠提取藻体中加入去离子水，使其固液比达到1:5，用6mol/L盐酸和6mol/L氢氧化钠调节溶液pH值介于6.0～8.0之间，向溶液中加入0.2mol/L氢氧化钠溶液并稀释，使其固液比为1:10且氢氧化钠浓度为0.1mol/L，然后将溶液连续搅拌4h，静置24h后，离心分离，得到上清液4及固体氢氧化钠提取藻体1；
在氮气保护下，向氢氧化钠提取藻体1中加入0.2mol/L氢氧化钠溶液并稀释，使溶液固液比为1:10且氢氧化钠浓度为0.1mol/L，然后将溶液连续搅拌4h，静置24h后，离心分离，得到上清液5及固体氢氧化钠提取藻体2；
在氮气保护下，向氢氧化钠提取藻体2中加入0.2mol/L氢氧化钠溶液并稀释，使溶液固液比为1:10且氢氧化钠浓度为0.1mol/L，然后将溶液连续搅拌4h，静置24h后，离心分离，得到上清液6及固体氢氧化钠提取藻体3；
步骤f、藻体腐殖酸除硅：
用6mol/L盐酸将步骤e中上清液1至上清液6分别调节至溶液pH值等于1.0，然后分别加入6mol/L的氢氟酸，使每份酸化液中的氢氟酸浓度为0.3mol/L时，再分别搅拌4h，分别静置24h，离心所得固体标记为无硅腐殖酸亚组分溶液1～无硅腐殖酸亚组分溶液6，共计六份无硅腐殖酸亚组分溶液；
步骤g、藻体腐殖酸除富里酸：
向六份无硅腐殖酸亚组分溶液中分别加入0.1mol/L盐酸溶液，使每份溶液的固液比均为1:10，持续搅拌4-6h，并静置24h后，将每份溶液离心分离，则无硅腐殖酸亚组分溶液1得到离心分离的富里酸溶液1及对应的固态纯化腐殖酸亚组分1；无硅腐殖酸亚组分溶液2得到离心分离的富里酸溶液2及对应的固态纯化腐殖酸亚组分2；无硅腐殖酸亚组分溶液3得到离心分离的富里酸溶液3及对应的固态纯化腐殖酸亚组分3；无硅腐殖酸亚组分溶液4得到离心分离的富里酸溶液4及对应的固态纯化腐殖酸亚组分4；无硅腐殖酸亚组分溶液5得到离心分离的富里酸溶液5及对应的固态纯化腐殖酸亚组分5；无硅腐殖酸亚组分溶液6得到离心分离的富里酸溶液6及对应的固态纯化腐殖酸亚组分6；
步骤h、藻体腐殖酸除盐及固化：
在氮气保护下，用0.1mol/L的氢氧化钠分别溶解固态纯化腐殖酸亚组分1至固态纯化腐殖酸亚组分6，用盐酸调节每份溶解液的pH=5-9，使每份溶液的固液比均为1:2，共计得到六份腐殖酸亚组分溶液；
将六份腐殖酸亚组分溶液分别置入六个7000道尔顿透析袋，并将每个透析袋置于超纯水中，组成透析体系，每个透析体系均搅拌12h之后，再将每个透析袋中的腐殖酸亚组分溶液冷冻干燥，最终得到六份腐殖酸亚组分固体，分别命名为藻体腐殖酸亚组分1、藻体腐殖酸亚组分2、藻体腐殖酸亚组分3、藻体腐殖酸亚组分4、藻体腐殖酸亚组分5、藻体腐殖酸亚组分6。
本实施例中，最终得到的藻体腐殖酸亚组分1至藻体腐殖酸亚组分6的质量依次为8.5g、3.8g、1.7g、0.58g、0.35g、0.09g。
结合腐殖酸自身特点，利用元素分析法和13C-NMR光谱分析法对腐殖酸亚组分进行定量-半定量分析；利用FTIR、UV-Vis和三维荧光光谱对腐殖酸亚组分进行定性分析，结果如下：
元素分析结果显示，该方法提取的藻体腐殖酸亚组分中碳、氢、氧、硫元素含量及碳氢元素比、碳氧元素比，符合国际腐殖酸协会标准腐殖酸元素含量要求。FTIR光谱分析显示，该方法提取的藻体腐殖酸亚组分均包含羟基、烷基和羧基等官能团，这与国际腐殖酸协会标准腐殖酸红外光谱结论一致。UV-Vis光谱分析显示，该方法提取的藻体腐殖酸亚组分紫外吸光度均随着紫外波长增大而降低，紫外光谱符合指数递减规律，这与国际腐殖酸协会标准腐殖酸紫外光谱结论一致。13C-NMR光谱分析显示，该方法提取的藻体腐殖酸亚组分均包含饱和脂肪碳峰、烷氧基碳、芳香碳、羧基碳，这与国际腐殖酸协会标准腐殖酸一致。三维荧光光谱分析显示，该方法提取的藻体腐殖酸亚组分的三维荧光光谱峰均坐落于藻体类腐殖酸荧光峰范围，与国际腐殖酸协会标准腐殖酸一致。
进一步分析表明：该方法提取的不同腐殖酸亚组分中的氢碳元素比存在明显变化，腐殖酸亚组分1-6的氢碳元素比分别为0.73、0.78、0.82、0.93、0.99、1.02；
13C-NMR光谱分析结果显示，该方法提取的不同腐殖酸亚组分中的羧基碳比例存在明显变化，腐殖酸亚组分1-6的羧基碳比例为19.7、19.9、18.6、15.7、13.2、12.9；
该方法提取的不同腐殖酸亚组分中的芳香碳含量存在明显变化，腐殖酸亚组分1-6的芳香碳比例为47.2、48.1、48.9、54.1、55.7、55.6。
实施例2：本实施例与实施例1的不同之处在于，本实施例中除实施例1的全部操作步骤之外还包括如下操作：所述步骤g中，离心分离得到每份富里酸溶液时，则将所得的富里酸溶液用溶解有机碳测定仪器测定其溶解有机碳含量，若测得的溶解有机碳TOC>5mg/L，则将该离心分离的富里酸溶液对应的固态纯化腐殖酸亚组分重复步骤g的加酸搅拌静置操作，直到TOC<5mg/L后，再进行步骤h。
实施例3：本实施例与实施例1的不同之处在于，本实施例中中除实施例1的全部操作步骤之外还包括步骤i：将藻体腐殖酸亚组分1至藻体腐殖酸亚组分6分别在80-100℃下烘干24h后，测定所得的的灰分；如果其中某份藻体腐殖酸亚组分以干重计灰分大于0.1%，则将该藻体腐殖酸亚组分在氮气保护条件下，用0.1mol/L氢氧化钠溶解，加入去离子水使溶液腐殖酸浓度=1—3g/L后，调节pH=5-9，再加入浓盐酸、浓氢氟酸和去离子水，使固液比为1:10且盐酸浓度为0.1mol/L，氢氟酸浓度为0.3mol/L，持续搅拌4h，静置24h后，离心分离得固体后重复测定灰分，直到测得的灰分小于等于0.1%。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (6)
1.一种藻体中腐殖酸的分级提取方法，其特征在于，所述分级提取方法包括如下步骤：
步骤a、藻体预处理：
取风干后的藻体剔除杂物，烘干碾磨后过筛，得到藻体粉末；
步骤b、藻体索氏提取：
将藻体粉末置于索式提取器中，依次用乙醚、丙酮、95%乙醇、二氧杂环己烷和
去离子水为提取液进行索氏提取，所得固体标记为索提藻体；标记为；
步骤c、藻体氯化钙及酸洗：
用氯化钙溶液连续三次提取索提藻体，每次提取时固液比为1：10，在40-60oC条件下连续搅拌15-30min后，离心所得固体标记为氯化钙处理藻体；
用盐酸连续三次提取氯化钙处理藻体，每次提取时固液比为1：10，连续搅拌10-30min后，离心所得固体标记为盐酸处理藻体；
向盐酸处理藻体中加入去离子水，使固液比达到1：10，连续搅拌10-30min后，离心所得固体标记为水洗盐酸处理藻体；
步骤d、藻体碳酸钠处理：
用碳酸钠溶液连续三次提取水洗盐酸处理藻体，每次提取固液比为1：10，在30-45oC条件下连续搅拌30-60min后，离心所得固体标记为碳酸钠处理藻体；
向碳酸钠处理藻体中加入去离子水，使固液比达到1：10，连续搅拌10-30min后，离心所得固体标记为水洗碳酸钠处理藻体；
步骤e、藻体碱液提取：
向水洗碳酸钠处理藻体中加入去离子水，使溶液固液比达到1:3，用盐酸和氢氧化钠调节溶液pH值=6.0-8.0，在氮气保护下，向溶液中加入焦磷酸钠溶液，使溶液固液比为1:10且焦磷酸钠浓度为0.1mol/L，然后将溶液连续搅拌4-6h，静置20-28h后，离心分离分离，得到上层清液1及固体焦磷酸钠提取藻体1；
在氮气保护下，向焦磷酸钠提取藻体1中加入焦磷酸钠溶液，使溶液固液比为1:10且焦磷酸钠浓度为0.1mol/L，然后将溶液连续搅拌4-6h，静置20-28h后，离心分离，得到上层清液2及固体焦磷酸钠提取藻体2；
在氮气保护下，向焦磷酸钠提取藻体2中加入焦磷酸钠溶液，使溶液固液比为1:10且焦磷酸钠浓度为0.1mol/L，然后将溶液连续搅拌4-6h，静置20-28h后，离心分离，得到上层清液3及固体焦磷酸钠提取藻体3；
在氮气保护下，向焦磷酸钠提取藻体3中加入去离子水，使溶液固液比达到1:5，用盐酸和氢氧化钠调节溶液pH值=6.0-8.0，向溶液中加入氢氧化钠溶液，使溶液固液比为1:10且氢氧化钠浓度为0.1mol/L，然后将溶液连续搅拌4-6h，静置20-28h后，离心分离，得到上层清液4及固体氢氧化钠提取藻体1；
在氮气保护下，向氢氧化钠提取藻体1中加入氢氧化钠溶液，使溶液固液比为1:10且氢氧化钠浓度为0.1mol/L，然后将溶液连续搅拌4-6h，静置20-28h后，离心分离，得到上层清液5及固体氢氧化钠提取藻体2；
在氮气保护下，向氢氧化钠提取藻体2中加入氢氧化钠溶液，使溶液固液比为1:10且氢氧化钠浓度为0.1mol/L，然后将溶液连续搅拌4-6h，静置20-28h后，离心分离，得到上层清液6及固体氢氧化钠提取藻体3；
步骤f、藻体腐殖酸除硅：
用盐酸将步骤e中上层清液1-上层清液6进行酸化，分别调节每份溶液pH值=1.0，再分别向其中加入氢氟酸，使每份酸化液中的氢氟酸浓度为0.3mol/L，再分别搅拌4-6h，分别静置20-28h，离心所得固体标记为无硅腐殖酸亚组分溶液1-无硅腐殖酸亚组分溶液6，共计六份无硅腐殖酸亚组分溶液；
步骤g、藻体腐殖酸除富里酸：
向六份无硅腐殖酸亚组分溶液中分别加入0.1mol/L盐酸溶液，使溶液固液比均为1:10，持续搅拌4-6h，并静置20-28h后，再将每份溶液离心分离得到富里酸溶液及对应的固态纯化腐殖酸亚组分；其中，由无硅腐殖酸亚组分溶液1得到离心分离的富里酸溶液1及对应的固态纯化腐殖酸亚组分1；无硅腐殖酸亚组分溶液2得到离心分离的富里酸溶液2及对应的固态纯化腐殖酸亚组分2；无硅腐殖酸亚组分溶液3得到离心分离的富里酸溶液3及对应的固态纯化腐殖酸亚组分3；无硅腐殖酸亚组分溶液4得到离心分离的富里酸溶液4及对应的固态纯化腐殖酸亚组分4；无硅腐殖酸亚组分溶液5得到离心分离的富里酸溶液5及对应的固态纯化腐殖酸亚组分5；无硅腐殖酸亚组分溶液6得到离心分离的富里酸溶液6及对应的固态纯化腐殖酸亚组分6；
步骤h、藻体腐殖酸除盐及固化：
在氮气保护下，用氢氧化钠分别溶解固态纯化腐殖酸亚组分1至固态纯化腐殖酸亚组分6，用盐酸调节每份溶解液至pH=5-9，使每份溶解液的固液比均为1:2，共计得到六份腐殖酸亚组分溶液；
将六份腐殖酸亚组分溶液分别置入六个7000道尔顿透析袋，并将每个透析袋置于超纯水中，组成透析体系，每个透析体系均搅拌10-24h；再将每个透析袋中的腐殖酸亚组分溶液冷冻干燥，分别得到六份腐殖酸亚组分固体，分别命名为藻体腐殖酸亚组分1、藻体腐殖酸亚组分2、藻体腐殖酸亚组分3、藻体腐殖酸亚组分4、藻体腐殖酸亚组分5、藻体腐殖酸亚组分6。
2.根据权利要求1所述的藻体中腐殖酸的分级提取方法，其特征在于，所述步骤b中，
索提过程中，当采用其中一种索提液索提时，则每隔3-5h，在220nm波长的紫外可见光下测定索提液的吸光度，当测得的索提液的吸光度大于或等于0.01时，则继续该索提过程；当测得的吸光度小于0.01时，更换下一个索提液进行索提。
3.根据权利要求1所述的藻体中腐殖酸的分级提取方法，其特征在于，所述步骤g中，离心分离得到每份富里酸溶液时，则将所得的富里酸溶液用溶解有机碳测定仪器测定其溶解有机碳含量，若测得的溶解有机碳TOC>5mg/L，则将该离心分离的富里酸溶液对应的固态纯化腐殖酸亚组分重复步骤g的加酸搅拌静置操作，直到TOC<5mg/L后，再进行步骤h。
4.根据权利要求1所述的藻体中腐殖酸的分级提取方法，其特征在于，所述分级提取方法还包括步骤i：将藻体腐殖酸亚组分1至藻体腐殖酸亚组分6分别在80-100℃下烘干24h后，测定所得的的灰分；如果其中某份藻体腐殖酸亚组分以干重计灰分大于0.1%，则将该藻体腐殖酸亚组分在氮气保护条件下，用0.1mol/L氢氧化钠溶解，加入去离子水使溶液腐殖酸浓度=1—3g/L后，调节pH=5-9，再加入浓盐酸、浓氢氟酸和去离子水，使固液比为1:10且盐酸浓度为0.1mol/L，氢氟酸浓度为0.3mol/L，持续搅拌4h，静置24h后，离心分离得固体后重复测定灰分，直到测得的灰分小于等于0.1%。
5.根据权利要求1所述的藻体中腐殖酸的分级提取方法，其特征在于，所述步骤c中氯化钙溶液的质量百分数是1%。
6.根据权利要求1所述的藻体中腐殖酸的分级提取方法，其特征在于，所述步骤d中碳酸钠溶液的质量百分数是0.5%。
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