CN106397791A - 一种利用xad树脂柱及混合碱溶液提取藻体中腐殖酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用XAD树脂柱及混合碱溶液提取藻体中腐殖酸的方法。该方法包括以下步骤：a、酸洗藻体粉末；b、混合碱液提取腐殖酸；c、纯化腐殖酸。本发明提供了一种快速、高纯度地提取藻体中腐殖酸的方法。与现有技术相比，简化了提取工艺，缩短了提取时间，提取得到高纯度的固态腐殖酸，不使用有机溶剂，是一种环境友好型技术。
Description
技术领域
本发明属于天然有机质的分离提取技术领域，具体涉及一种利用XAD树脂柱及混合碱溶液提取藻体中腐殖酸的方法。
背景技术
腐殖酸是一种结构和组分十分复杂的天然大分子有机混合物，它在碱性和中性条件下可溶，在pH 1.0时不溶于水。腐殖酸是影响水体和土壤中碳、氮和磷等营养盐循环的因素之一。腐殖酸研究不仅是生物地球化学和环境科学研究的热点，而且是环境污染治理中必须面对的难点。水生生物中，特别是藻体中腐殖酸的提取对研究水体中腐殖酸的来源和归趋具有重要意义。
为了进一步的研究腐殖酸的结构和组成，科研工作者对腐殖酸的分离方法进行了报道。华中科技大学的李会杰在其硕士学位论文《腐殖酸和富里酸的提取与表征研究》(2012年)中对从不同季节不同湖泊采集到的底泥中提取到的腐殖酸和富里酸的提取方法及结构进行了讨论，其中采用氢氧化钠和焦磷酸钠的混合溶液提取其中的腐殖酸和富里酸的混合物，分离后分别对其进行纯化。专利申请文件《一种从泥煤中提取腐殖酸的方法》则探讨了通过调整并控制硝酸溶液与氢氧化钠或氢氧化钾溶液提取腐殖酸的方法。提取的腐殖酸的纯度达到80％以上。但由于不同来源(土壤、沉积物、水体、藻体)中杂质成分及含量，杂质和腐殖酸相互作用存在巨大差异。例如土壤中提取腐殖酸，杂质主要为无机矿物质；水体中提取腐殖酸，杂质主要为可溶离子；藻体中提取腐殖酸，杂质主要为有机脂肪、蛋白质及聚糖类物质。因此土壤、水体中分离提取腐殖酸的方法无法直接应用于提取藻体。Ghabbour EA等人于1994年发表在《应用藻类学杂志》(Journal of Applied Phycology)第6期第459-468页上的《从褐藻间囊藻中分离提取腐殖酸》(Isolation of humic acid fromthe brown alga Pilayella littoralis)；以及Radwan A等人于1997年发表在《应用藻类学杂志》(Journal of Applied Phycology)第8期第553-562页上的《从球型褐藻、墨角藻和糖昆布三种褐藻类及海生被子植物大叶藻中分离提取腐殖酸》(Isolation of humic acidfrom the brown algae Ascophyllum nodosum,Fucus vesiculosus,Laminariasaccharina and the marine angiosperm Zostera marina)；中国环境科学研究院的林樱在其硕士学位论文《土壤、沉积物以及蓝藻中有机质标准物质的提取与表征》(2011年)中第19-20页对太湖蓝藻有机质提取，均采用传统方法提取藻类植物中的腐殖酸。该方法主要包括：藻体索氏提取、藻体氯化钙及酸洗、藻体碳酸钠处理等步骤。申请人在之前的专利申请文件《一种藻体中腐殖酸的分级提取方法》(申请日2015.09.16，申请号201510586128.5)也采用类似的方法对取自胶州湾的褐藻样品进行了腐殖酸的分级提取。但上述4种藻体腐殖酸提取方法存在以下问题：1)藻体索氏提取过程中需要用到乙醚、丙酮、乙醇、二氧杂环己烷等多种易燃易爆有机溶剂，操作安全性差；2)整个索氏提取过程一般耗时约240-360小时，耗时过长；3)索氏提取使用大量有机溶剂，处理处置耗费物力和财力，如果处理不当极易造成环境污染。
因此，研发快速、高纯度和环境友好型的腐殖酸提取方法，是藻体中腐殖酸研究的首要问题。
发明内容
本发明的目的是能够克服现有技术中提取藻体中腐殖酸的方法存在的安全性差，耗时长，有机溶剂用量大，容易造成环境污染等问题，提供一种快速地提取高纯度的藻体中腐殖酸的方法。
为了实现上述发明目的，本发明提供了一种利用XAD树脂柱及混合碱溶液提取藻体中腐殖酸的方法，该方法包括以下步骤：
a、酸洗藻体粉末
向藻体粉末中加入去离子水，用酸调节得到pH＝1.0-3.0且固液比为1:8-10的固液混合液A，搅拌后静置，离心，得上层清液0和固体沉淀1；
b、混合碱液提取腐殖酸
1)向固体沉淀1中加入去离子水，用酸或碱调节得到pH＝6.0-8.0，得固液混合物B；
2)在氮气保护条件下，向固液混合物B中加入焦磷酸钠溶液和氢氧化钠溶液，得固液比为1:8-10、焦磷酸钠的浓度为0.05-0.2mol/L且氢氧化钠的浓度为0.05-0.2mol/L的固液混合物，搅拌后静置，离心，弃去下层固体沉淀，得上层清液与上层清夜0合并标记为上层清液1；
3)在氮气保护条件下，向上层清液1中加入酸使其pH＝1.0，搅拌后静置，离心弃去上层清液，得下层固体沉淀标记为粗提腐殖酸；
c、纯化腐殖酸
对粗提腐殖酸进行除硅、XAD-4树脂柱纯化、XAD-8树脂柱富集、除富里酸、除盐及固化后得腐殖酸固体粉末。
优选地，酸洗藻体粉末前对藻体进行以下预处理：将藻体剔除杂物，在45-60℃烘干，碾磨后过20-50目筛，得藻体粉末。
优选地，除硅步骤为：在氮气保护条件下，用含有0.1-0.3mol/L氢氧化钠和0.2-0.5mol/L氯化钠的溶液将粗提腐殖酸溶解，使其浓度为1-2g/L，搅拌15-40min后，离心，弃去下层固体沉淀，得上层清液2；
将上层清液2用盐酸酸化至pH＝1.0-2.0，再加入氢氟酸溶液，使氢氟酸浓度为0.2-0.5mol/L，搅拌后静置，离心，弃去上层清液，得下层固体沉淀标记为无硅腐殖酸。
优选地，XAD-4树脂柱纯化的步骤为：在氮气保护条件下，用0.1-0.3mol/L氢氧化钠溶液将无硅腐殖酸溶解，使溶液中的腐殖酸浓度为1-2g/L；用盐酸和氢氧化钠调节溶液pH＝1.0-3.0后，以10-15BV/h的速度流过XAD-4树脂柱，收集流出液并标记为流出液1。
优选地，XAD-8树脂柱富集的步骤为：用盐酸和氢氧化钠溶液，将流出液1的pH调节至1.0-3.0后，以10-15BV/h的速度流过XAD-8树脂，弃去流出液；
在氮气保护下，以3-5BV/h的速度，用1-3BV的pH＝12.0-13.0的氢氧化钠溶液淋洗XAD-8树脂柱，收集流出液并立即酸化至pH＝1.0-2.0，搅拌后静置，离心，得固体沉淀，标记为XAD-8腐殖酸。
优选地，除富里酸的步骤为：向XAD-8腐殖酸中加入0.1-0.3mol/L盐酸溶液，使固液混合物的固液比为1:8-10，搅拌后静置，离心，得上层清液3和固体沉淀标记为含盐腐殖酸。
优选地，除盐及固化的步骤为：在氮气保护下，用0.1-0.3mol/L的氢氧化钠溶液溶解含盐腐殖酸，使溶液中的腐殖酸浓度为1-2g/L，用盐酸溶液调节溶液pH＝5-9，得到含盐腐殖酸溶液；
将含盐腐殖酸溶液置入截留分子量为500-1000道尔顿的透析袋，并将透析袋置于超纯水中，组成透析体系，搅拌，使盐分通过透析袋进入超纯水，将透析袋中的腐殖酸溶液干燥得到腐殖酸固体粉末。
优选地，所述方法中的搅拌后静置步骤中，搅拌时间为0.5-6h，静置时间为20-26h。
进一步优选地，该方法还包括步骤d：
测定所述除富里酸步骤所得上层清液3的TOC值，如果TOC大于5mg/L，则重复除富里酸的步骤，直到TOC小于5mg/L。
进一步优选地，该方法还包括以下步骤e：
将除盐及固化步骤中透析体系搅拌20-26h后，用钼酸铵分光光度法和硝酸银法分别测定透析袋外溶液的磷含量和氯离子含量，如果磷含量大于0.01mg/L或者有氯化银存在，则更换透析体系中的超纯水，继续搅拌20-26h后，再次测定，重复多次，直到磷含量小于0.01mg/L且检测不到氯离子。
进一步优选地，该方法还包括步骤f：
将除盐及固化后得到的腐殖酸固体粉末在80-100℃下烘干20-40h后，在500-600℃下灼烧5-10h后测定所得的腐殖酸的灰分；
如果腐殖酸固体粉末以干重计灰分含量大于1.0％，则将该腐殖酸固体粉末在氮气保护条件下，在塑料容器中用0.1mol/L氢氧化钠溶解，加入去离子水使溶液中腐殖酸浓度为1-3g/L后，调节pH＝3-9，再加入盐酸、氢氟酸，使盐酸浓度为0.1mol/L且氢氟酸浓度为0.3mol/L的固液混合物，搅拌20-26h，离心分离得固体沉淀，重复除盐及固化步骤至腐殖酸以干重计灰分小于1.0％。
更进一步优选地，该方法中的离心的条件为：温度为20-40℃，转速为1000-3000r/min，离心时间为30-60min。
更进一步优选地，该方法中的干燥方法为冷冻干燥，所用干燥器的真空度为5-20Pa，冷阱温度为-20℃至-70℃，干燥后得到的固体腐殖酸的含水量不超过0.8％。
更进一步详细的，本发明公开的一种利用XAD树脂柱及混合碱溶液提取藻体中腐殖酸的方法，该方法包括以下步骤：
a、酸洗藻体粉末
向藻体粉末中加入去离子水，用6mol/L盐酸调节pH值，得到pH＝2.0且固液比为1:10的固液混合液A，搅拌后静置24h，离心，得上层清液0和固体沉淀1；
b、混合碱液提取腐殖酸
1)向固体沉淀1中加入去离子水，用盐酸或氢氧化钠调节得到pH＝6.0-8.0，得固液比为1:3-5的固液混合物B；
2)在氮气保护条件下，向固液混合物B中加入焦磷酸钠溶液和氢氧化钠溶液，得固液比为1:10、焦磷酸钠的浓度为0.1mol/L且氢氧化钠的浓度为0.05-0.3mol/L的固液混合物，搅拌4h后静置24h，离心，弃去下层固体沉淀，得上层清液与上层清夜0合并标记为上层清液1；
3)在氮气保护条件下，向上层清液1中加入6mol/L盐酸使其pH＝1.0，搅拌4h后静置24h，离心弃去上层清液，得下层固体沉淀标记为粗提腐殖酸；
c、纯化腐殖酸
除硅：在氮气保护条件下，用含有0.1mol/L氢氧化钠和0.3mol/L氯化钠的溶液将粗提腐殖酸溶解，使其浓度为1-2g/L，搅拌25min后，离心，弃去下层固体沉淀，得上层清液2；
将上层清液2用6mol/L盐酸酸化至pH＝1.0，再加入6mol/L氢氟酸溶液，使氢氟酸浓度为0.3mol/L，搅拌后静置，离心，弃去上层清液，得下层固体沉淀标记为无硅腐殖酸。
XAD-4树脂柱纯化：在氮气保护条件下，用0.1mol/L氢氧化钠溶液将无硅腐殖酸溶解，使溶液中的腐殖酸浓度为1-2g/L；用盐酸和氢氧化钠调节溶液pH＝2.0后，以15BV/h的速度流过XAD-4树脂柱，收集流出液并标记为流出液1。
XAD-8树脂柱富集：用6mol/L盐酸和6mol/L氢氧化钠溶液，将流出液1的pH调节至2.0后，以15BV/h的速度流过XAD-8树脂，弃去流出液；
在氮气保护条件下，以5BV/h的速度，用2BV的pH＝13.0的氢氧化钠溶液淋洗XAD-8树脂柱，收集流出液并立即酸化至pH＝1.0，搅拌后静置，离心，得固体沉淀，标记为XAD-8腐殖酸。
除富里酸：向XAD-8腐殖酸中加入0.1mol/L盐酸溶液，使固液混合物的固液比为1:10，搅拌后静置，离心，得上层清液3和固体沉淀标记为含盐腐殖酸。
腐殖酸除盐及固化：在氮气保护下，用0.1mol/L的氢氧化钠溶液溶解含盐腐殖酸，使溶液中的腐殖酸浓度为1-2g/L，用6mol/L盐酸溶液调节溶液pH＝5-9，得到含盐腐殖酸溶液；
将含盐腐殖酸溶液置入截留分子量为500-1000道尔顿的透析袋，并将透析袋置于超纯水中，组成透析体系，搅拌，使盐分通过透析袋进入超纯水，将透析袋中的腐殖酸溶液干燥得到腐殖酸固体粉末。
步骤a中对藻体进行酸洗，一方面根据富里酸和腐殖酸在特定pH条件下溶解度的不同，在除去部分酸溶性富里酸的同时，也不会过多损失其中的腐殖酸；另一方面能够除去酸溶性的钙、镁、铁、铝等离子，减少上述酸溶离子对焦磷酸钠和氢氧化钠提取过程的干扰，可以简化提取工艺；此外，酸洗后，部分腐殖酸进一步暴露出来，有利于腐殖酸的提取。
步骤b中利用焦磷酸钠和氢氧化钠的混合碱液提取藻体中的腐殖酸，与单一使用氢氧化钠或焦磷酸钠溶液提取的方法相比，能更完全的提取藻体中的腐殖酸；
与采用焦磷酸钠和氢氧化钠溶液依次进行提取的方法相比，减化了提取工艺，缩短了提取时间；还能避免因多次提取造成的腐殖酸的损失。
由于藻体中含有少量的硅杂质，可利用氢氟酸和溶液中的硅酸盐及硅单质反应，产生四氟合硅气体，从而除去腐殖酸样品中的含硅杂质。
由于藻体中含有更多的脂肪、蛋白质及聚糖等大分子物质；水溶性较强的有机酸或碱，如藻酸；另还有一些非腐殖物质，可利用XAD-4大孔树脂除去上述杂质。
利用透析袋的分离作用，使分子量较小的焦磷酸盐和氯离子扩散出透析袋，而分子量较大的腐殖酸被截流，从而达到腐殖酸除盐的作用，该除盐步骤简单、操作方便。
合适的干燥条件一方面能够保证较快地降低腐殖酸中的含水量，还能避免因高温度对腐殖酸结构造成的破坏。
与现有技术相比，本发明的技术方案具有以下的积极效果：
(1)采用酸洗和XAD-4树脂柱除杂相结合，在保证更好地除去酸溶性金属离子及在大分子物质、水溶性杂质的同时，简化了提取工艺，缩短了提取时间，相比索氏提取法，仅纯化步骤就可以缩短200个小时以上；减少了提取过程中有机溶剂的使用量，具有环境友好性。
(2)提取到的腐殖酸纯度高，可提取得到灰分含量小于1％，磷含量小于0.01mg/L，含水量不超过0.8％的腐殖酸。
具体实施方式
下面将结合具体实施例对本发明作进一步详细的阐述。本发明中出现的BV表示倍柱体积，BV/h表示倍柱体积每小时；本发明所出现的术语诸如“含量”、“含水量”，无特别说明的，均为重量百分含量；所述的固液比为固体质量与液体体积比。
本实施例中，藻体样品取自东海藻体；
XAD-4树脂；
XAD-8树脂；
透析袋；
氢氧化钠、盐酸和焦磷酸钠均为分析纯；
上述树脂及试剂均购自Sigma公司。
实施例1
藻体预处理：
将藻体剔除杂物，在50℃烘干，碾磨后过20目筛，得藻体粉末；
步骤a、酸洗藻体粉末
向藻体粉末中加入去离子水，用盐酸调节其pH＝2.0且固液比为1:10的固液混合物A，搅拌4h后静置24h，离心，得上层清液0和固体沉淀1。
b、混合碱液提取腐殖酸
1)向固体沉淀1中加入去离子水，用盐酸或氢氧化钠调节得到pH＝6.0-8.0，固液比为1:3的固液混合物B；
2)在氮气保护条件下，向固液混合物B中加入焦磷酸钠溶液和氢氧化钠溶液，使固液比为1:10且焦磷酸钠的浓度为0.1mol/L，氢氧化钠的浓度为0.1mol/L，搅拌4h后静置24h，离心，弃去下层固体沉淀，得上层清液与上层清夜0合并标记为上层清液1；
3)在氮气保护条件下，向上层清液1中加入6mol/L盐酸使其pH＝1.0，搅拌4h后静置24h，离心弃去上层清液，得下层固体沉淀标记为粗提腐殖酸。
c、纯化腐殖酸
对粗提腐殖酸进行除硅、XAD-4树脂柱纯化、XAD-8树脂柱富集、除富里酸、除盐及固化后得腐殖酸固体粉末；
所述除硅步骤为：在氮气保护条件下，用含有0.1mol/L氢氧化钠和0.3mol/L氯化钠的溶液将粗提腐殖酸溶解，使腐殖酸浓度为1-2g/L，，搅拌25min后，离心，弃去下层固体沉淀，得上层清液2；
将上层清液2用6mol/L盐酸酸化至pH＝1.0，再加入6mol/L氢氟酸溶液，使氢氟酸浓度为0.3mol/L，搅拌4h后静置24h，离心，弃去上层清液，得下层固体沉淀标记为无硅腐殖酸。
所述XAD-4树脂柱纯化步骤为：在氮气保护条件下，用0.1mol/L氢氧化钠将无硅腐殖酸溶解，使溶液中的腐殖酸浓度在1-2g/L；用盐酸和氢氧化钠调节溶液pH＝2.0后，以15BV/h的速度流过XAD-4树脂柱，收集流出液并标记为流出液1。
所述XAD-8树脂柱富集步骤为：用6mol/L盐酸和6mol/L氢氧化钠溶液，将流出液1的pH调节至2.0后，以15BV/h的速度流过XAD-8树脂，弃去流出液；
在氮气保护条件下，以5BV/h的速度，用2BV的pH＝13.0氢氧化钠溶液淋洗XAD-8树脂柱，收集流出液并立即酸化至pH＝1.0，搅拌4h后静置24h，离心，得固体沉淀，标记为XAD-8腐殖酸。
所述除富里酸步骤为：向XAD-8腐殖酸中加入0.1mol/L盐酸溶液，使固液比为1:8，搅拌4h后静置24h，离心，得上层清液3和固体沉淀标记为含盐腐殖酸。
所述除盐及固化步骤为：在氮气保护下，用0.1mol/L的氢氧化钠溶液溶解含盐腐殖酸，使溶液中的腐殖酸浓度为1-2g/L；用6mol/L盐酸溶液调节溶液pH＝5-9，得到含盐腐殖酸溶液；
将含盐腐殖酸溶液置入截留分子量为500-1000道尔顿的透析袋，并将透析袋置于超纯水中，组成透析体系，搅拌，使盐分通过透析袋进入超纯水，将透析袋中的腐殖酸溶液冷冻干燥得到腐殖酸固体粉末。
所述方法还包括：
步骤d：测定除富里酸步骤所得上层清液3的TOC值，如果TOC大于5mg/L，则重复除富里酸的步骤，直到TOC小于5mg/L；
步骤e：将除盐及固化步骤中透析体系搅拌24h后，用钼酸铵分光光度法和硝酸银法分别测定透析袋外溶液的磷含量和氯离子含量，如果磷含量大于0.01mg/L或者有氯化银存在，则更换透析体系中的超纯水，继续搅拌24h后，再次测定，重复多次，直到磷含量小于0.01mg/L且检测不到氯离子；
步骤f：将除盐及固化后得到的腐殖酸固体粉末在80℃下烘干40h后，在550℃下灼烧10h后测定所得的腐殖酸的灰分；
如果腐殖酸固体粉末以干重计灰分含量大于1.0％，则将该腐殖酸固体粉末在氮气保护条件下，在塑料容器中用0.1mol/L氢氧化钠溶解，加入去离子水使溶液中腐殖酸浓度为1-3g/L后，调节pH＝3-9，再加入盐酸、氢氟酸和去离子水，使固液比为1:10且盐酸浓度为0.1mol/L，氢氟酸浓度为0.3mol/L，搅拌24h，离心分离得固体沉淀，重复除盐及固化步骤至腐殖酸以干重计灰分含量小于1％。
其中，离心的条件为：温度为30℃，转速为1500r/min，离心时间为40min；冷冻干燥所用干燥器的真空度为12Pa，冷阱温度为-50℃，干燥后得到的固体腐殖酸的含水量不超过0.3％。
采用该方法，1000g藻体中能提取得到腐殖酸23.4g，灰分含量为0.2％。
由本发明提供的提取藻体中腐殖酸的方法，在保证纯度(灰分含量不大于1％)的情况下，需要时间不超过350h，而传统的提取方法(索氏提取法)整个工艺一般需时在600h以上，所以，本发明提供的提取藻体中腐殖酸的方法，缩短了提取时间，提高了提取效率。
对本实施例所得到的腐殖酸，利用元素分析法和13C-NMR光谱分析法对腐殖酸进行定量-半定量分析；利用FT-IR进行定性分析，分析结果如下：
元素分析结果显示，本实施例中提取到的藻体腐殖酸中碳(48.6％)、氢(5.8％)、氧(38.9％)和氮(4.3％)元素含量符合国际腐殖酸协会标准腐殖酸元素含量要求。
13C-NMR光谱分析显示，该方法提取的藻体腐殖酸均包含饱和脂肪碳峰(19.4％)、芳香碳(50.1％)和羧基碳(12.9％)。这与国际腐殖酸协会公布的腐殖酸13C-NMR谱图一致。
FT-IR光谱分析显示，该方法提取的藻体腐殖酸均包含羟基、烷基和羧基等官能团，这与国际腐殖酸协会标准腐殖酸红外光谱结论一致。
实施例2
本实施例中，藻体样品取自黄海藻体；
XAD-4树脂；
XAD-8树脂；
透析袋；
氢氧化钠、盐酸和焦磷酸钠均为分析纯；
上述树脂及试剂均购自Sigma公司。
藻体预处理：
将藻体剔除杂物，在45℃烘干，碾磨后过50目筛，得藻体粉末；
步骤a、酸洗藻体粉末
向藻体粉末中加入去离子水，用盐酸调节其pH＝1.0且固液比为1:9的固液混合物A，搅拌0.5h后静置20h，离心，得上层清液0和固体沉淀1。
b、混合碱液提取腐殖酸
1)向固体沉淀1中加入去离子水，用盐酸或氢氧化钠调节得到pH＝6.0-8.0，固液比为1:3的固液混合物B；
2)在氮气保护条件下，向固液混合物B中加入焦磷酸钠溶液和氢氧化钠溶液，使固液比为1:9且焦磷酸钠的浓度为0.05mol/L，氢氧化钠的浓度为0.2mol/L，搅拌0.5h后静置20h，离心，弃去下层固体沉淀，得上层清液与上层清夜0合并标记为上层清液1；
3)在氮气保护条件下，向上层清液1中加入盐酸使其pH＝1.0，搅拌0.5h后静置20h，离心弃去上层清液，得下层固体沉淀标记为粗提腐殖酸；
c、纯化腐殖酸
对粗提腐殖酸进行除硅、XAD-4树脂柱纯化、XAD-8树脂柱富集、除富里酸、除盐及固化后得腐殖酸固体粉末；
所述除硅步骤为：在氮气保护条件下，用含有0.2mol/L氢氧化钠和0.5mol/L氯化钠的溶液将粗提腐殖酸溶解，使其浓度为1-2g/L，搅拌15min后，离心，弃去下层固体沉淀，得上层清液2；
将上层清液2用盐酸酸化至pH＝1.0，再加入氢氟酸溶液，使氢氟酸浓度为0.2mol/L，搅拌0.5h后静置20h，离心，弃去上层清液，得下层固体沉淀标记为无硅腐殖酸。
所述XAD-4树脂柱纯化步骤为：在氮气保护条件下，用0.2mol/L氢氧化钠溶液将无硅腐殖酸溶解，使溶液中的腐殖酸浓度为1-2g/L；用盐酸和氢氧化钠调节溶液pH＝3.0后，以12BV/h的速度流过XAD-4树脂柱，收集流出液并标记为流出液1。
所述XAD-8树脂柱富集步骤为：用盐酸和氢氧化钠溶液，将流出液1的pH调节至3.0后，以12BV/h的速度流过XAD-8树脂，弃去流出液；
在氮气保护条件下，以4BV/h的速度，用1BV的pH＝12.0的氢氧化钠溶液淋洗XAD-8树脂柱，收集流出液并立即酸化至pH＝1.0，搅拌0.5h后静置20h，离心，得固体沉淀，标记为XAD-8腐殖酸。
所述除富里酸步骤为：向XAD-8腐殖酸中加入0.2mol/L盐酸溶液，使固液混合物的固液比为1:9，搅拌0.5h后静置20h，离心，得上层清液3和固体沉淀标记为含盐腐殖酸。
所述除盐及固化步骤为：在氮气保护下，用0.2mol/L的氢氧化钠溶液溶解含盐腐殖酸，使溶液中的腐殖酸浓度为1-2g/L，用盐酸溶液调节溶液pH＝5-9，得到含盐腐殖酸溶液；
将含盐腐殖酸溶液置入截留分子量为500-1000道尔顿的透析袋，并将透析袋置于超纯水中，组成透析体系，搅拌，使盐分通过透析袋进入超纯水，将透析袋中的腐殖酸溶液干燥得到腐殖酸固体粉末。
所述方法还包括：
步骤d：测定除富里酸步骤所得上层清液3的TOC值，如果TOC大于5mg/L，则重复除富里酸的步骤，直到TOC小于5mg/L；
步骤e：将除盐及固化步骤中透析体系搅拌20h后，用钼酸铵分光光度法和硝酸银法分别测定透析袋外溶液的磷含量和氯离子含量，如果磷含量大于0.01mg/L或者有氯化银存在，则更换透析体系中的超纯水，继续搅拌20h后，再次测定，重复多次，直到磷含量小于0.01mg/L且检测不到氯离子；
步骤f：将除盐及固化后得到的腐殖酸固体粉末在80℃下烘干32h后，在550℃下灼烧10h后测定所得的腐殖酸的灰分；
如果腐殖酸固体粉末以干重计灰分含量大于1.0％，则将该腐殖酸固体粉末在氮气保护条件下，在塑料容器中用0.1mol/L氢氧化钠溶解，加入去离子水使溶液中腐殖酸浓度为1-3g/L后，调节pH＝3-9，再加入盐酸、氢氟酸和去离子水，使固液比为1:9且盐酸浓度为0.1mol/L，氢氟酸浓度为0.3mol/L，搅拌26h，离心分离得固体沉淀，重复除盐及固化步骤至腐殖酸以干重计灰分含量小于1％。
其中，离心的条件为：温度为20℃，转速为1000r/min，离心时间为30min；冷冻干燥所用干燥器的真空度为5Pa，冷阱温度为-20℃，干燥后得到的固体腐殖酸的含水量不超过0.7％。
采用该方法，1000g藻体中能提取得到24.8g腐殖酸，腐殖酸中灰分含量为0.8％，含水量为0.5％。
由本发明提供的提取藻体中腐殖酸的方法，在保证纯度(灰分含量不大于1％)的情况下，需要时间不超过350h，而传统的提取方法(索氏提取法)整个工艺一般需时在600h以上，所以，本发明提供的提取藻体中腐殖酸的方法，缩短了提取时间，提高了提取效率。
对本实施例所得到的腐殖酸，利用元素分析法和13C-NMR光谱分析法对腐殖酸进行定量-半定量分析；利用FT-IR进行定性分析，分析结果如下：
元素分析结果显示，本实施例中提取到的藻体腐殖酸中碳(47.1％)、氢(5.3％)、氧(40.6％)和氮(5.0％)元素含量符合国际腐殖酸协会标准腐殖酸元素含量要求。
13C-NMR光谱分析显示，该方法提取的藻体腐殖酸均包含饱和脂肪碳峰(18.2％)、芳香碳(43.0％)和羧基碳(14.7％)。这与国际腐殖酸协会公布的腐殖酸13C-NMR谱图一致。
FT-IR光谱分析显示，该方法提取的藻体腐殖酸均包含羟基、烷基和羧基等官能团，这与国际腐殖酸协会标准腐殖酸红外光谱结论一致。
实施例3
本实施例中，藻体样品取自渤海藻体；
XAD-4树脂；
XAD-8树脂；
透析袋；
氢氧化钠、盐酸和焦磷酸钠均为分析纯；
上述树脂及试剂均购自Sigma公司。
预处理：将藻体剔除杂物，在60℃烘干，碾磨后过50目筛，得藻体粉末。
a、酸洗藻体粉末
向藻体粉末中加入去离子水，用盐酸调节得到pH＝3.0且固液比为1:8的固液混合物A，搅拌6h后静置26h，离心，弃去上层清液，得上层清液0和固体沉淀1。
b、混合碱液提取腐殖酸
1)向固体沉淀1中加入去离子水，用盐酸或氢氧化钠调节得到pH＝6.0-8.0，固液比为1:5的固液混合物B；
2)在氮气保护条件下，向固液混合物B中加入焦磷酸钠溶液和氢氧化钠溶液，使固液比为1:10且焦磷酸钠的浓度为0.2mol/L，氢氧化钠的浓度为0.05mol/L，搅拌6h后静置26h，离心，弃去下层固体沉淀，得上层清液与上层清夜0合并标记为上层清液1；
3)在氮气保护条件下，向上层清液1中加入盐酸使其pH＝1.0，搅拌6h后静置26h，离心弃去上层清液，得下层固体沉淀标记为粗提腐殖酸。
c、纯化腐殖酸
对粗提腐殖酸进行除硅、XAD-4树脂柱纯化、XAD-8树脂柱富集、除富里酸、除盐及固化后得腐殖酸固体粉末；
所述除硅步骤为：在氮气保护条件下，用含有0.3mol/L氢氧化钠和0.2mol/L氯化钠的溶液将粗提腐殖酸溶解，使其浓度为1-2g/L，搅拌40min后，离心，弃去下层固体沉淀，得上层清液2；
将上层清液2用盐酸酸化至pH＝1.0，再加入氢氟酸溶液，使氢氟酸浓度为0.5mol/L，搅拌6h后静置26h，离心，弃去上层清液，得下层固体沉淀标记为无硅腐殖酸。
所述XAD-4树脂柱纯化步骤为：在氮气保护条件下，用0.3mol/L氢氧化钠溶液将无硅腐殖酸溶解，使溶液中的腐殖酸浓度为1-2g/L；用盐酸和氢氧化钠调节溶液pH＝2.0后，以10BV/h的速度流过XAD-4树脂柱，收集流出液并标记为流出液1。
所述XAD-8树脂柱富集步骤为：用盐酸和氢氧化钠溶液，将流出液1的pH调节至2.0后，以10BV/h的速度流过XAD-8树脂，弃去流出液；
在氮气保护下，以3BV/h的速度，用3BV的pH＝13.0的氢氧化钠溶液淋洗XAD-8树脂柱，收集流出液并立即酸化至pH＝1.0，搅拌6h后静置26h，离心，得固体沉淀，标记为XAD-8腐殖酸。
所述除富里酸步骤为：向XAD-8腐殖酸中加入0.3mol/L盐酸溶液，使固液混合物的固液比为1:8，搅拌6h后静置26h，离心，得上层清液3和固体沉淀标记为含盐腐殖酸。
所述除盐及固化步骤为：在氮气保护下，用0.3mol/L的氢氧化钠溶液溶解含盐腐殖酸，使溶液中的腐殖酸浓度为1-2g/L，用盐酸溶液调节溶液pH＝5-9，得到含盐腐殖酸溶液；
将含盐腐殖酸溶液置入截留分子量为500-1000道尔顿的透析袋，并将透析袋置于超纯水中，组成透析体系，搅拌，使盐分通过透析袋进入超纯水，将透析袋中的腐殖酸溶液干燥得到腐殖酸固体粉末。
所述方法还包括：
步骤d：测定除富里酸步骤所得上层清液3的溶解有机碳含量TOC值，如果TOC大于5mg/L，则重复除富里酸的步骤，直到TOC小于5mg/L；
步骤e：将除盐及固化步骤中透析体系搅拌26h后，用钼酸铵分光光度法和硝酸银法分别测定透析袋外溶液的磷含量和氯离子含量，如果磷含量大于0.01mg/L或者有氯化银存在，则更换透析体系中的超纯水，继续搅拌26h后，再次测定，重复多次，直到磷含量小于0.01mg/L且检测不到氯离子；
步骤f：将除盐及固化后得到的腐殖酸固体粉末在100℃下烘干20h后，在600℃下灼烧5h后测定所得的腐殖酸的灰分；
如果腐殖酸固体粉末以干重计灰分含量大于1.0％，则将该腐殖酸固体粉末在氮气保护条件下，在塑料容器中用0.1mol/L氢氧化钠溶解，加入去离子水使溶液中腐殖酸浓度为1-3g/L后，调节pH＝3-9，再加入盐酸、氢氟酸和去离子水，使固液比为1:8且盐酸浓度为0.1mol/L，氢氟酸浓度为0.3mol/L，搅拌20h，离心分离得固体沉淀，重复除盐干燥、除磷、氯离子至腐殖酸以干重计灰分含量小于1％。
其中，离心的条件为：温度为40℃，转速为3000r/min，离心时间为60min；冷冻干燥所用干燥器的真空度为20Pa，冷阱温度为-70℃，干燥后得到的固体腐殖酸的含水量小于0.5％。
采用该方法，1000g藻体中能提取得到23.8g腐殖酸，灰分含量为0.2％，含水量为0.4％。
由本发明提供的提取藻体中腐殖酸的方法，在保证纯度(灰分含量不大于1％)的情况下，需要时间不超过350h，而传统的提取方法(索氏提取法)整个工艺一般需时在600h以上，所以，本发明提供的提取藻体中腐殖酸的方法，缩短了提取时间，提高了提取效率。
对本实施例所得到的腐殖酸，利用元素分析法和13C-NMR光谱分析法对腐殖酸进行定量-半定量分析；利用FT-IR进行定性分析，分析结果如下：
元素分析结果显示，本实施例中提取到的藻体腐殖酸中碳(51.8％)、氢(6.4％)、氧(34.5％)和氮(5.2％)元素含量符合国际腐殖酸协会标准腐殖酸元素含量要求。
13C-NMR光谱分析显示，该方法提取的藻体腐殖酸均包含饱和脂肪碳峰(25.6％)、芳香碳(37.3％)和羧基碳(17.5％)。这与国际腐殖酸协会公布的腐殖酸13C-NMR谱图一致。
FT-IR光谱分析显示，该方法提取的藻体腐殖酸均包含羟基、烷基和羧基等官能团，这与国际腐殖酸协会标准腐殖酸红外光谱结论一致。
实施例4
一种利用XAD树脂柱及混合碱溶液提取藻体中腐殖酸的方法，该方法包括以下步骤：
预处理：酸洗藻体粉末前对藻体进行以下预处理：将藻体剔除杂物，在45-60℃烘干，碾磨后过20-50目筛，得藻体粉末。
a、酸洗藻体粉末
向藻体粉末中加入去离子水，用酸调节得到pH＝1.0-3.0且固液比为1:8-10的固液混合液A，搅拌后静置，离心，得上层清液0和固体沉淀1；
b、混合碱液提取腐殖酸
1)向固体沉淀1中加入去离子水，用酸或碱调节得到pH＝6.0-8.0，得固液混合物B；
2)在氮气保护条件下，向固液混合物B中加入焦磷酸钠溶液和氢氧化钠溶液，得固液比为1:8-10、焦磷酸钠的浓度为0.05-0.2mol/L且氢氧化钠的浓度为0.05-0.2mol/L的固液混合物，搅拌后静置，离心，弃去下层固体沉淀，得上层清液与上层清夜0合并标记为上层清液1；
3)在氮气保护条件下，向上层清液1中加入酸使其pH＝1.0，搅拌后静置，离心弃去上层清液，得下层固体沉淀标记为粗提腐殖酸；
c、纯化腐殖酸
对粗提腐殖酸进行除硅、XAD-4树脂柱纯化、XAD-8树脂柱富集、除富里酸、除盐及固化后得腐殖酸固体粉末。
其中，所述除硅步骤为：在氮气保护条件下，用含有0.1-0.3mol/L氢氧化钠和0.2-0.5mol/L氯化钠的溶液将粗提腐殖酸溶解，使其浓度为1-2g/L，搅拌15-40min后，离心，弃去下层固体沉淀，得上层清液2；
将上层清液2用盐酸酸化至pH＝1.0-2.0，再加入氢氟酸溶液，使氢氟酸浓度为0.2-0.5mol/L，搅拌后静置，离心，弃去上层清液，得下层固体沉淀标记为无硅腐殖酸。
所述XAD-4树脂柱纯化的步骤为：在氮气保护条件下，用0.1-0.3mol/L氢氧化钠溶液将无硅腐殖酸溶解，使溶液中的腐殖酸浓度为1-2g/L；用盐酸和氢氧化钠调节溶液pH＝1.0-3.0后，以10-15BV/h的速度流过XAD-4树脂柱，收集流出液并标记为流出液1。
所述XAD-8树脂柱富集的步骤为：用盐酸和氢氧化钠溶液，将流出液1的pH调节至1.0-3.0后，以10-15BV/h的速度流过XAD-8树脂，弃去流出液；
在氮气保护下，以3-5BV/h的速度，用1-3BV的pH＝12.0-13.0的氢氧化钠溶液淋洗XAD-8树脂柱，收集流出液并立即酸化至pH＝1.0-2.0，搅拌后静置，离心，得固体沉淀，标记为XAD-8腐殖酸。
所述除富里酸的步骤为：向XAD-8腐殖酸中加入0.1-0.3mol/L盐酸溶液，使固液混合物的固液比为1:8-10，搅拌后静置，离心，得上层清液3和固体沉淀标记为含盐腐殖酸。
所述除盐及固化的步骤为：在氮气保护下，用0.1-0.3mol/L的氢氧化钠溶液溶解含盐腐殖酸，使溶液中的腐殖酸浓度为1-2g/L，用盐酸溶液调节溶液pH＝5-9，得到含盐腐殖酸溶液；
将含盐腐殖酸溶液置入截留分子量为500-1000道尔顿的透析袋，并将透析袋置于超纯水中，组成透析体系，搅拌，使盐分通过透析袋进入超纯水，将透析袋中的腐殖酸溶液干燥得到腐殖酸固体粉末。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (10)
1.一种利用XAD树脂柱及混合碱溶液提取藻体中腐殖酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：
a、酸洗藻体粉末
向藻体粉末中加入去离子水，用酸调节得到pH＝1.0-3.0且固液比为1:8-10的固液混合物A，搅拌后静置，离心，得上层清液0和固体沉淀1；
b、混合碱液提取腐殖酸
1)向固体沉淀1中加入去离子水，用酸或碱调节得到pH＝6.0-8.0，得固液混合物B；
2)在氮气保护条件下，向固液混合物B中加入焦磷酸钠溶液和氢氧化钠溶液，得固液比为1:8-10、焦磷酸钠的浓度为0.05-0.2mol/L且氢氧化钠的浓度为0.05-0.2mol/L的固液混合物，搅拌后静置，离心，弃去下层固体沉淀，得上层清液与上层清夜0合并标记为上层1；
3)在氮气保护条件下，向上层清液1中加入酸使其pH＝1.0，搅拌后静置，离心弃去上层清液，得下层固体沉淀标记为粗提腐殖酸；
c、纯化腐殖酸
对粗提腐殖酸进行除硅、XAD-4树脂柱纯化、XAD-8树脂柱富集、除富里酸、除盐及固化后得腐殖酸固体粉末。
2.根据权利要求1中所述的方法，其特征在于，酸洗藻体粉末前对藻体进行以下预处理：将藻体剔除杂物，在45-60℃烘干，碾磨后过20-50目筛，得藻体粉末。
3.根据权利要求1中所述的方法，其特征在于，所述除硅步骤为：在氮气保护条件下，用含有0.1-0.3mol/L氢氧化钠和0.2-0.5mol/L氯化钠的溶液将粗提腐殖酸溶解，使其浓度为1-2g/L，搅拌15-40min后，离心，弃去下层固体沉淀，得上层清液2；
将上层清液2用盐酸酸化至pH＝1.0-2.0，再加入氢氟酸溶液，使氢氟酸浓度为0.2-0.5mol/L，搅拌后静置，离心，弃去上层清液，得下层固体沉淀标记为无硅腐殖酸；
所述XAD-4树脂柱纯化的步骤为：在氮气保护条件下，用0.1-0.3mol/L氢氧化钠溶液将无硅腐殖酸溶解，使溶液中的腐殖酸浓度为1-2g/L；用盐酸和氢氧化钠调节溶液pH＝1.0-3.0后，以10-15BV/h的速度流过XAD-4树脂柱，收集流出液并标记为流出液1；
所述XAD-8树脂柱富集的步骤为：用盐酸和氢氧化钠溶液，将流出液1的pH调节至1.0-3.0后，以10-15BV/h的速度流过XAD-8树脂，弃去流出液；
在氮气保护下，以3-5BV/h的速度，用1-3BV的pH＝12.0-13.0的氢氧化钠溶液淋洗XAD-8树脂柱，收集流出液并立即酸化至pH＝1.0-2.0，搅拌后静置，离心，得固体沉淀，标记为XAD-8腐殖酸；
所述除富里酸的步骤为：向XAD-8腐殖酸中加入0.1-0.3mol/L盐酸溶液，使固液混合物的固液比为1:8-10，搅拌后静置，离心，得上层清液3和固体沉淀标记为含盐腐殖酸。
4.根据权利要求1中所述的方法，其特征在于，所述除盐及固化的步骤为：在氮气保护下，用0.1-0.3mol/L的氢氧化钠溶液溶解含盐腐殖酸，使溶液中的腐殖酸浓度为1-2g/L，用盐酸溶液调节溶液pH＝5-9，得到含盐腐殖酸溶液；
将含盐腐殖酸溶液置入截留分子量为500-1000道尔顿的透析袋，并将透析袋置于超纯水中，组成透析体系，搅拌，使盐分通过透析袋进入超纯水，将透析袋中的腐殖酸溶液干燥得到腐殖酸固体粉末。
5.根据权利要求3中所述的方法，其特征在于，还包括步骤d：测定所述除富里酸步骤所得上层清液3的TOC值，如果TOC大于5mg/L，则重复除富里酸的步骤，直到TOC小于5mg/L。
6.根据权利要求4中所述的方法，其特征在于，还包括以下步骤e：
将除盐及固化步骤中的透析体系搅拌20-26h后，用钼酸铵分光光度法和硝酸银法分别测定透析袋外溶液的磷含量和氯离子含量，如果磷含量大于0.01mg/L或者有氯化银存在，则更换透析体系中的超纯水，继续搅拌20-26h后，再次测定，重复多次，直到磷含量小于0.01mg/L且检测不到氯离子。
7.根据权利要求4中所述的方法，其特征在于，还包括步骤f：
将除盐及固化后得到的腐殖酸固体粉末在80-100℃下烘干20-40h后，在500-600℃下灼烧5-10h后测定所得的腐殖酸的灰分；
如果腐殖酸固体粉末以干重计灰分含量大于1.0％，则将该腐殖酸固体粉末在氮气保护条件下，在塑料容器中用0.1mol/L氢氧化钠溶解，加入去离子水使溶液中腐殖酸浓度为1-3g/L后，调节pH＝3-9，再加入盐酸、氢氟酸，使盐酸浓度为0.1mol/L且氢氟酸浓度为0.3mol/L的固液混合物，搅拌20-26h，离心分离得固体沉淀，重复除盐及固化步骤至腐殖酸以干重计灰分小于1.0％。
8.根据权利要求1-7中所述的方法，其特征在于，该方法中所述的搅拌后静置步骤中，搅拌时间为0.5-6h，静置时间为20-26h。
9.根据权利要求1-7中所述的方法，其特征在于，该方法中的离心的条件为：温度为20-40℃，转速为1000-3000r/min，离心时间为30-60min。
10.根据权利要求1中所述的方法，其特征在于，该方法中的干燥方法为冷冻干燥，所用干燥器的真空度为5-20Pa，冷阱温度为-20℃至-70℃，干燥后得到的固体腐殖酸的含水量不超过0.8％。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| CB03 | Change of inventor or designer information | ||
| CB03 | Change of inventor or designer information |
Inventor after: Bai Yingchen Inventor after: Wu Fengchang Inventor after: Wei Yuan Inventor after: Chen Haiyan Inventor after: Wu Bin Inventor after: Tang Zhi Inventor after: Li Chen Inventor after: Mu Yunsong Inventor after: Song Fanhao Inventor before: Bai Yingchen Inventor before: Wu Fengchang Inventor before: Wu Bin Inventor before: Tang Zhi Inventor before: Li Chen Inventor before: Mu Yunsong Inventor before: Song Fanhao |
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| GR01 | Patent grant | ||
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| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
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Granted publication date: 20171128 Termination date: 20181021 |