CN105203358B - 一种水体中腐殖酸亚组分的分级提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种水体中腐殖酸亚组分的分级提取方法，所述分级提取方法包括如下步骤：步骤a：水样预处理、步骤b：水体腐殖酸的树脂吸附、步骤c：腐殖酸亚组分分级洗脱、步骤d：腐殖酸亚组分除硅、步骤e：腐殖酸亚组分除杂酸、步骤f：水体腐殖酸亚组分除盐及固化。通过上述方式，本发明能够从水体中提取腐殖酸亚组分溶液，并利用树脂分离技术对腐殖酸亚组分进行分级，纯化后，最终得到分级的固态腐殖酸亚组分。
Description
技术领域
本发明涉及腐殖酸亚组分分离提取技术，具体涉及一种水体中腐殖酸亚组分的分级提取方法。
背景技术
腐殖酸（humic acid）是由动植物残体经过复杂的物理、化学、生物过程形成的大分子有机混合物，它广泛存在于水体、沉积物等环境介质中。腐殖酸能溶于碱性和中性溶液，不溶于酸，是水体有机质重要组成部分。
腐殖酸中含有大量活性官能团如羧基、酚羟基、羰基、氨基和巯基，从而具有很高的反应活性，在水环境中具有重要作用。例如腐殖酸能与水中的有毒重金属离子和有机污染物（如农药，PPCPs和PAHs）发生相互作用，从而改变其迁移、转化规律和生物有效性。由于腐殖酸的组成和结构极其复杂，其元素组成、化学结构随着时空不同而发生变化。为了更近一步的研究腐殖酸的结构和组成，前人将腐殖酸进行分级分离，从而减小其异质性，取得一系列成果。腐殖酸的分级分离方法分为两类，一类是连续提取类方法，即按一定的顺序依次向固体介质（如土壤）中加入腐殖酸提取剂，实现腐殖酸亚组分的分级分离；一类是连续洗脱类方法，即将提取出的腐殖酸吸附到树脂柱上，用不同淋洗液进行淋洗，实现腐殖酸亚组分的分级分离。前人对土壤腐殖酸分级研究较为广泛。如Kang等用焦磷酸钠和氢氧化钠溶液从土壤中连续提取腐殖酸亚组分，施国兰等进一步发展了这一提取方法。Yonebayashi和Hattori使用连续洗脱类方法分离土壤中腐殖酸亚组分，且提取中使用了有机溶解包括：柠檬酸、三异丙基乙磺酰等，这可能造成腐殖酸亚组分结构的改变，并且难以定量估算有机溶剂在腐殖酸亚组分样品中的残留量，存在巨大缺陷。然而，对于水体中腐殖酸亚组分的分级提取未见相关报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种水体中腐殖酸亚组分的分级提取方法，该方法能够克服现有技术对腐殖酸亚组分分级提取过程的不足，获得腐殖酸各级亚组分。
本发明利用XAD-8树脂吸附水体中腐殖酸亚组分，后用不同pH值的焦磷酸钠缓冲液进行洗脱，实现腐殖酸亚组分的分级提取。提取及分级过程中不涉及有机溶剂，在提取完成后，可以通过测定腐殖酸亚组分中各个元素含量，对可能的无机残留进行定量，保障了腐殖酸亚组分的纯净。
本发明公开的技术方案如下：一种水体中腐殖酸亚组分的分级提取方法，所述分级提取方法包括如下步骤：
步骤a：水样预处理：
用孔径在0.20-0.60 μm之间的滤膜依次过滤水样，所得滤液标记为水体样品；
步骤b：水体腐殖酸的树脂吸附：
用碱和酸调节水体样品pH=2.0-4.0，以10-15倍柱体积/h的流速通过树脂柱，弃去流出液；
步骤c：腐殖酸亚组分分级洗脱：
以5-10倍柱体积/h的速度，用pH=3的焦磷酸钠缓冲液淋洗树脂柱，每收集2-50 ml流出液，用特定波长紫外/可见光进行测定，流出液的紫外/可见吸光值先增大后减小，当流出液紫外/可见吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=3的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH= 1，搅拌4 h后，静置24h，离心得到固体，标记为腐殖酸亚组分1；
以5-10倍柱体积/h的速度，用pH=5的焦磷酸钠缓冲液淋洗树脂柱，每收集2-50 ml流出液，用特定波长紫外/可见光进行测定，流出液的紫外/可见吸光值先增大后减小，当流出液紫外/可见吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=5的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH= 1，搅拌4 h后，静置24h，离心得到固体，标记为腐殖酸亚组分2；
以5-10倍柱体积/h的速度，用pH=7的焦磷酸钠缓冲液淋洗树脂柱，每收集2-50 ml流出液，用特定波长紫外/可见光进行测定，流出液的紫外/可见吸光值先增大后减小，当流出液紫外/可见吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=7的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH= 1，搅拌4 h后，静置24h，离心得到固体，标记为腐殖酸亚组分3；
氮气保护下，以5-10倍柱体积/h的速度，用pH=9的焦磷酸钠缓冲液淋洗树脂柱，每收集2-50 ml流出液，用特定波长紫外/可见光进行测定，流出液的紫外/可见吸光值先增大后减小，当流出液紫外/可见吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=9的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH= 1，搅拌4 h后，静置24h，离心得到固体，标记为腐殖酸亚组分4；
氮气保护下，以5-10倍柱体积/h的速度，用pH=11的焦磷酸钠缓冲液淋洗树脂柱，每收集2-50 ml流出液，用特定波长紫外/可见光进行测定，流出液的紫外/可见吸光值先增大后减小，当流出液紫外/可见吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=11的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH= 1，搅拌4 h后，静置24h，离心得到固体，标记为腐殖酸亚组分5；
氮气保护下，以5-10倍柱体积/h的速度，用pH=13的焦磷酸钠缓冲液淋洗树脂柱，每收集2-50 ml流出液，用特定波长紫外/可见光进行测定，流出液的紫外/可见吸光值先增大后减小，当流出液紫外/可见吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=13的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH= 1，搅拌4 h后，静置24h，离心得到固体，标记为腐殖酸亚组分6；
步骤d：腐殖酸亚组分除硅：
将腐殖酸亚组分1至腐殖酸亚组分6，共计六份，分别用含有0.1mol/L 氢氧化钠和0.3 mol/L 氯化钠的溶液溶解，使腐殖酸亚组分浓度为1-2 g/L， 高速离心分离，得到上层清液六份；将六份上层清液分别用盐酸酸化至pH=1.0，持续搅拌4 h，静置24 h，离心得固体六份，依次标记为第一次纯化腐殖酸亚组分1至第一次纯化腐殖酸亚组分6；
向第一次纯化腐殖酸亚组分1至第一次纯化腐殖酸亚组分6中分别加入混合酸液使其固液比为1:10，持续搅拌4 h，静置24 h，离心分离得固体标记为无硅腐殖酸亚组分1至无硅腐殖酸亚组分6；
步骤e：腐殖酸亚组分除杂酸：
向无硅腐殖酸亚组分1至无硅腐殖酸亚组分6中分别加入0.1 mol/L的盐酸，使溶液固液比均为1:10，均持续搅拌4 h，得到六份固液混合物，将六份固液混合物分别静置24h后离心分离，最终得到六份固体及对应的六份上层清液，将六份固体分别标记为纯化腐殖酸亚组分1至纯化腐殖酸亚组分6，六份上层清液分别标记为上清液1至上清液6 ；其中：无硅腐殖酸亚组分1的固液混合物分离得到纯化腐殖酸亚组分1与上清液1，无硅腐殖酸亚组分2的固液混合物分离得到纯化腐殖酸亚组分2与上清液2，其余依次类推；步骤f：水体腐殖酸亚组分除盐及固化：
在氮气保护下，用0.1 mol/L的氢氧化钠分别溶解纯化腐殖酸亚组分1至纯化腐殖酸亚组分6，使每份溶液固液体积比均为1:2，用浓盐酸分别调节溶液pH=4，共计得到六份纯化腐殖酸亚组分溶液；
将六份纯化腐殖酸亚组分溶液分别置入六个截留分子量为10000道尔顿透析袋中，并将每个透析袋置于超纯水中，组成透析体系，搅拌24 h，盐分通过透析袋进入超纯水，将每个透析袋中的腐殖酸亚组分溶液冷冻干燥得到六份腐殖酸亚组分固体，分别命名为固态腐殖酸亚组分1至固态腐殖酸亚组分6。
优选的，所述分级提取方法中，所述步骤e中所得上层清液用溶解有机碳测定仪器测定其溶解有机碳含量，如果上层清液中溶解有机碳TOC> 2mg/L，则将该上层清液对应的纯化腐殖酸亚组分重复步骤e操作，直到得到的上层清液中的TOC<2 mg/L后，再进行步骤f。
优选的，所述步骤f中透析体系搅拌24 h后，用钼酸铵分光光度法和硝酸银法分别测定步骤f中透析袋外液体中总磷的含量和氯离子含量，如果总磷含量>0.01 mg/L或者有氯化银存在，则多次更换透析体系中的超纯水，每次加入去离子水，搅拌24 h后，再次测定透析袋外液体中总磷的含量和氯离子含量，直到总磷含量<0.01 mg/L且检测不到氯离子。
优选的，所述分级提取方法还包括步骤g：将步骤f所得的固态腐殖酸亚组分1至固体腐殖酸亚组分6分别在80-100℃下烘干20-40 h后，测定灰分；
如果某固态腐殖酸亚组分灰分大于1.0%，以干重计，则用该固态腐殖酸亚组分重复操作步骤d、e和f，直到其灰分小于1.0%。
优选的，所述分级提取方法还包括步骤h：将步骤f所得的固态腐殖酸亚组分1至固体腐殖酸亚组分6分别在80-100℃下烘干20-40 h后，用钼酸铵分光光度法测定所得灰分的磷含量，如果磷含量大于0.1%，则将该固体腐殖酸亚组分重复步骤f的操作，直到得到的固体腐殖酸亚组分磷含量<0.1%。
本发明中采用XAD-8树脂柱进行分离，XAD-8树脂柱内的填充物是XAD-8大孔径树脂。
本发明中步骤a中，优选的，利用0.45μm和0.22μm孔径的滤膜去除水体中漂浮物、水藻藻体、及悬浮物颗粒。优选的，滤膜采用玻璃纤维滤膜。
本发明步骤b中，优选的，采用氢氧化钠和盐酸调节水体样品。
本发明步骤d中，优选的，所述混合酸液采用的是0.1mol/L盐酸和0.3mol/L氢氟酸的混合酸。
本发明步骤d中将用含有0.1mol/L 氢氧化钠和0.3 mol/L 氯化钠的溶液溶解腐殖酸亚组分后，高速离心分离，是为了去除碱不溶的腐殖酸亚组分杂质；
本发明步骤d中加入氢氟酸的操作是：利用氢氟酸和硅酸盐及硅单质反应，生产四氟合硅气体，从而去除腐殖酸亚组分中的含硅杂质。
本发明步骤e中固体中加入0.1 mol/L 盐酸后，固液混合物的pH=1.0，此时腐殖酸亚组分为沉淀，富里酸等杂酸可溶。用0.1mol/L 盐酸，去除杂酸不损失腐殖酸亚组分；
本发明的有益效果是：本发明水体中腐殖酸亚组分的分级提取方法能够克服现有技术对腐殖酸亚组分分级提取过程的不足，获得纯度较高的腐殖酸各级亚组分，便于对水体天然有机质的研究。
具体实施方式
下面对本发明的较佳实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。
实施例1：北京郊区湖泊水体中腐殖酸亚组分的分级提取：
于2015年6月份取北京湖泊水体样品，水体中含有大量植物落叶和水体微生物等；
XAD-8树脂柱；Sigma公司；
氢氧化钠：分析纯；盐酸：分析纯；
本实施例的具体提取步骤如下：
一种水体中腐殖酸亚组分的分级提取方法，所述分级提取方法包括如下步骤：
步骤a：水样预处理：
用孔径为0.45μm的玻璃纤维滤膜依次过滤水样，所得滤液标记为水体样品；水体样品2000 L；
步骤b：水体腐殖酸的树脂吸附：
用6 mol/L的氢氧化钠和6 mol/L的盐酸调节水体样品pH=2.0，以15倍柱体积/h的流速通过XAD-8树脂柱，弃去流出液；
步骤c：腐殖酸亚组分分级洗脱：
以5倍柱体积/h的速度，用pH=3的焦磷酸钠缓冲液淋洗XAD-8树脂柱，每收集2-50ml流出液，用450nm测定流出液吸光度，流出液的紫外/可见吸光值先增大后减小，当流出液紫外/可见吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=3的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH= 1，搅拌4 h后，静置24h，离心得到12.0 g固体，标记为腐殖酸亚组分1；
以5倍柱体积/h的速度，用pH=5的焦磷酸钠缓冲液淋洗树脂柱，每收集2-50 ml流出液，用450nm测定流出液吸光度，流出液的紫外/可见吸光值先增大后减小，当流出液紫外/可见吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=5的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH= 1，搅拌4 h后，静置24h，离心得到8.8 g固体，标记为腐殖酸亚组分2；
以5倍柱体积/h的速度，用pH=7的焦磷酸钠缓冲液淋洗树脂柱，每收集2-50 ml流出液，用450nm测定流出液吸光度，流出液的紫外/可见吸光值先增大后减小，当流出液紫外/可见吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=7的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH= 1，搅拌4 h后，静置24h，离心得到7.9 g固体，标记为腐殖酸亚组分3；
氮气保护下，以5倍柱体积/h的速度，用pH=9的焦磷酸钠缓冲液淋洗树脂柱，每收集2-50 ml流出液，用450nm测定流出液吸光度，流出液的紫外/可见吸光值先增大后减小，当流出液紫外/可见吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=9的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH= 1，搅拌4 h后，静置24h，离心得到2.4 g固体，标记为腐殖酸亚组分4；
氮气保护下，以5倍柱体积/h的速度，用pH=11的焦磷酸钠缓冲液淋洗树脂柱，每收集2-50 ml流出液，用450nm测定流出液吸光度，流出液的紫外/可见吸光值先增大后减小，当流出液紫外/可见吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=11的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH= 1，搅拌4 h后，静置24h，离心得到1.25 g固体，标记为腐殖酸亚组分5；
氮气保护下，以5倍柱体积/h的速度，用pH=13的焦磷酸钠缓冲液淋洗树脂柱，每收集2-50 ml流出液，用450nm测定流出液吸光度，流出液的紫外/可见吸光值先增大后减小，当流出液紫外/可见吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=13的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH= 1，搅拌4 h后，静置24h，离心得到0.52 g固体，标记为腐殖酸亚组分6；
步骤d：腐殖酸亚组分除硅：
将腐殖酸亚组分1至腐殖酸亚组分6，共计6份，分别用含有0.1mol/L 氢氧化钠和0.3 mol/L 氯化钠的溶液溶解，使腐殖酸亚组分浓度为1g/L, 高速离心分离，得到上层清液6份；将6份上层清液分别用6 mol/L盐酸酸化至pH=1.0，持续搅拌4 h，静置24 h，离心得固体6份，分别为11.8g、8.1g、7.7g、2.7g、1.3g、052g，依次标记为第一次纯化腐殖酸亚组分1、第一次纯化腐殖酸亚组分2、第一次纯化腐殖酸亚组分3，直至第一次纯化腐殖酸亚组分6；
向第一次纯化腐殖酸亚组分1至第一次纯化腐殖酸亚组分6中分别加入混合酸液使其固液比为1:10，所述混合酸液是由0.1mol/的盐酸和0.3 mol/L的氢氟酸组成的；将溶液持续搅拌4 h，静置24 h，离心分离得固体标记为无硅腐殖酸亚组分1至无硅腐殖酸亚组分6，每份约11.9g、8.2g、7.8g、2.7g、 1.3g、0.55g；
步骤e：腐殖酸亚组分除杂酸：
向无硅腐殖酸亚组分1至无硅腐殖酸亚组分6中分别加入0.1 mol/L的盐酸，使溶液固液比均为1:10，均持续搅拌4 h，得到六份固液混合物，将六份固液混合物分别静置24h后离心分离，得到6份固体及对应的6份上层清液，将六份固体分别标记为纯化腐殖酸亚组分1至纯化腐殖酸亚组分6 ，六份上层清液分别标记为上清液1至上清液6；其中：无硅腐殖酸亚组分1的固液混合物分离得到纯化腐殖酸亚组分1与上清液1，无硅腐殖酸亚组分2的固液混合物分离得到纯化腐殖酸亚组分2与上清液2，其余依次类推；该步骤中所得的6份上层清液分别用溶解有机碳测定仪器测定其溶解有机碳含量，如果某份上层清液中溶解有机碳TOC> 2mg/L，则将该上层清液的纯化腐殖酸亚组分重复步骤e操作，直到得到的上层清液中的TOC<2 mg/L后，再进行步骤f；
步骤f：水体腐殖酸亚组分除盐及固化：
在氮气保护下，用0.1 mol/L的氢氧化钠分别溶解纯化腐殖酸亚组分1至纯化腐殖酸亚组分6，使每份溶液固液体积比均为1:2，用1 mol/L浓盐酸分别调节溶液pH=4，共计得到6份纯化腐殖酸亚组分溶液；
将6份纯化腐殖酸亚组分溶液分别置入6个截留分子量为10000道尔顿透析袋中，并将每个透析袋置于超纯水中，组成透析体系，搅拌24 h，盐分通过透析袋进入超纯水，将每个透析袋中的腐殖酸亚组分溶液冷冻干燥得到6份腐殖酸亚组分固体，每份克数是分别为6.5g，4.9g，3.6g，1.3g，0.9g，0.45g，分别命名为固态腐殖酸亚组分1至固态腐殖酸亚组分6；
上述步骤f中透析体系搅拌24 h后，用钼酸铵分光光度法和硝酸银法分别测定步骤f中透析袋外液体中总磷的含量和氯离子含量，如果总磷含量>0.01 mg/L或者有氯化银存在，则多次更换透析体系中的超纯水，每次加入去离子水，搅拌24 h后，再次测定透析袋外液体中总磷的含量和氯离子含量，直到总磷含量<0.01 mg/L且检测不到氯离子；
步骤h：将步骤f所得的固态腐殖酸亚组分1至固体腐殖酸亚组分6分别在80-100℃下烘干20-40 h后，测定灰分；
如果某固态腐殖酸亚组分灰分大于1.0%，以干重计，则用该固态腐殖酸亚组分重复操作步骤d、e和f，直到其灰分小于1.0%。
步骤i：将步骤f所得的固态腐殖酸亚组分1至固体腐殖酸亚组分6分别在80-100℃下烘干20-40 h后，用钼酸铵分光光度法测定所得灰分的磷含量，如果磷含量大于0.1%，则将该固体腐殖酸亚组分重复步骤f的操作，直到得到的固体腐殖酸亚组分磷含量<0.1%。
本实施例中，最终得到水体腐殖酸亚组分1 为6.5g、腐殖酸亚组分2 为4.9g、腐殖酸亚组分3 为3.6g、腐殖酸亚组分4 为1.34g、腐殖酸亚组分5为0.9 2g、腐殖酸亚组分6 为0.45g。
结合腐殖酸自身特点，利用元素分析法和13C-NMR光谱分析法对腐殖酸亚组分进行定量-半定量分析；利用FTIR、UV-Vis和三维荧光光谱对腐殖酸亚组分进行定性分析，结果如下：
元素分析结果显示，该方法提取的水体腐殖酸亚组分中碳、氢、氧、硫元素含量及碳氢元素比、碳氧元素比，符合国际腐殖酸协会标准腐殖酸元素含量要求。FTIR光谱分析显示，该方法提取的水体腐殖酸亚组分均包含羟基、烷基和羧基等官能团，这与国际腐殖酸协会标准腐殖酸红外光谱结论一致。UV-Vis光谱分析显示，该方法提取的水体腐殖酸亚组分紫外吸光度均随着紫外波长增大而降低，紫外光谱符合指数递减规律，这与国际腐殖酸协会标准腐殖酸紫外光谱结论一致。13C-NMR光谱分析显示，该方法提取的水体腐殖酸亚组分均包含饱和脂肪碳峰、烷氧基碳、芳香碳、羧基碳，这与国际腐殖酸协会标准腐殖酸一致。三维荧光光谱分析显示，该方法提取的水体腐殖酸亚组分的三维荧光光谱峰均坐落于水体类腐殖酸荧光峰范围，与国际腐殖酸协会标准腐殖酸一致。
进一步分析表明：该方法提取的不同腐殖酸亚组分中的氢碳元素比存在明显变化，腐殖酸亚组分1-6的氢碳元素比分别为0.63、0.72、0.76、0.82、0.97、1.02；
13C-NMR光谱分析结果显示，该方法提取的不同腐殖酸亚组分中的羧基碳比例存在明显变化，腐殖酸亚组分1-6的羧基碳比例为19.7、18.9、15.6、13.7、12.7、12.1；
该方法提取的不同腐殖酸亚组分中的芳香碳含量存在明显变化，腐殖酸亚组分1-6的芳香碳比例为40.9、41.1、47.9、52.1、40.86/40.75。
实施例2：本实施例与实施例1的不同之处在于，本实施例中，步骤a水样预处理时，用孔径在0.20-0.60μm之间的滤膜依次过滤水样，将所得滤液标记为水体样品。
本实施例步骤c中，以10倍柱体积/h的速度，用不同pH值的焦磷酸钠缓冲液淋洗树脂柱。
实施例3：本实施例与实施例1的不同之处在于，本实施例步骤c中，以8倍柱体积/h的速度，用不同pH值的焦磷酸钠缓冲液淋洗树脂柱。
实施例4：本实施例与实施例1的不同之处在于，本实施例步骤b中将腐殖酸亚组分1至腐殖酸亚组分6，共计6份，分别用含有0.1mol/L 氢氧化钠和0.3 mol/L 氯化钠的溶液溶解，使腐殖酸亚组分浓度为1-2 g/L，高速离心分离，得到上层清液6份。
实施例5：一种水体中腐殖酸亚组分的分级提取方法，所述分级提取方法包括如下步骤：
步骤a：水样预处理：用孔径在0.20-0.60μm之间的滤膜依次过滤水样，所得滤液标记为水体样品；
步骤b：水体腐殖酸的树脂吸附：用碱和酸调节水体样品pH=2.0-4.0，以10-15倍柱体积/h的流速通过树脂柱，弃去流出液；本步骤中，所述的碱是氢氧化钠，所述的酸是盐酸。
步骤c：腐殖酸亚组分分级洗脱：以5-10倍柱体积/h的速度，用pH=3的焦磷酸钠缓冲液淋洗树脂柱，每收集2-50 ml流出液，用特定波长紫外/可见光进行测定，流出液的紫外/可见吸光值先增大后减小，当流出液紫外/可见吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=3的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH= 1，搅拌4 h后，静置24h，离心得到固体，标记为腐殖酸亚组分1；
以5-10倍柱体积/h的速度，用pH=5的焦磷酸钠缓冲液淋洗树脂柱，每收集2-50 ml流出液，用特定波长紫外/可见光进行测定，流出液的紫外/可见吸光值先增大后减小，当流出液紫外/可见吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=5的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH= 1，搅拌4 h后，静置24h，离心得到固体，标记为腐殖酸亚组分2；
以5-10倍柱体积/h的速度，用pH=7的焦磷酸钠缓冲液淋洗树脂柱，每收集2-50 ml流出液，用特定波长紫外/可见光进行测定，流出液的紫外/可见吸光值先增大后减小，当流出液紫外/可见吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=7的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH= 1，搅拌4 h后，静置24h，离心得到固体，标记为腐殖酸亚组分3；
氮气保护下，以5-10倍柱体积/h的速度，用pH=9的焦磷酸钠缓冲液淋洗树脂柱，每收集2-50 mL流出液，用特定波长紫外/可见光进行测定，流出液的紫外/可见吸光值先增大后减小，当流出液紫外/可见吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=9的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH= 1，搅拌4 h后，静置24h，离心得到固体，标记为腐殖酸亚组分4；
氮气保护下，以5-10倍柱体积/h的速度，用pH=11的焦磷酸钠缓冲液淋洗树脂柱，每收集2-50 ml流出液，用特定波长紫外/可见光进行测定，流出液的紫外/可见吸光值先增大后减小，当流出液紫外/可见吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=11的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH= 1，搅拌4 h后，静置24h，离心得到固体，标记为腐殖酸亚组分5；
氮气保护下，以5-10倍柱体积/h的速度，用pH=13的焦磷酸钠缓冲液淋洗树脂柱，每收集2-50 ml流出液，用特定波长紫外/可见光进行测定，流出液的紫外/可见吸光值先增大后减小，当流出液紫外/可见吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=13的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH= 1，搅拌4 h后，静置24h，离心得到固体，标记为腐殖酸亚组分6；
步骤d：腐殖酸亚组分除硅：将腐殖酸亚组分1至腐殖酸亚组分6，共计6份，分别用含有0.1mol/L 氢氧化钠和0.3 mol/L 氯化钠的溶液溶解，使腐殖酸亚组分浓度为1-2 g/L，高速离心分离，得到上层清液6份；将6份上层清液分别用盐酸酸化至pH=1.0，持续搅拌4h，静置24 h，离心得固体6份，依次标记为第一次纯化腐殖酸亚组分1至第一次纯化腐殖酸亚组分6；
向第一次纯化腐殖酸亚组分1至第一次纯化腐殖酸亚组分6中分别加入混合酸液使其固液比为1:10，持续搅拌4 h，静置24 h，离心分离得固体标记为无硅腐殖酸亚组分1至无硅腐殖酸亚组分6；
步骤e：腐殖酸亚组分除杂酸：
向无硅腐殖酸亚组分1至无硅腐殖酸亚组分6中分别加入0.1 mol/L的盐酸，使溶液固液比均为1:10，均持续搅拌4 h，得到六份固液混合物，将六份固液混合物分别静置24h后离心分离，最终得到六份固体及对应的六份上层清液，将六份固体分别标记为纯化腐殖酸亚组分1至纯化腐殖酸亚组分6，六份上层清液分别标记为上清液1至上清液6 ；其中：无硅腐殖酸亚组分1的固液混合物分离得到纯化腐殖酸亚组分1与上清液1，无硅腐殖酸亚组分2的固液混合物分离得到纯化腐殖酸亚组分2与上清液2，其余依次类推；
步骤f：水体腐殖酸亚组分除盐及固化：在氮气保护下，用0.1 mol/L的氢氧化钠分别溶解纯化腐殖酸亚组分1至纯化腐殖酸亚组分6，使每份溶液固液体积比均为1:2，用浓盐酸分别调节溶液pH=4，共计得到6份纯化腐殖酸亚组分溶液；
将6份纯化腐殖酸亚组分溶液分别置入6个截留分子量为10000道尔顿透析袋中，并将每个透析袋置于超纯水中，组成透析体系，搅拌24 h，盐分通过透析袋进入超纯水，将每个透析袋中的腐殖酸亚组分溶液冷冻干燥得到6份腐殖酸亚组分固体，分别命名为固态腐殖酸亚组分1至固态腐殖酸亚组分6；
步骤g：将步骤f所得的固态腐殖酸亚组分1至固体腐殖酸亚组分6分别在80-100℃下烘干20-40 h后，测定灰分；如果某固态腐殖酸亚组分的灰分大于1.0%，以干重计，则用该固态腐殖酸亚组分重复操作步骤d、e和f，直到其灰分小于1.0%。
所述分级提取方法中，所述步骤e中所得的6份上层清液分别用溶解有机碳测定仪器测定其溶解有机碳含量，如果某份上层清液中溶解有机碳TOC> 2mg/L，则将该上层清液对应的纯化腐殖酸亚组分重复步骤e操作，直到得到的上层清液中的TOC<2 mg/L后，再进行步骤f。
所述步骤f中透析体系搅拌24 h后，用钼酸铵分光光度法和硝酸银法分别测定步骤f中透析袋外液体中总磷的含量和氯离子含量，如果总磷含量>0.01 mg/L或者有氯化银存在，则多次更换透析体系中的超纯水，每次加入去离子水，搅拌24 h后，再次测定透析袋外液体中总磷的含量和氯离子含量，直到总磷含量<0.01 mg/L且检测不到氯离子。
实施例6：本实施例与实施例5的不同之处在于，本实施例中，所述分级提取方法还包括步骤h：将步骤f所得的固态腐殖酸亚组分1至固体腐殖酸亚组分6分别在80-100℃下烘干20-40 h后，用钼酸铵分光光度法测定所得灰分的磷含量，如果磷含量大于0.1%，则将该固体腐殖酸亚组分重复步骤f的操作，直到得到的固体腐殖酸亚组分磷含量<0.1%。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (5)
1.一种水体中腐殖酸亚组分的分级提取方法，其特征在于，所述分级提取方法包括如下步骤：
步骤a：水样预处理：
用孔径在0.20-0.60μm之间的滤膜过滤水样，所得滤液标记为水体样品；
步骤b：水体腐殖酸的树脂吸附：
用碱和酸调节水体样品pH=2.0-4.0，以10-15倍柱体积/h的流速通过树脂柱，弃去流出液；
步骤c：腐殖酸亚组分分级洗脱：
以5-10倍柱体积/h的速度，用pH=3的焦磷酸钠缓冲液淋洗树脂柱，每收集2-50ml流出液，用特定波长紫外/可见光进行测定，流出液的紫外/可见吸光值先增大后减小，当流出液紫外/可见吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=3的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH=1，搅拌4h后，静置24h，离心得到固体，标记为腐殖酸亚组分1；
以5-10倍柱体积/h的速度，用pH=5的焦磷酸钠缓冲液淋洗树脂柱，每收集2-50ml流出液，用特定波长紫外/可见光进行测定，流出液的紫外/可见吸光值先增大后减小，当流出液紫外/可见吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=5的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH=1，搅拌4h后，静置24h，离心得到固体，标记为腐殖酸亚组分2；
以5-10倍柱体积/h的速度，用pH=7的焦磷酸钠缓冲液淋洗树脂柱，每收集2-50ml流出液，用特定波长紫外/可见光进行测定，流出液的紫外/可见吸光值先增大后减小，当流出液紫外/可见吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=7的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH=1，搅拌4h后，静置24h，离心得到固体，标记为腐殖酸亚组分3；
氮气保护下，以5-10倍柱体积/h的速度，用pH=9的焦磷酸钠缓冲液淋洗树脂柱，每收集2-50mL流出液，用特定波长紫外/可见光进行测定，流出液的紫外/可见吸光值先增大后减小，当流出液紫外/可见吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=9的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH=1，搅拌4h后，静置24h，离心得到固体，标记为腐殖酸亚组分4；
氮气保护下，以5-10倍柱体积/h的速度，用pH=11的焦磷酸钠缓冲液淋洗树脂柱，每收集2-50ml流出液，用特定波长紫外/可见光进行测定，流出液的紫外/可见吸光值先增大后减小，当流出液紫外/可见吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=11的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH=1，搅拌4h后，静置24h，离心得到固体，标记为腐殖酸亚组分5；
氮气保护下，以5-10倍柱体积/h的速度，用pH=13的焦磷酸钠缓冲液淋洗树脂柱，每收集2-50ml流出液，用特定波长紫外/可见光进行测定，流出液的紫外/可见吸光值先增大后减小，当流出液紫外/可见吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=13的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH=1，搅拌4h后，静置24h，离心得到固体，标记为腐殖酸亚组分6；
步骤d：腐殖酸亚组分除硅：
将腐殖酸亚组分1至腐殖酸亚组分6，共计六份，分别用含有0.1mol/L氢氧化钠和0.3mol/L氯化钠的溶液溶解，使腐殖酸亚组分浓度为1-2g/L，高速离心分离，得到上层清液六份；将六份上层清液分别用盐酸酸化至pH=1.0，持续搅拌4h，静置24h，离心得固体六份，依次标记为第一次纯化腐殖酸亚组分1至第一次纯化腐殖酸亚组分6；
向第一次纯化腐殖酸亚组分1至第一次纯化腐殖酸亚组分6中分别加入混合酸液使其固液比为1:10，持续搅拌4h，静置24h，离心分离得固体标记为无硅腐殖酸亚组分1至无硅腐殖酸亚组分6；
步骤e：腐殖酸亚组分除杂酸：
向无硅腐殖酸亚组分1至无硅腐殖酸亚组分6中分别加入0.1mol/L的盐酸，使溶液固液比均为1:10，均持续搅拌4h，得到六份固液混合物，将六份固液混合物分别静置24h后离心分离，最终得到六份固体及对应的六份上层清液，将六份固体分别标记为纯化腐殖酸亚组分1至纯化腐殖酸亚组分6，六份上层清液分别标记为上清液1至上清液6；其中：无硅腐殖酸亚组分1的固液混合物分离得到纯化腐殖酸亚组分1与上清液1，无硅腐殖酸亚组分2的固液混合物分离得到纯化腐殖酸亚组分2与上清液2，其余依次类推；
步骤f：水体腐殖酸亚组分除盐及固化：
在氮气保护下，用0.1mol/L的氢氧化钠分别溶解纯化腐殖酸亚组分1至纯化腐殖酸亚组分6，使每份溶液固液体积比均为1:2，用浓盐酸分别调节溶液pH=4，共计得到六份纯化腐殖酸亚组分溶液；
将六份纯化腐殖酸亚组分溶液分别置入六个截留分子量为10000道尔顿透析袋中，并将每个透析袋置于超纯水中，组成透析体系，搅拌24h，盐分通过透析袋进入超纯水，将每个透析袋中的腐殖酸亚组分溶液冷冻干燥得到六份腐殖酸亚组分固体，分别命名为固态腐殖酸亚组分1至固态腐殖酸亚组分6。
2.根据权利要求1所述的水体中腐殖酸亚组分的分级提取方法，其特征在于，所述分级提取方法中，所述步骤e中所得的六份上层清液分别用溶解有机碳测定仪器测定其溶解有机碳含量，如果某份上层清液中溶解有机碳TOC>2mg/L，则将该上层清液对应的纯化腐殖酸亚组分重复步骤e操作，直到得到的上层清液中的TOC<2mg/L后，再进行步骤f。
3.根据权利要求1所述的水体中腐殖酸亚组分的分级提取方法，其特征在于，所述步骤f中透析体系搅拌24h后，用钼酸铵分光光度法和硝酸银法分别测定步骤f中透析袋外液体中总磷的含量和氯离子含量，如果总磷含量>0.01mg/L或者有氯化银存在，则多次更换透析体系中的超纯水，每次加入去离子水，搅拌24h后，再次测定透析袋外液体中总磷的含量和氯离子含量，直到总磷含量<0.01mg/L且检测不到氯离子。
4.根据权利要求1所述的水体中腐殖酸亚组分的分级提取方法，其特征在于，所述分级提取方法还包括步骤g：将步骤f所得的固态腐殖酸亚组分1至固态腐殖酸亚组分6分别在80-100℃下烘干20-40h后，测定灰分；
如果某固态腐殖酸亚组分的灰分大于1.0%，以干重计，则用该固态腐殖酸亚组分重复操作步骤d、e和f，直到其灰分小于1.0%。
5.根据权利要求1所述的水体中腐殖酸亚组分的分级提取方法，其特征在于，所述分级提取方法还包括步骤h：将步骤f所得的固态腐殖酸亚组分1至固态腐殖酸亚组分6分别在80-100℃下烘干20-40h后，用钼酸铵分光光度法测定所得灰分的磷含量，如果磷含量大于0.1%，则将该固态腐殖酸亚组分重复步骤f的操作，直到得到的固态腐殖酸亚组分磷含量<0.1%。
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