CN108743962A - 一种基于荧光碳点修饰的树状大分子的双载药靶向纳米平台的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于荧光碳点修饰的树状大分子的双载药靶向纳米平台的制备方法，包括：碳点制备，荧光碳点负载阿霉素的药物缓释体系制备，RGD‑PEG‑COOH制备，RGD靶向的功能化的树状大分子G5‑PEG‑RGD制备，G5‑RGD‑TPGS制备，CDs/DOX@G5‑RGD‑TPGS制备。本发明得到的(CDs/DOX)@G5‑RGD‑TPGS双载药纳米颗粒具有良好的水溶性和生物相容性，对整合素αvβ3受体表达的肿瘤细胞具有靶向性，对肿瘤细胞有明显的抑制效果的同时可以降低细胞内ATP的水平，阻碍药物泵出，同时可用于癌细胞的荧光成像，具有诊疗一体化性能。
Description
技术领域
本发明属于功能性杂化纳米材料的制备领域，特别涉及一种基于荧光碳点修饰的树状大分子的双载药靶向纳米平台的制备方法。
背景技术
荧光成像技术具有较高的时间/空间分辨率，较高的软组织对比度，获得信息丰富并且价格低廉等优点。而有机染料或半导体量子点等荧光分子制备方法繁琐，价格昂贵，环境不友好并且易发生光漂白。因此，发展一种新型的，环境友好的荧光分子是目前荧光成像的发展趋势之一。
碳点(carbon dots)是一种具有荧光性能，尺寸在10nm以下的球形纳米材料，自身能够发出明亮的荧光(Miao,P.,et al.,Nanoscale,2015.7(5):p.1586-1595)。作为新兴的荧光纳米材料，碳点具有优异的特性，例如低毒性、生物相容性好、水溶性好、稳定性高和高度荧光可调性。因此，在生物成像领域，碳点表现出极大的应用潜力。已有文献报道通过天冬氨酸和葡萄糖合成靶向碳点用于体内脑胶质瘤的精准荧光成像(Zheng,M.,et al.,AcsNano 2015,9,11455-11461.)以及碳点作为药物载体负载抗癌药物DOX抑制肿瘤的生长(Zeng,Q.H.,et al.,J.Mater.Chem.B,2016,4,5119-5126.)。
但是药物在杀死肿瘤细胞的同时易引发肿瘤患者对其产生多药耐药性(Multidrug Resistance，MDR)，最终导致失败。因此逆转肿瘤多药耐药成为提高肿瘤抑制率的关键。目前肿瘤多药耐药的发生机制较为明确的是肿瘤细胞过度表达P-糖蛋白而引起的肿瘤多药耐药(Yun,U.,J.,et al.,Biochem.Pharmacol,2013,85(10):1441-1453.)。P-糖蛋白可以利用ATP水解释放的能量将一系列结构和功能不同的底物(包括抗癌药物，如紫杉醇、阿霉素、长春新碱等)排出细胞外，从而使肿瘤细胞产生肿瘤多药耐药(Baumert C.,et al.,Bioorg.Med.Chem,2013,21(1):166-177.)。聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯(TPGS)是一种有效的P-糖蛋白抑制剂，它通过与P-糖蛋白上非转运活性位点结合，导致P-糖蛋白构象改变，进而丧失转运功能。已有文献报道在纳米载药体系中负载TPGS，则可以很大程度上逆转肿瘤多药耐药性(Xie,J.,et al.,ACS Appl.Mater.Interfaces,2017,9(16):14281-14291.)。
树状大分子(dendrimer)以其分子结构的高度分散性，可精准控制的三维结构和经修饰后的良好的生物相容性，可以用作纳米载体或支架，为肿瘤的早期诊断和多种抗肿瘤药物的传递的设计提供了可能。目前已有文献报道第五代树状大分子修饰alpha-tos与靶向分子RGD可以有效抑制肿瘤的生长(Jingyi Zhu.,et al.,Colloids Surf.,B,2015,133,36-42.)以及树状大分子负载荧光碳点用于荧光成像(Matai,I.,et al.,ACSAppl.Mater.Interfaces,2015,7,11423-11435.)。通过功能化树状大分子形成的杂化纳米材料不仅表现出树状大分子的特性，同时也表现出修饰的功能性分子特有的性质，在诊疗一体化纳米材料方面有着广泛的用途。
目前检索国内外文献有关树状大分子负载抗癌药物的文献和专利结果表明：没有将连接有抗癌药物DOX的碳点与P-糖蛋白抑制剂TPGS和靶向分子RGD同时连接到第五代树状大分子上实现双载药纳米平台并抑制肿瘤生长的报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种基于荧光碳点修饰的树状大分子的双载药靶向纳米平台的制备方法，该方法简单，易于操作分离，成本低廉，得到的双载药靶向纳米平台具有良好的水溶性和生物相容性，对整合素αvβ3受体表达的肿瘤细胞具有靶向性，对肿瘤细胞有明显的抑制效果的同时可以降低细胞内ATP水平，阻碍药物泵出，同时可用于癌细胞的荧光成像。
本发明的一种基于荧光碳点修饰的树状大分子的双载药靶向纳米平台的制备方法，包括：(1)将柠檬酸钠和碳酸氢铵以质量比为0.2-0.5:1.2-1.5溶解于超纯水中，水热反应，自然冷却至室温，过滤除去过度碳化的颗粒，干燥，得到碳点；其中柠檬酸钠与超纯水的比例为0.2g-0.5g:10mL；
(2)将盐酸阿霉素DOX·HCl溶于溶剂中，加入三乙胺，逐滴加入到步骤(1)中碳点的水溶液中，避光敞口搅拌，离心，取上清液冷冻干燥，得到荧光碳点负载阿霉素的药物缓释体系CDs/DOX，其中盐酸阿霉素与碳点的质量比为1-1.2:1，三乙胺与溶剂的体积比为1:30-80；
(3)将RGD多肽溶液逐滴加入到MAL-PEG-COOH中，搅拌反应，透析，冷冻干燥，得到RGD-PEG-COOH，其中RGD多肽与MAL-PEG-COOH的摩尔比为1:1-2；
(4)将步骤(3)中RGD-PEG-COOH溶于溶剂中，得到RGD-PEG-COOH溶液，加入EDC溶液，搅拌，加入NHS溶液，继续搅拌，得到混合溶液，逐滴加入第五代聚酰胺-胺树状大分子G5-NH2溶液中，搅拌反应，透析，冷冻干燥，得到RGD靶向的功能化的树状大分子G5-PEG-RGD，其中EDC、NHS与RGD-PEG-COOH的摩尔比为9-11:9-11:1，RGD-PEG-COOH与G5-NH2的摩尔比为4-6:1，RGD-PEG-COOH溶液度为3-5mg/mL；
(5)在聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯TPGS溶液中加入N,N'-羰基二咪唑CDI溶液，搅拌，然后逐滴加入步骤(4)中G5-PEG-RGD的溶液，继续搅拌反应，透析，冷冻干燥，得到G5-RGD-TPGS，其中CDI与TPGS的摩尔比为19-25:1，TPGS与G5-PEG-RGD的摩尔比为14-16:1；
(6)将步骤(5)中G5-RGD-TPGS的溶液中加入步骤(2)中CDs/DOX的溶液，搅拌，透析，冷冻干燥，得到基于荧光碳点修饰的树状大分子的双载药靶向纳米平台CDs/DOX@G5-RGD-TPGS，其中G5-RGD-TPGS与CDs/DOX的质量比为1-1.2:1。
所述步骤(1)中水热反应温度为170℃-190℃，水热反应时间为3-5h；过滤是用220nm的微孔滤膜。
所述步骤(2)中溶剂为甲醇；碳点的水溶液浓度为1-3mg/mL；DOX·HCl的分子量为579.99g/mol。
所述步骤(2)中避光搅拌时间为12-24h。
所述步骤(3)中MAL-PEG-COOH的浓度为3-5mg/mL，MAL-PEG-COOH的分子量为2000g/mol。
所述步骤(3)中RGD多肽溶液浓度为1-2mg/mL，溶剂为DMSO，RGD多肽的分子量为706.67g/mol。
所述步骤(3)中搅拌反应时间为2-4d。
所述步骤(4)中溶剂为DMSO；EDC·HCl溶液、NHS溶液和G5-NH2溶液的溶剂均为DMSO。
所述步骤(4)中G5-NH2的分子量为26010g/mol。
所述步骤(4)中EDC溶液浓度为3-8mg/mL；NHS溶液浓度为3-6mg/mL；G5-NH2溶液浓度为2-4mg/mL。
所述步骤(4)中搅拌时间为15-30min，搅拌温度为室温；继续搅拌时间为2-3h；搅拌反应时间为2-4d。
所述步骤(5)中TPGS溶液和G5-PEG-RGD的溶液的溶剂均为DMSO。
所述步骤(5)中TPGS溶液浓度为2-5mg/mL；G5-PEG-RGD的溶液浓度为1-3mg/mL；CDI溶液浓度为2-4mg/mL。
所述步骤(5)中CDI的分子量为162.15g/mol；TPGS的分子量为1513g/mol。
所述步骤(5)中搅拌时间为4-6h；搅拌温度为室温；继续搅拌反应时间为2-4d。
所述步骤(3)、(4)、(5)中透析为：用截留分子量为5000的纤维素透析膜在超纯水(2L/次，3次/天)中透析3天。
所述步骤(6)中CDs/DOX的溶液浓度为1-4mg/mL；G5-RGD-TPGS溶液浓度为1-4mg/mL；搅拌时间为12-24h，搅拌温度为室温。
所述步骤(6)中CDs/DOX@G5-RGD-TPGS应用于肺癌细胞A549的荧光成像和化疗中，包括：
(1)利用杂化纳米颗粒(CDs/DOX)@G5-RGD-TPGS用于肺癌细胞A549的荧光成像；
(2)利用杂化纳米颗粒(CDs/DOX)@G5-RGD-TPGS用于肺癌细胞A549的化学治疗以及逆转肿瘤多药耐药性得到化疗增强的效果。
本发明利用一步水热法合成能发射蓝色荧光的碳点并负载抗癌药物阿霉素DOX得到复合物CDs/DOX；在氨基末端的树状大分子上通过酰胺键修饰靶向分子RGD并连接抗癌药物TPGS得到复合物G5-RGD-TPGS；将CDs/DOX纳米材料与G5-RGD-TPGS纳米材料通过静电作用结合形成纳米杂化材料(CDs/DOX)@G5-RGD-TPGS。
本发明(CDs/DOX)@G5-RGD-TPGS纳米颗粒通过RGD的靶向作用与细胞膜表面的受体结合后进入细胞，由于TPGS的抑制作用，使ATP水平降低，P-糖蛋白跨膜转运蛋白无法利用能量将药物DOX泵出细胞外，使DOX在细胞内积累并发挥其作用，同时使细胞内的活性氧水平升高，从而抑制肿瘤细胞的生长。没有TPGS的抑制作用，P-糖蛋白跨膜转运蛋白会帮助药物DOX泵出细胞外，造成肿瘤细胞的多药耐药性(如图1所示)。
本发明使用核磁共振氢谱(1H NMR)、紫外可见吸收光谱(UV-Vis)、Zeta电势、稳态/瞬态荧光光谱等手段表征制备的杂化纳米材料((CDs/DOX)@G5-RGD-TPGS)。然后利用CCK-8法评价杂化纳米材料((CDs/DOX)@G5-RGD-TPGS)及相关对比材料的细胞毒性，并对比靶向材料与非靶向材料在相同条件下的荧光强度。分析并对比连接TPGS的相关材料对细胞内ATP含量变化的影响，同时测定其体外细胞荧光成像性能。将DOX·HCl脱酸形成难溶于水的DOX，纯DOX以静电作用的方式连接到碳点表面，生成CDs/DOX纳米药物缓释体系，然后取沉淀进行紫外分析。
有益效果
(1)本发明简单，易于操作分离，成本低廉，原料来源商品化，具有良好的发展前景；
(2)本发明利用P-糖蛋白抑制剂(TPGS)增强了肿瘤的抑制效果，在治疗领域具有潜在的应用价值；
(3)本发明得到的(CDs/DOX)@G5-RGD-TPGS双载药纳米颗粒具有良好的水溶性和生物相容性，对整合素αvβ3受体表达的肿瘤细胞具有靶向性，对肿瘤细胞有明显的抑制效果的同时可以降低细胞内ATP水平，阻碍药物泵出，同时可用于癌细胞的荧光成像，具有诊疗一体化性能。
附图说明
图1为本发明中杂化纳米材料(CDs/DOX)@G5-RGD-TPGS的合成及应用示意图；
图2为实施例1中PEG-RGD-COOH(a)、G5-PEG-RGD(b)和G5-RGD-TPGS(c)的核磁共振氢谱图；
图3为实施例1中碳点的紫外吸收光谱图和荧光激发光谱图(A)以及不同激发波长下的荧光发射光谱图(B)；实施例1制备的G5-RGD-TPGS、CDs/DOX、(CDs/DOX)@G5-RGD-TPGS和DOX·HCl的紫外吸收光谱图(插图为载药前CDs与载药后CDs/DOX的图片)(C)；以及CDs、CDs/DOX和(CDs/DOX)@G5-RGD-TPGS的荧光发射光谱图(图中CDs/DOX(CDs)和(CDs/DOX)@G5-RGD-TPGS(CDs)表示在CDs对应发射波长位置的荧光光谱图，CDs/DOX(DOX)和(CDs/DOX)@G5-RGD-TPGS(DOX)表示在DOX对应发射波长位置的荧光光谱图)(D)；
图4为实施例1制备的CDs、CDs/DOX、G5-RGD-TPGS、(CDs/DOX)@G5-RGD-TPGS和DOX的表面电势对比图(A)和实施例3中体外不同pH条件下DOX从(CDs/DOX)@G5-RGD-TPGS中的累积释放曲线(B)；
图5为实施例4中分别经(CDs/DOX)@G5-RGD-TPGS、(CDs/DOX)@G5-RGD-mPEG、CDs/DOX、G5-RGD-TPGS和纯DOX处理24小时后的A549细胞存活率柱状分析图；
图6为实施例5中经不同DOX浓度下(CDs/DOX)@G5-RGD-TPGS和(CDs/DOX)@G5-mPEG-TPGS处理6小时后的A549细胞的荧光强度与DOX的浓度之间的柱状图；
图7为实施例6中经CDs，DOX和(CDs/DOX)@G5-RGD-TPGS处理6小时后的A549细胞荧光显微镜成像图，其中材料DOX浓度为20μg/mL；
图8为实施例7中经不同DOX浓度下(CDs/DOX)@G5-RGD-TPGS9和(CDs/DOX)@G5-RGD-mPEG处理6小时后(a)，12小时后(b)和24小时后(c)的A549细胞ATP水平柱状分析图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
(1)把RGD多肽溶液(6.85mg，5mL DMSO)逐滴加入到MAL-PEG-COOH(19.83mg，5mLDMSO)中，搅拌反应3天，然后使用截留分子量MWCO为5000的透析袋对水溶液透析(2L/次，3次/天)，冷冻干燥，即得到RGD-PEG-COOH。
(2)在RGD-PEG-COOH溶液(18.33mg，5mL DMSO)中加入EDC溶液(18.21mg，5mLDMSO)，室温搅拌30分钟，然后加入NHS溶液(9.43mg，3mL DMSO)继续搅拌3小时，得到混合溶液；将混合溶液逐滴加入第五代聚酰胺-胺树状大分子G5-NH2溶液(38.34mg，10mL DMSO)中，搅拌反应时间为3天，然后使用截留分子量MWCO为5000的透析袋对水溶液透析(2L/次，3次/天)，冷冻干燥，即得到G5-PEG-RGD。
(3)在TPGS溶液中(10.10mg，4mL DMSO)加入CDI溶液(25.23mg，10mL DMSO)，室温搅拌6小时，然后向溶液中逐滴加入G5-PEG-RGD(27.02mg，25mL DMSO)溶液，搅拌反应3天，然后使用截留分子量MWCO为5000的透析袋对水溶液透析(2L/次，3次/天)，冷冻干燥，即得到G5-RGD-TPGS。
(4)将0.2g的柠檬酸钠和1.5g的碳酸氢铵溶解于10mL的超纯水中，然后将混合液转移至聚四氟乙烯的反应釜中加热反应，反应温度为180℃，反应时间为4h，反应体系自然冷却至室温，通过220nm的微孔滤膜除去过度碳化的颗粒，最后冷冻干燥得到淡黄色颗粒的碳点CDs。
(5)将碳点(5.26mg)溶于4mL超纯水中，将盐酸阿霉素DOX·HCl(5.0mg)溶于600μL甲醇溶液中，加入10μL三乙胺中和盐酸，然后逐滴加入到碳点水溶液中，避光敞口搅拌过夜，8000转离心20分钟，取上清液冷冻干燥，得到荧光碳点负载阿霉素的药物缓释体系CDs/DOX。
(6)将CDs/DOX溶液(6.28mg，4mL)加入到G5-RGD-TPGS溶液(6.89mg，5mL)中，室温搅拌24h，得到碳点修饰的树状大分子的双载药靶向纳米颗粒(CDs/DOX)@G5-RGD-TPGS的水溶液；透析，冷冻干燥，得到碳点修饰的树状大分子的双载药靶向纳米颗粒(CDs/DOX)@G5-RGD-TPGS。
实施例2
取实施例1制备的RGD-PEG-COOH，G5-PEG-RGD和G5-RGD-TPGS溶于D2O中，使用Bruker400MHz核磁共振仪进行氢谱测试。参见图2a，在RGD-PEG-COOH的核磁共振氢谱图中，3.6ppm是MAL-PEG-COOH的特征质子峰，7.15-7.25是RGD上苯环的特征质子峰，根据它们积分面积之比，计算出每个PEG上链接了0.89个RGD分子(其投料摩尔比为MAL-PEG-COOH:RGD＝1:1)。参见图2b，2.0-3.6ppm是树状大分子G5.NH2的亚甲基质子峰，根据它们积分面积之比，计算出每个G5.NH2上链接了3.86个PEG-RGD分子(其投料摩尔比为G5.NH2:PEG-RGD＝1:5)。参见图2c，0.7ppm是TPGS的甲基质子峰，根据它们积分面积之比，计算出每个G5-RGD分子上链接了9.7个TPGS分子(其投料摩尔比为G5-RGD-PEG：TPGS＝1:15)。通过测定实施例1中制备的碳点的紫外-可见光光谱图和荧光激发光谱图，可以观察到碳点的紫外吸收峰波长与激发波长的位置很接近，说明成功制备了碳点(参见图3A)。通过测定碳点在不同激发波长下的发射光谱，可以观察到碳点最大发射波长的位置不会随着激发波长的改变而变化(参见图3B)。G5-RGD-TPGS的紫外吸收峰位于280nm左右，特征峰的出现说明了成功制备了G5-RGD-TPGS，载药之后，在480nm处的吸收峰明显增强，说明成功连接了DOX(参见附图3C)，DOX的上载效率为22.3％，上载百分比为11.4％。另外，荧光光谱图(参见图3D)可以观察到碳点负载药物和树状大分子后的材料(CDs/DOX)@G5-RGD-TPGS的荧光强度相比于单纯的碳点有一定程度的减弱，但是与单纯的DOX相比，荧光仍然很强，表明碳点成功负载了药物DOX与G5-RGD-TPGS后，荧光仍然较强，并没有被完全淬灭。Zeta电势测定结果(参见图4A)表明：碳点电势为-15mV左右，载药之后电势上升，但依然为负电，连接G5-RGD-TPGS后，电势上升到5-6mV左右，这样的电势不会对细胞产生明显损伤。
实施例3
将实施例1制备的(CDs-DOX)@G5-RGD-TPGS分别用pH＝7.4和pH＝5.5的缓冲液溶解成浓度为1mg/mL的溶液，取1mL放入透析袋中固定，置于含有9mL不同pH的缓冲液的容器中，放在37℃摇床中振荡。在不同的时间点取样。每次取透析袋外液体1mL，测量其在480nm处吸光度值，再向透析袋外加入对应的缓冲溶液1mL。用此方法得到体外不同pH条件下DOX从(CDs-DOX)@G5-RGD-TPGS中释放的释放曲线。参见图4B，在70小时中，DOX在弱酸性环境中(pH＝5.5)的释放量为48％，比在生理环境(pH＝7.4)中的29.5％要大。说明这种载药体系具有一定的pH响应性，在肿瘤组织类似的弱酸性环境中的释放速度比正常组织释放速度快，一定程度减少DOX对正常组织的毒性，提高对肿瘤细胞恶性增殖的抑制效果。
实施例4
收集对数生长期A549细胞，按照每孔8000个细胞的密度种植于96孔板中，置于5％CO2，37℃条件培养过夜。倒掉原培养基，加入含不同材料((CDs/DOX)@G5-RGD-TPGS，(CDs/DOX)@G5-RGD-mPEG，CDs/DOX，G5-RGD-TPGS和纯DOX)的培养液(最终材料中DOX浓度为1、5、15、25、35、10μg/mL)或PBS(对照组)再共培养24小时。倒掉培养液，用PBS洗2遍，加入100μL含有10％的CCK-8的培养液，继续孵育3小时。之后用酶标仪上检测各孔在λ＝450nm处的吸光值，并据此计算相应的细胞活力，其中以PBS处理的细胞作为空白对照，细胞活力记为100％。图5结果显示，与(CDs/DOX)@G5-RGD-mPEG组和CDs/DOX相比，制备的(CDs/DOX)@G5-RGD-TPGS和纯DOX都具有明显的细胞毒性。可能的原因是，TPGS本身具有一定的抗肿瘤效果，同时作为一种P-pg抑制剂，TPGS可以抑制抗癌药物DOX溢出细胞，使其发挥抗肿瘤作用。
(CDs/DOX)@G5-RGD-mPEG的制备方法为：在mPEG-COOH溶液(27.62mg，7mL DMSO)中加入EDC溶液(27.47mg，5mL DMSO)，室温搅拌30分钟，然后加入NHS溶液(15.93mg，4mLDMSO)继续搅拌3小时，得到混合溶液；将混合溶液逐滴加入实施例1制备的G5-PEG-RGD(33.45mg，10mL DMSO)中，搅拌反应时间为2-4d，然后使用截留分子量MWCO为5000的透析袋对水溶液透析(2L/次，3次/天)，冷冻干燥，即得到G5-RGD-mPEG。将实施例1制备的CDs/DOX溶液(8.56mg，4mL)加入到G5-RGD-mPEG溶液(8.49mg，5mL)中，室温搅拌24h，得到碳点修饰的树状大分子的双载药靶向纳米颗粒(CDs/DOX)@G5-RGD-mPEG的水溶液；透析，冷冻干燥，得到碳点修饰的树状大分子的双载药靶向纳米颗粒(CDs/DOX)@G5-RGD-mPEG。
实施例5
收集对数生长期A549细胞，按照每孔2×105个细胞的密度种植于12孔板中，置于5％CO2，37℃条件培养过夜。倒掉原培养基，加入含有不同浓度的(CDs/DOX)@G5-RGD-TPGS和(CDs/DOX)@G5-mPEG-TPGS的培养液(最终材料中DOX浓度为1.0、5.0、10.0μg/mL)或PBS(对照组)共培养6小时。之后倒掉培养液，经PBS洗3次，用胰酶将细胞消化下来，转移到5ml离心管中，1000rpm离心5分钟去除上清液，加PBS 1ml吹匀，放入冰盒，用流式细胞仪对经(CDs/DOX)@G5-RGD-TPGS和(CDs/DOX)@G5-mPEG-TPGS处理过的A549细胞的进行荧光检测。图6结果显示：在不同的DOX浓度条件下，经(CDs/DOX)@G5-RGD-TPGS处理过A549细胞比经(CDs/DOX)@G5-mPEG-TPGS处理过的A549细胞表现出更强的荧光信号。说明通过RGD介导的靶向能力，本发明制备的(CDs/DOX)@G5-RGD-TPGS能够有效靶向识别整合素αvβ3受体表达的癌细胞。
(CDs/DOX)@G5-mPEG-TPGS的制备方法为：在TPGS溶液(15.22mg，5mL DMSO)中加入CDI溶液(32.68mg，10mL DMSO)，室温搅拌6小时，然后加入G5-NH2溶液(17.44mg，15mLDMSO)继续搅拌3天，然后使用截留分子量MWCO为5000的透析袋对水溶液透析(2L/次，3次/天)，冷冻干燥，即得到G5-TPGS。在mPEG-COOH溶液(4.22mg，1mL DMSO)中加入EDC溶液(5.84mg，1mL DMSO)，室温搅拌30分钟，然后加入NHS溶液(3.31mg，1mL DMSO)继续搅拌3小时，得到混合溶液；将混合溶液逐滴加入上述制备的G5-TPGS(16.39mg，8mL DMSO)中，搅拌反应时间为3天，然后使用截留分子量MWCO为5000的透析袋对水溶液透析(2L/次，3次/天)，冷冻干燥，即得到G5-mPEG-TPGS。将实施例1制备的CDs/DOX溶液(10.14mg，4mL)加入到G5-mPEG-TPGS溶液(10.69mg，5mL)中，室温搅拌24h，得到碳点修饰的树状大分子的双载药靶向纳米颗粒(CDs/DOX)@G5-mPEG-TPGS的水溶液；透析，冷冻干燥，得到碳点修饰的树状大分子的双载药靶向纳米颗粒(CDs/DOX)@G5-mPEG-TPGS。
实施例6
收集对数生长期A549细胞，按照每孔5×104个细胞的密度种在24孔板上，置于5％CO2，37℃条件培养过夜。倒掉原培养基，然后加入含有DOX，CDs和(CDs/DOX)@G5-RGD-TPGS的培养液(最终材料中DOX的浓度为20μg/mL)或PBS(对照组)共培养6小时。之后倒掉培养液，先用PBS洗3次，然后用戊二醛固定，再用PBS溶液洗3次。然后用荧光显微镜观察实验结果。图7结果显示：经(CDs/DOX)@G5-RGD-TPGS处理过的A549细胞既表现出CDs介导的蓝色荧光，也表现出DOX介导的红色荧光。说明本发明制备的(CDs/DOX)@G5-RGD-TPGS能够有效实现荧光成像。
实施例7
收集对数生长期A549细胞，按照每孔5×104个细胞的密度种在24孔板上，置于5％CO2，37℃条件培养过夜。然后加入含有不同浓度的(CDs/DOX)@G5-RGD-TPGS和(CDs/DOX)@G5-RGD-mPEG的培养液(最终材料中DOX的浓度为5,10和15μg/mL)或PBS(对照组)共培养6小时，12小时和24小时。之后倒掉培养液，先用PBS洗3次，然后加入裂解液裂解细胞，离心取上清液。然后在96黑色孔板中加入100μL ATP检测工作液，放置3-5分钟后在孔中加入20μL样品，混匀后用多功能酶标仪测定RLU值。可以观察到经(CDs/DOX)@G5-RGD-TPGS处理过6小时(参见图8a)，12小时(参见图8b)和24小时(参见图8c)的A549细胞比经(CDs/DOX)@G5-RGD-mPEG处理过的A549细胞表现出更低的ATP含量。说明本发明制备的(CDs/DOX)@G5-RGD-TPGS能够有效降低细胞内ATP的含量，抑制抗癌药物DOX泵出细胞。
Claims (10)
1.一种基于荧光碳点修饰的树状大分子的双载药靶向纳米平台的制备方法，包括：
(1)将柠檬酸钠和碳酸氢铵以质量比为0.2-0.5:1.2-1.5溶解于超纯水中，水热反应，自然冷却至室温，过滤，干燥，得到碳点；其中柠檬酸钠与超纯水的比例为0.2g-0.5g:10mL；
(2)将盐酸阿霉素DOX·HCl溶于溶剂中，加入三乙胺，逐滴加入到步骤(1)中碳点的水溶液中，避光搅拌，离心，冷冻干燥，得到荧光碳点负载阿霉素的药物缓释体系CDs/DOX，其中盐酸阿霉素与碳点的质量比为1-1.2:1，三乙胺与溶剂的体积比为1:30-80；
(3)将RGD多肽溶液逐滴加入到MAL-PEG-COOH中，搅拌反应，透析，冷冻干燥，得到RGD-PEG-COOH，其中RGD多肽与MAL-PEG-COOH的摩尔比为1:1-2；
(4)将步骤(3)中RGD-PEG-COOH溶于溶剂中，得到RGD-PEG-COOH溶液，经EDC溶液和NHS溶液活化，再逐滴加入第五代聚酰胺-胺树状大分子G5-NH2溶液中，搅拌反应，透析，冷冻干燥，得到RGD靶向的功能化的树状大分子G5-PEG-RGD，其中EDC、NHS与RGD-PEG-COOH的摩尔比为9-11:9-11:1，RGD-PEG-COOH与G5-NH2的摩尔比为4-6:1，RGD-PEG-COOH溶液度为3-5mg/mL；
(5)在聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯TPGS溶液中加入N,N'-羰基二咪唑CDI溶液，搅拌，然后逐滴加入步骤(4)中G5-PEG-RGD的溶液，继续搅拌反应，透析，冷冻干燥，得到G5-RGD-TPGS，其中CDI与TPGS的摩尔比为19-25:1，TPGS与G5-PEG-RGD的摩尔比为14-16:1；
(6)将步骤(5)中G5-RGD-TPGS的溶液中加入步骤(2)中CDs/DOX的溶液，搅拌，透析，冷冻干燥，得到基于荧光碳点修饰的树状大分子的双载药靶向纳米平台CDs/DOX@G5-RGD-TPGS，其中G5-RGD-TPGS与CDs/DOX的质量比为1-1.2:1。
2.按照权利要求1所述的一种基于荧光碳点修饰的树状大分子的双载药靶向纳米平台的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中水热反应温度为170℃-190℃，水热反应时间为3-5h；过滤是用220nm的微孔滤膜。
3.按照权利要求1所述的一种基于荧光碳点修饰的树状大分子的双载药靶向纳米平台的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中溶剂为甲醇；碳点的水溶液浓度为1-3mg/mL；避光搅拌时间为12-24h。
4.按照权利要求1所述的一种基于荧光碳点修饰的树状大分子的双载药靶向纳米平台的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中MAL-PEG-COOH的浓度为3-5mg/mL；RGD多肽溶液浓度为1-2mg/mL，溶剂为DMSO；搅拌反应时间为2-4d。
5.按照权利要求1所述的一种基于荧光碳点修饰的树状大分子的双载药靶向纳米平台的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中溶剂为DMSO；EDC溶液、NHS溶液和G5-NH2溶液的溶剂均为DMSO。
6.按照权利要求1所述的一种基于荧光碳点修饰的树状大分子的双载药靶向纳米平台的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中EDC溶液浓度为3-8mg/mL；NHS溶液浓度为3-6mg/mL；G5-NH2溶液浓度为2-4mg/mL；搅拌反应时间为2-4d。
7.按照权利要求1所述的一种基于荧光碳点修饰的树状大分子的双载药靶向纳米平台的制备方法，其特征在于，所述步骤(5)中TPGS溶液和G5-PEG-RGD的溶液的溶剂均为DMSO；TPGS溶液浓度为2-5mg/mL；G5-PEG-RGD的溶液浓度为1-3mg/mL；CDI溶液浓度为2-4mg/mL。
8.按照权利要求1所述的一种基于荧光碳点修饰的树状大分子的双载药靶向纳米平台的制备方法，其特征在于，所述步骤(5)中搅拌时间为4-6h；搅拌温度为室温；继续搅拌反应时间为2-4d。
9.按照权利要求1所述的一种基于荧光碳点修饰的树状大分子的双载药靶向纳米平台的制备方法，其特征在于，所述步骤(6)中CDs/DOX的溶液浓度为1-4mg/mL；G5-RGD-TPGS的溶液浓度为1-4mg/mL；搅拌时间为12-24h，搅拌温度为室温。
10.按照权利要求1所述的一种基于荧光碳点修饰的树状大分子的双载药靶向纳米平台的制备方法，其特征在于，所述步骤(6)中CDs/DOX@G5-RGD-TPGS应用于肺癌细胞A549的荧光成像中。
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