CN102379850B

CN102379850B - 一种穿越人体粘液屏障的靶向给药脂质体

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Publication number: CN102379850B
Application number: CN 201110344228
Authority: CN
Inventors: 刘红星; 张扬; 苗博龙; 赵焰平; 肖萱; 刘玉静; 周丽莹
Original assignee: Beijing Tide Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Beijing Tide Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2011-11-04
Filing date: 2011-11-04
Publication date: 2013-08-28
Anticipated expiration: 2031-11-04
Also published as: CN102379850A

Abstract

一种可以穿越人体粘液屏障的靶向给药脂质体，将重量百分比为8.5%~22%的亲水性的聚乙二醇嵌段共聚物、特别是将聚乙二醇-维生素E琥珀酸酯包覆在载药脂质体粒子后，该脂质体粒子穿越人体粘液屏障（主要为肺及眼部粘液）的比例及速率显著提高提高数百倍，克服人体粘液屏障对微小粒子的排斥、位阻作用，对具有病变的粘液组织器官提高药物的治疗疗效。同时，通过聚乙二醇-维生素E琥珀酸酯的包覆可提高载药脂质体制备过程中的药物包载效率。因此，该类脂质体有潜力成为一种尤其适用于癌症的新型多功能药物载体。

Description

一种穿越人体粘液屏障的靶向给药脂质体

技术领域

本发明属于药物制剂领域，具体涉及一种包载有化学药物、基因及蛋白类药物、能够穿越人体粘液屏障（尤其适用于肺、眼部）的靶向给药脂质体制剂。

背景技术

众所周知，人体中存在多个暴露在外环境或经常与外环境接触的器官，比如肺、眼、呼吸道、肠道、女性阴道等，这些器官的表皮组织上层均包覆着具有保护作用的粘液层。这些粘液层从微观角度上观察具有致密的微孔结构，从宏观角度上观察呈现高度的黏性。此外，这些粘液层的代谢更新速率较快，根据各器官部位的不同，粘液层的代谢清除时间为数十秒至数十分钟不等。因此这些粘液层可以首先通过粘着或立体位阻作用有效地阻止外来异物、尤其是外来微小粒子（包括细菌、病毒等病原体）的侵入，其次通过代谢清除机制将粘着了外来异物的粘液排除出体外，从而保持这些器官内环境的稳定及健康状态。

当这些器官产生疾病并需要给药治疗时，临床上通常将外用局部用药作为首选治疗方式。这是由于在理想状态下该给药方式：（1）靶点更为明确，病灶部位的药物浓度更高，具备更高的疗效，同时不会引发全身性的毒副作用；（2）给药方式更为直接、方便，患者的耐受性显著提高。但令人感到遗憾的是，现有传统的局部给药方式的治疗效果并未达到预期。这是由于当治疗性药物给药后，药物会被这些器官表面包覆的保护性粘液层识别并将其视为外来异物而被阻止并快速地清除出体外，从而极大地降低了药物的治疗效果，广大的药学研究人员也将这些粘液层视为外用局部给药的粘液屏障。因此，一种可以穿越人体粘液屏障的新型外用局部给药制剂是目前临床上迫切需要的。

随着药剂学、药理学、生物学及材料科学的高速发展，科研人员开发出了一系列具有特殊理化及生理学性质的新型药物载体，例如纳米粒、微球、脂质体、胶束等。其中，脂质体除了具备这些新型载体共有的特点，还由于其独特的优势而受到越来越多的关注：（1）特殊的结构，含有亲水内核及磷脂双层膜，可以实现对于不同溶解性质（水溶性及脂溶性）药物的包载；（2）制备工艺更为简单，原辅料的来源广泛，成本更为低廉，更适于开发成商业化产品。目前，世界范围内已上市近20个基于脂质体的新型药物制剂，其中多为注射剂型，少部分为口服剂型。这些产品一经上市便取得了令人瞩目的疗效及销售业绩。可以说，脂质体剂型正日益成为一种新兴的药物载体，且发展前景一片光明。但是，目前还没有关于局部给药脂质体制剂特别是对粘液组织给与脂质体制剂的任何文献报道。

为了克服人体粘液屏障对微小粒子的排斥、位阻作用，对具有病变的粘液组织器官提高药物的治疗疗效，本发明人经过潜心研究发现，将亲水性的聚乙二醇嵌段共聚物包覆于载药脂质体粒子后，该脂质体粒子的穿越人体粘液屏障（主要为肺及眼部粘液）的比例及速率显著提高提高数百倍，通过本发明的药代动力学及药效学试验中得到了验证。同时研究发现：由于聚乙二醇-维生素E琥珀酸酯结构中的维生素E琥珀酸酯链段可以通过氧化应激机制诱导肿瘤细胞的凋亡，这样其可以与脂质体内包载的药物一同对于肿瘤细胞起到联合杀伤的作用，因此该类脂质体有潜力成为一种尤其适用于癌症的新型多功能药物载体。此外，通过聚乙二醇-维生素E琥珀酸酯包覆，在载药脂质体制备过程中能够提高药物的包载效率。

本发明提供了一种新型的可以穿越人体粘液屏障的靶向给药脂质体制剂。在脂质体制剂的脂膜表面包覆亲水性的聚乙二醇嵌段共聚物，我们可将药物包载于该粒子中，使得载药粒子快速穿透粘液层，直达病灶部位的上皮组织，在局部保持更高的药物浓度，实现靶向给药目的，提高药效。

发明内容

本发明的目的在于解决人体粘液屏障对药物的排斥、难于到达病灶部位的缺陷，克服了现有技术中存在的问题。具体而言，本发明旨在提供一种新型的包载有化学药物、基因及蛋白类药物的，能够穿越人体粘液屏障（尤其适用于眼、肺部）的靶向给药脂质体制剂。本发明通过将聚乙二醇-维生素E琥珀酸酯包覆于脂质体表面，可以显著提高载药脂质体穿透人体粘液屏障的能力，增强载药脂质体在人眼、肺等表层覆盖有粘液的靶向部位的滞留性，进而通过载药脂质体将治疗性药物高效地递送到靶器官上皮组织，实现理想的治疗效果。

本发明通过以下技术方案实现：一种穿越人体粘液屏障的靶向给药脂质体制剂，其处方中含有治疗性物质、磷脂酰胆碱、磷脂酰甘油、甾醇类、油酸或油酸钠、亲水性的聚乙二醇嵌段共聚物。

其中，亲水性的聚乙二醇嵌段共聚物为聚乙二醇1000-维生素E琥珀酸酯或聚乙二醇2000-维生素E琥珀酸酯或聚乙二醇3000-维生素E琥珀酸酯，包覆在脂质体制剂的表面。

该脂质体制剂的处方中含有按重量份计35%~60%的磷脂酰胆碱、21%~40%磷脂酰甘油、1.6%~3.5%甾醇类、0.4%~0.85%油酸或油酸钠、8.5%~22%亲水性的聚乙二醇嵌段共聚物。

其中，磷脂酰胆碱选自大豆磷脂酰胆碱、蛋黄磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、蛋黄卵磷脂中的一种或多种。

其中，磷脂酰甘油选自大豆磷脂酰甘油、蛋黄磷脂酰甘油、二硬脂酰磷脂酰甘油、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油中的一种或多种。

其中，甾醇类选自胆固醇、豆甾醇、谷甾醇中的一种或多种。

其中，脂质体粒径的范围为20~200nm。

一种制备穿越人体粘液屏障的靶向给药脂质体制剂的制备方法，如下所示：

（1）将处方量的治疗性物质在一定量有机溶剂中搅拌溶解；

（2）将处方量的磷脂酰甘油在在少量的有机溶剂中溶解后与（1）混合搅拌溶解；

（3）将处方量的磷脂酰胆碱、甾醇、油酸或油酸钠在一定量的有机溶剂中溶解后与（2）混合搅拌溶解；

（4）将（3）的混合均匀的溶液干燥、除尽有机溶剂后得到含药粉末；

（5）取干燥粉末，加入一定量亲水性的聚乙二醇嵌段共聚物的水溶液（0.5～2%g/ml，重量/体积比），温度控制在40～70℃，并以200～600转的速度搅拌1～2小时，得到水化溶液；

（6）对所得水化溶液进行高压均质，压力600～1200bar，均质3～10次，用氢氧化钠或醋酸调节PH值为6～8，得到脂质体溶液；

（7）将所得的脂质体液态溶液通过0.22μm微孔滤膜过滤，密封后保存。

其中步骤（1）、（2）、（3）中的有机溶剂为甲醇、丙酮、乙腈、氯仿中的一种或多种；其中步骤（4）中干燥方法选自喷雾干燥、旋转蒸发中的任意一种。

附图说明

图1为姜黄色素脂质体在大鼠肺部靶向行为评价图。

具体实施方式

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明的范围仅限于以下实施例。凡基于本发明的内容所实现的技术方案均属于本发明的范围。显然，根据本发明的内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明的基本技术思想的前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

实施例1

处方：

姜黄色素 1g

大豆磷脂酰胆碱 25g

大豆磷脂酰甘油 25g

胆固醇 2g

油酸 0.5g

聚乙二醇3000-维生素E琥珀酸酯 10g

制成1000ml

制备工艺：

（1）将处方量姜黄色素溶于50ml丙酮中搅拌溶解，75℃加热搅拌至完全溶解。

（2）将处方量大豆磷脂酰甘油于适量甲醇溶液中溶解完全，之后与（1）溶液混合。

（3）将处方量大豆磷脂酰胆碱、胆固醇于100ml丙酮，搅拌使其完全溶解。

（4）将（2）所得溶液与（3）所得溶液混合均匀之后，采用旋转蒸发仪将有机溶剂除尽，得到干燥载药粉末。

（5）取干燥粉末，加入1000mL聚乙二醇-维生素E琥珀酸酯水溶液（1%，重量-体积比），温度控制60℃，并以300rpm的转速搅拌1小时，得到水化溶液。

（6）对所得水化溶液进行高压均质，压力800~1000bar，均质5次，用超纯水定容至1000mL，用氢氧化钠或醋酸调节PH值6～8,得到姜黄色素脂质体溶液。

（7）将所得脂质体液态溶液通过0.22μm微孔滤膜过滤，封装后保存。

实施例2

处方：

地塞米松磷酸钠 1g

大豆磷脂酰胆碱 35g

大豆磷脂酰甘油 15g

胆固醇 2g

油酸 0.5g

聚乙二醇2000-维生素E琥珀酸酯 5g

制成1000ml

制备工艺：

（1）将处方量地塞米松磷酸钠于100ml超纯水混合溶液中搅拌溶解。

（2）将处方量大豆磷脂酰甘油于适量甲醇中溶解完全，之后与（1）溶液混合。

（3）将处方量大豆磷脂酰胆碱、胆固醇于100ml甲醇中溶解。

（4）将（2）所得溶液与（3）所得溶液混合均匀之后，采用喷雾干燥器将有机溶剂除尽，得到喷干粉末。

（5）取一定量喷干粉末，加入1000mL聚乙二醇-维生素E琥珀酸酯水溶液（0.5%，重量-体积比），温度控制60℃，并以300rpm的转速搅拌1小时，得到水化溶液。

（6）对所得水化溶液进行高压均质，压力800~1000bar，均质8次，用超纯水定容至1000mL，用氢氧化钠或醋酸调节PH值6～8，得到姜黄色素脂质体溶液，得到地塞米松磷酸钠脂质体溶液。

实施例3

处方：

克拉霉素 1g

蛋黄磷脂酰胆碱 35g

蛋黄磷脂酰甘油 15g

豆甾醇 2g

油酸钠 0.5g

聚乙二醇1000-维生素E琥珀酸酯 15g

制成1000ml

制备工艺：

（1）将处方量克拉霉素于100ml无水乙醇中搅拌溶解。

（2）将处方量大豆磷脂酰甘油于适量氯仿:甲醇（1:1，体积比）混合溶液中溶解完全，之后与（1）溶液混合。

（3）将大豆磷脂酰胆碱、胆固醇于100ml氯仿:甲醇（1:1，体积比）混合溶液中溶解。

（5）取一定量喷干粉末，加入1000mL聚乙二醇-维生素E琥珀酸酯溶液（1.5%，重量-体积比），温度控制60℃，并以300rpm的转速搅拌1小时，得到水化溶液。

（6）对所得水化溶液进行高压均质，压力800~1000bar，均质3次，用超纯水定容至1000mL，用氢氧化钠或醋酸调节PH值6～8,得到克拉霉素脂质体溶液。

实施例4

天然生物胰岛素干粉 5g

大豆磷脂酰甘油 35g

大豆磷脂酰胆碱 35g

豆甾醇 2g

油酸钠 0.5g

聚乙二醇2000-维生素E琥珀酸酯 20g

制成1000ml

制备工艺：

（1）将处方量天然生物胰岛素干粉溶于200ml酸性水溶液中搅拌溶解。

（3）将处方量大豆磷脂酰胆碱、胆固醇于适量氯仿:甲醇溶液中溶解。

（5）取一定量喷干粉末，加入1000mL聚乙二醇-维生素E琥珀酸酯溶液（2%，重量-体积比），温度控制60℃，并以300rpm的转速搅拌2小时，得到水化溶液。

（6）对所得水化溶液进行高压均质，压力800~1000bar，均质10次，用超纯水定容至1000mL，用氢氧化钠或醋酸调节PH值6～8,得到胰岛素脂质体溶液。

实施例5

多西他赛 2g

蛋黄磷脂酰甘油 70g

蛋黄磷脂酰胆碱 30g

谷甾醇 2g

油酸钠 0.5g

聚乙二醇3000-维生素E琥珀酸酯 20g

制成1000ml

制备工艺：

（1）将处方量多西他赛溶于50ml甲醇中搅拌溶解。

（2）将处方量蛋黄磷脂酰甘油于适量氯仿：甲醇溶液（1:1，V/V）中溶解完全，之后与（1）溶液混合。

（3）将处方量蛋黄磷脂酰胆碱、胆固醇于适量氯仿:甲醇溶液中（1:1，V/V）溶解。

（4）将（2）所得溶液与（3）所得溶液混合均匀之后，采用旋转蒸发仪将有机溶剂除尽，得到干燥粉末。

（5）取一定量干燥粉末，加入1000mL聚乙二醇-维生素E琥珀酸酯溶液（2%，重量-体积比），温度控制60℃，并以300rpm的转速搅拌1小时，得到水化溶液。

（6）对所得水化溶液进行高压均质，压力800~1000bar，均质5次，用超纯水定容至1000mL，用氢氧化钠或醋酸调节PH值6～8,得到胰岛素脂质体溶液。

比较实施例1 经TPGS表面包覆后脂质体粒子理化性质的改变

本比较实施例分别从脂质体的粒径(Size)、表面电势(Zeta Potential)等方面考察不同处方组成的脂质的理化性质的差别，证明经聚乙二醇-维生素E琥珀酸酯(TPGS)可以稳定地包覆于脂质体粒子表面，进而为本发明的具体应用提供可靠的物质基础。

不同处方组成姜黄色素脂质体的制备：按照实施例1中的制备方法，仅在处方中用相同体积的PBS缓冲液（10mM，pH6.0～8.0）替代聚乙二醇-维生素E琥珀酸酯水溶液（1%，W/V）作为水化液，制得常规姜黄色素脂质体；按照实施例1中的处方组成及制备方法制得TPGS-姜黄色素脂质体-1；按照实施例1中相同的制备方法，仅在处方中用相同体积的聚乙二醇-维生素E琥珀酸酯水溶液（2%，W/V）替代乙二醇-维生素E琥珀酸酯水溶液（1%，W/V）作为水化液，制得TPGS-姜黄色素脂质体-2。

粒径及表面电势的测定：利用Malvern sizer粒度仪依次测定上述三种脂质体的粒径、粒径分布及表面电势，所得结果见表1。

姜黄色素包封率的测定：取适量不同处方组成的样品，上样到预先制备好的葡聚糖凝胶柱，分离除去游离药物结晶，收集得到载药脂质体。利用高效液相色谱仪测定姜黄色素含量，并计算得到各不同组成脂质体的姜黄色素包封率，结果见表1

表1 不同处方组成的姜黄色素脂质体的理化性质数据

组别	处方中TPGS含量(%,W/V)	粒径（nm）	粒径分布	表面电势(mV)	包封率（%）
						常规姜黄色素脂质体	0	92±2.173	0.06	-31.3±1.069	72.3
TPGS-姜黄色素脂质体-1	1	123±1.236	0.015	-9.6±1.173	97.8
						TPGS-姜黄色素脂质体-2	2	156±2.569	0.008	-5.1±0.987	98.9

如表1所示，与常规姜黄色素脂质体相比，TPGS-姜黄色素脂质体-1及TPGS-姜黄色素脂质体-2的粒径均随着处方中TPGS浓度的提高而增大，粒径分布均一，这证明TPGS已经稳定地包覆于脂质体粒子表面；脂质体粒子表面电势随TPGS浓度的提高而升高，这是由于TPGS中的聚乙二醇（PEG）嵌段呈正电性引起的，进一步证明TPGS可以稳定均一地包覆于粒子表面。同时值得注意的是，处方中引入TPGS可以提高脂质体对于水难溶性药物姜黄色素的包封率，因此，可证明TPGS可提高难溶性药物的包封率。

比较实施例2 TPGS-脂质体稳定性试验

采用本专利申请实施例1所制得的TPGS-姜黄色素脂质体进行药物稳定性试验。具体过程如下：

试验方法：将上述TPGS-姜黄色素液态脂质体样品分别在25℃、60±5%RH条件下放置，进行稳定性试验考察，于放样0、3、7、14、21、30天取样进行检测。

检测指标：粒径、含量

试验结果：见表2

表2 稳定性试验结果（TPGS-姜黄色素脂质体）

时间（天）	粒径（nm）	含量（mg/ml）
			0	121±0.017	0.98
3	119±0.016	0.97
			7	120±0.017	0.98
14	123±0.018	0.97
			21	120±0.020	0.97
30	125±0.017	0.98

从结果来看，在加速放置30天后，TPGS-姜黄色素脂质体的粒径及含量均无明显变化，稳定性良好。

试验例1 大鼠体内的肺部靶向行为评价

采用本专利申请实施例1所制得的姜黄色素（Curcumin）脂质体进行大鼠体内的肺部靶向行为评价。具体过程如下：

试验方法：

动物分组及模型制备：清洁级健康雄性Wistar大鼠30只，鼠龄约8周，体质量200g±10g。随机分为3组：姜黄色素脂质体组（比较例1）、TPGS-姜黄色素脂质体组-1（实施例1）和TPGS-姜黄色素脂质体组-2（比较例2）。对Wistar雄性大鼠（8周龄）经鼻腔吸入方式给予（20ug Curcumin/大鼠）实施例1的TPGS-姜黄色素脂质体-1。给药4小时后，将大鼠的肺组织及支气管肺泡分离取出并灌洗，分别得到含有TPGS-姜黄色素脂质体的BALF灌洗液及BALC细胞。利用荧光光度计测定BALF灌洗液及BALC细胞中的姜黄色素的荧光强度，并通过折算得到姜黄色素的浓度，进而得到脂质体在肺内组织、BALF灌洗液及BALC细胞的残留率（%）。

作为对照试验，采用相同方法制备得到粒子表面未经TPGS包覆的姜黄色素脂质体（比较例1，处方中除了不加入TPGS，其余组成均与实施例1中一致）及粒子表面TPGS浓度加倍的比较例2（处方中除了TPGS含量为20g，其余组成均与实施例1中一致）并以相同的方法进行大鼠体内的肺部靶向行为评价。

实验结果见图1。

以姜黄色素荧光强度的强弱作为姜黄色素脂质体残留率高低的依据。如图1所示，与对照样品（比较例1）相比，粒子表面包覆有聚乙二醇-维生素E琥珀酸酯的脂质体在大鼠肺组织中检测出更多的姜黄色素脂质体；数据同时显示随着粒子表面聚乙二醇-维生素E琥珀酸酯密度的升高，肺泡组织中的姜黄色素脂质体的残留率也相应增加（实施例1与比较例2相比），提示实施例脂质体具有明显强于比较例脂质体快速穿透肺粘液屏障的能力，证明由于粒子表面引入聚乙二醇-维生素E琥珀酸酯后可以明显提高载药脂质体在肺组织的滞留比例，从而提高药物在肺部的药物浓度和药物作用时间，进而实现较高的治疗效果。

试验例2 肺纤维化模型大鼠的药效学评价

肺纤维化模型大鼠的建立：清洁级健康雄性SD大鼠60只，鼠龄约12周，体质量210g±10g。随机分为生理盐水对照组、博莱霉素组、地塞米松对照组、地塞米松干预组、地塞米松常规脂质体干预组及地塞米松TPGS脂质体干预组。每组各10只。建立肺纤维化模型。大鼠以10%水合氯醛(0.4mL/100g)腹腔注射麻醉后切开颈部皮肤，暴露气管；博莱霉素组、地塞米松干预组、地塞米松常规脂质体干预组及地塞米松TPGS脂质体干预组按5mg/kg向气管内注入浓度为10g/L的博来霉素，生理盐水对照组及地塞米松对照组气管内注入生理盐水100L。地塞米松对照组、地塞米松干预组、地塞米松常规脂质体干预组及地塞米松TPGS脂质体干预组以经鼻吸入方式于当天开始予地塞米松2mg/ kg，1次/d，连续给药25d。经鼻吸入给药后第28天以1%戊巴比妥钠按50mg/kg腹腔内注射麻醉大鼠，留取右中肺进行病理检查。

肺组织的大体观察：生理盐水对照组及地塞米松对照组大鼠肺组织呈粉红色，湿润、有弹性、表面光滑。博莱霉素组大鼠肺容积减少，肺组织苍白，表面凹凸不平，弹性明显降低; 地塞米松干预组、地塞米松常规脂质体干预组及地塞米松TPGS脂质体干预组有不同程度的类似博莱霉素组改变。其中地塞米松TPGS脂质体干预组肺组织的病变程度最轻，而地塞米松干预组与地塞米松常规脂质体干预组肺组织病变程度无显著差别，且明显较地塞米松TPGS脂质体干预组严重。

肺组织病理学检查:组织切片进行HE染色后，在光镜下采用Ashcroft评分(评分:0~8级)，根据间质纤维沉积及肺组织结构破坏情况对肺纤维化程度进行半定量分析。肺组织羟脯氨酸含量测定取肺组织100mg，采用碱水解法，按羟脯氨酸测试试剂盒说明操作后，取上清液在550nm处测各管吸光度，计算羟脯氨酸含量，结果列于表3。

表3 不同组别大鼠组织切片结果

表3中Ashcroft评分显示, 博莱霉素组大鼠肺纤维化程度较生理盐水对照组明显升高，地塞米松干预组及地塞米松脂质体干预组较博来霉素组Ashcroft评分略有降低，而地塞米松TPGS脂质体干预后Ashcroft评分较博莱霉素组明显下降( P < 0. 01)。

博莱霉素组大鼠肺组织中羟脯氨酸含量较生理盐水对照组明显升高，地塞米松TPGS脂质体干预后较博莱霉素组、地塞米松干预组及地塞米松脂质体干预组均有明显下降( P 均<0. 01)。

以上结果说明，粒子表面包覆有聚乙二醇-维生素E琥珀酸酯后，载药脂质体可以快速穿透肺粘液屏障，将药物递送到肺部组织，进而明显改善靶点病变部位的治疗效果。

试验例3 家兔体内的眼部药代动力学行为评价

采用本专利申请实施例3所制得的克拉霉素脂质体进行家兔体内的眼部药代动力学行为评价。具体过程如下：

健康新西兰白兔30只，体重1.5～2.0 kg，雌雄不限，随机分为3组：克拉霉素脂质体组、TPGS-克拉霉素脂质体组-1（实施例3）及TPGS-克拉霉素脂质体组-2。

各组家兔按照30 mg 克拉霉素/kg的剂量分别于眼部局部给予克拉霉素脂质体组、TPGS-克拉霉素脂质体组-1（实施例3）及TPGS-克拉霉素脂质体组-2，并于给药后0，5，10，20，30，60，90，120，180和240 min用长5mm、宽2mm、质量1mg的滤纸置于结膜囊下吸取泪液，电子天平称质量，滤纸前后质量之差即为泪液质量。随即空气栓塞处死动物，迅速摘取眼球，用生理盐水反复冲洗。抽取房水、玻璃体，然后刨开眼球，取出角膜、虹膜-睫状体、晶体，经滤纸吸干后称质量，置试管中剪碎、匀浆。取匀浆1 mL，置10mL试管中，依次加内标液0.1 mL、甲醇4mL，振荡1min；离心2 min(4500 xg/min)，取甲醇3.0mL，置5mL离心管中，50℃水浴下氮气吹干，100 μL流动相复溶，取50μL高效液相色谱仪测定克拉霉素浓度，计算眼内各组织中的药物浓度(mg/L)，所得结果分别列于表4。

表4 不同组成脂质体在家兔体内的眼部药代动力学行为评价

表4-1 克拉霉素脂质体在家兔眼部各组织分布的浓度（mg/mL）

时间/min

泪液

房水

角膜

虹膜-睫状体

玻璃体

晶体

0

97.65±1.38

0.15±0.035

0.99±0.024

1.76±0.033

0.051±0.002

5

80.79±2.11

0.23±0.012

0.89±0.012

1.99±0.027

0.052±0.004

0.049±0.013

10

75.75±3.21

0.30±0.033

0.80±0.009

1.89±0.032

0.041±0.003

0.042±0.002

20

60.36±5.37

0.28±0.022

0.81±0.011

1.81±0.011

0.039±0.002

—

30

45.66±3.39

0.22±0.032

0.69±0.007

1.83±0.031

—

60

15.36±8.57

0.09±0.017

0.53±0.051

1.59±0.045

—

90

5.36±0.96

—

0.37±0.011

1.12±0.055

—

120

1.36±0.033

—

0.26±0.021

0.99±0.043

—

240

0.20±0.011

—

0.13±0.011

0.12±0.011

—

“—”表示药物浓度已达检测方法检测线以下

表4-2 TPGS-克拉霉素脂质体-1在家兔眼部各组织分布的浓度（mg/mL）

时间/h

泪液

房水

角膜

虹膜-睫状体

玻璃体

晶体

0

89.33±1.33

0.29±0.033

0.89±0.011

1.83±0.034

0.103±0.006

0.099±0.006

5

73.37±2.45

1.46±0.021

14.98±0.33

17.69±1.33

0.76±0.003

0.69±0.002

10

71.32±2.38

1.55±0.022

14.99±0.55

18.49±0.36

0.88±0.009

0.65±0.002

20

60.33±1.46

1.69±0.012

15.66±0.51

18.46±0.59

1.08±0.019

0.88±0.004

30

35.36±2.43

1.66±0.021

14.78±0.32

18.09±0.37

1.07±0.014

0.99±0.007

60

15.08±1.67

1.57±0.037

14.80±0.14

15.32±0.48

0.86±0.013

0.69±0.001

90

6.31±1.32

1.35±0.012

12.01±0.17

13.06±0.24

0.69±0.017

0.49±0.003

120

1.99±0.027

1.15±0.018

9.97±0.23

10.78±0.31

0.45±0.018

0.27±0.008

240

0.13±0.006

0.45±0.008

3.09±0.21

1.79±0.11

0.13±0.006

0.08±0.002

表4-3 TPGS-克拉霉素脂质体-2在家兔眼部各组织分布的浓度（mg/mL）

时间/h

泪液

房水

角膜

虹膜-睫状体

玻璃体

晶体

0

90.46±1.01

0.27±0.007

0.96±0.012

1.98±0.014

0.14±0.006

0.089±0.005

5

72.48±1.23

1.60±0.031

13.99±0.36

18.43±0.021

0.66±0.003

0.71±0.002

10

69.23±1.11

1.95±0.021

17.99±0.57

20.49±0.26

1.02±0.009

0.85±0.002

20

56.33±1.66

2.14±0.018

17.66±0.42

24.46±0.31

1.58±0.019

1.11±0.001

30

39.48±1.45

2.21±0.026

15.78±0.23

23.09±0.47

1.36±0.011

1.27±0.005

60

16.33±1.31

1.92±0.027

14.99±0.12

21.23±0.28

1.06±0.023

0.95±0.001

90

8.61±1.23

1.65±0.022

12.71±0.26

17.56±0.21

0.89±0.019

0.68±0.002

120

2.95±0.021

1.55±0.048

10.87±0.31

14.38±0.30

0.65±0.011

0.49±0.006

240

-

0.78±0.009

4.69±0.12

3.79±0.17

0.23±0.009

0.21±0.002

“—”表示药物浓度已达检测方法检测限以下

药代动力学评价：如表4中结果所示，与常规克拉霉素脂质体相比，TPGS-克拉霉素脂质体-1及-2在家兔眼中的分布行为具有明显的差异，主要体现在TPGS-克拉霉素脂质体-1及-2在家兔泪液中的浓度明显降低，而在家兔角膜、虹膜-睫状体、玻璃体及晶体等部位的聚集数量明显提高，滞留时间也显著延长。以上结果表明，脂质体粒子表面经TPGS包覆后，可以快速穿透家兔眼部表面的粘液（主要是泪液）屏障，到达并聚集在眼部各主要部位，从而在眼部各主要部位保持较高的载药脂质体浓度及长时间的治疗作用，最终达到增强药效、降低毒副作用、减少给药次数及提高患者耐受性的目的。

试验例4 金黄色葡萄球菌结膜炎模型兔的药效学评价

金黄色葡萄球菌结膜炎兔模型的建立：健康新西兰白兔34只，体重1.5～2.0 kg，雌雄不限。家兔双眼内滴0.5%普鲁卡因表面麻醉后，上眼睑结膜表面作“#”划痕，取浓度为1.5×10⁸cpu/mL的金黄色葡萄球菌ATCC25923株菌液0.1 mL接种于划痕处，轻合眼睑按摩1 min。

实验动物分组及给药：40只兔接种金黄色葡萄球菌后24h，随机数字表法分为5组，每组各8只。A组为生理盐水对照组；B组为金黄色葡萄球菌组；C组为克拉霉素水溶液干预组；D组为克拉霉素脂质体干预组；E组为TPGS-克拉霉素脂质体干预组。

家兔感染后24 h，分别对C、D及E组家兔双眼内滴入1滴(约0.05 mL)浓度为1mg/mL的克拉霉素水溶液、克拉霉素脂质体（处方中除无TPGS，其他制备工艺及处方组成均与实施例3一致）、TPGS-克拉霉素脂质体（实施例3），每天2次，疗程10天，每天观察眼结膜炎消长情况，按结膜充血、水肿和分泌物量等临床症状将病情分为轻、中、重3级。作为感染对照，A组家兔感染后仅滴用灭菌生理盐水，B组家兔感染后未进行任何治疗。

药效学评价：

表5 金黄色葡萄球菌结膜炎模型兔的药效学评价

如表5中结果所示，经金黄色葡萄球菌感染后，各组重度家兔眼结膜炎均在87.5%以上。克拉霉素溶液干预组的治愈家兔结膜炎眼数为3，治疗有效率87.5%；克拉霉素脂质体干预组的治愈家兔结膜炎眼数为4，治疗有效率81.3%；TPGS-克拉霉素脂质体干预组的治愈家兔结膜炎眼数为9，治疗有效率为100%，明显高于其他各组，有力地证明了相比于其他对照组，TPGS-克拉霉素脂质体在药效学上的显著优势。

Claims

1.一种穿越人体粘液屏障的靶向给药脂质体制剂，其特征在于脂质体制剂的处方中含有治疗性物质、磷脂酰胆碱、磷脂酰甘油、甾醇类、油酸或油酸钠、亲水性的聚乙二醇嵌段共聚物；

其中，治疗性物质选自姜黄色素、地塞米松磷酸钠、克拉霉素、胰岛素干粉、多西他赛中的任意一种；

其中，亲水性的聚乙二醇嵌段共聚物为聚乙二醇1000-维生素E琥珀酸酯或聚乙二醇2000-维生素E琥珀酸酯或聚乙二醇3000-维生素E琥珀酸酯中的任意一种；

其中，穿越人体粘液屏障的靶向给药脂质体制剂的制备方法，如下所示：

（1）将处方量的治疗性物质在一定量有机溶剂中搅拌溶解制得溶液A；

（2）将按重量份计21%～40%磷脂酰甘油在少量的有机溶剂中溶解后与步骤（1）中制得的溶液A混合搅拌溶解制得溶液B；

（3）将按重量份计35%～60%的磷脂酰胆碱、1.6%～3.5%的甾醇、0.4%～0.85%的油酸或油酸钠在一定量的有机溶剂中溶解后与步骤（2）中制得的溶液B混合搅拌溶解制得溶液C；

（4）将步骤（3）中制得的混合均匀的溶液C干燥、除尽有机溶剂后得到含药粉末；

（5）取干燥粉末，加入按重量份计8.5%～22%的浓度为0.5～2%g/ml的亲水性的聚乙二醇嵌段共聚物的水溶液，温度控制在40～70℃，并以200～600转的速度搅拌1～2小时，得到水化溶液；

（7）将所得的脂质体液态溶液通过0.22μm微孔滤膜过滤，密封后保存；

其中，步骤（1）、（2）、（3）中的有机溶剂为甲醇、丙酮、乙腈、氯仿中的一种或多种；其中步骤（4）中干燥方法选自喷雾干燥、旋转蒸发中的任意一种。

2.根据权利要求1所述的穿越人体粘液屏障的靶向给药脂质体制剂，其特征在于亲水性的聚乙二醇嵌段共聚物包覆在脂质体制剂的表面。

3.根据权利要求1或2所述的脂质体制剂，其中磷脂酰胆碱选自大豆磷脂酰胆碱、蛋黄磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、蛋黄卵磷脂中的一种或多种。

4.根据权利要求1或2所述的脂质体制剂，其中磷脂酰甘油选自大豆磷脂酰甘油、蛋黄磷脂酰甘油、二硬脂酰磷脂酰甘油、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油中的一种或多种。

5.根据权利要求1或2所述的脂质体制剂，其中甾醇类选自胆固醇、豆甾醇、谷甾醇中的一种或多种。

6.根据权利要求1或2中所述的脂质体制剂，其中脂质体粒径的范围为20～200nm。