CN105997870B - 一种茯苓多糖聚乳酸纳米乳及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种茯苓多糖聚乳酸纳米乳，它是以丙酮、聚乳酸、茯苓多糖和丙二醇嵌段聚醚F68为原料，以复乳法制备得到的。本发明还公开了茯苓多糖聚乳酸纳米乳的制备方法和在制备免疫增强药物中的应用。与现有技术相比，本发明采用复乳法将茯苓多糖制备成茯苓多糖聚乳酸纳米乳，所得纳米乳悬液包封率高，而且便于药物的吸收，可以使药物缓慢地的释放，有效地延长药效，具免疫增强作用，对抵抗疫病有重要意义。本发明作为一种新型中兽药，没有副作用。

Description

一种茯苓多糖聚乳酸纳米乳及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于药物领域，具体涉及一种茯苓多糖聚乳酸纳米乳及其制备方法与应用。

背景技术

茯苓属于食药同用真菌，其有效成分主要有：多糖、生物碱、皂苷、萜类、多酚类等物质。真菌多糖是从真菌子实体、菌丝体及其发酵液中分离出的代谢产物，是一类由10个以上的单糖以糖苷键连接而成的天然高分子多聚物，具有特异的生物活性。茯苓多糖主要由β-(1→3)-D-葡聚糖组成，主要分布于茯苓的子实体、菌丝及其发酵液中。现代药理研究表明，茯苓多糖具有增强免疫功能的作用,可作为免疫增强剂,用于提高机体免疫力，主要表现在免疫增强或免疫刺激，诱导B淋巴细胞分泌抗体，与多种多糖比较，茯苓多糖增强B细胞产生抗体的能力最强。对茯苓多糖增强免疫的机制表明,茯苓多糖通过产生毒因子、释放溶酶体酶、与淋巴细胞协同破坏抗原和癌细胞、合成和释放干扰素、消除组织变态等反应完成。然而，茯苓多糖分子量较大，药物释放太快，会导致药量过大，副作用增强，不适用于临床。因此，解决这一问题成为必要。

聚乳酸是从上世纪90年代迅速发展起来的一种新的可生物降解高分子材料，通常采用乳酸缩聚或丙交酯的开环聚合来制备得到。聚乳酸具有良好的生物相容性，无毒、无刺激性，在人体内经水解可生成乳酸单体，然后在乳酸脱氢酶的氧化下生成丙酮酸，并参与体内三羧酸循环，最终生成水和二氧化碳从人体排出。肽类、蛋白类、酶类、疫苗等药物,易被胃肠道酸碱物质和各种消化酶分解,临床应用只能采取肠道外给药途径。制成聚乳酸纳米乳可保护被包裹药物不被破坏,加之适当的包衣,可有效控制纳米粒的体内降解。

本发明首次利用复乳法制备茯苓多糖聚乳酸纳米乳胶体悬液，对其工艺进行优化，并体外刺激小鼠淋巴细胞增值，建立了茯苓多糖聚乳酸纳米乳的制备方法，优化了制备条件，发现茯苓多糖聚乳酸纳米乳能显著提高茯苓多糖的免疫增强作用，提高其生物利用度。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种茯苓多糖聚乳酸纳米乳，以解决现有技术存在的临床应用中的各种限制问题。

本发明还要解决的技术问题是提供上述茯苓多糖聚乳酸纳米乳的制备方法。

本发明最后要解决的技术问题是提供上述茯苓多糖聚乳酸纳米乳的应用。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

一种制备茯苓多糖聚乳酸纳米乳的方法，它包括如下步骤：

(1)将丙酮和聚乳酸混合后使用磁力搅拌器搅拌至完全溶解，得到油相；将茯苓多糖溶于水后得到水相；一边搅拌油相，一边将水相逐滴滴加到油相中，直至形成稳定的W/O型初乳；

(2)将丙二醇嵌段聚醚F68溶于水后，从液面下缓慢加入步骤(1)中得到的W/O型初乳，磁力搅拌形成稳定的W/O/W型复乳；W/O/W型复乳经减压蒸发除去有机溶剂和离心去除较大沉淀后，收集上清液，即得茯苓多糖聚乳酸纳米乳。

步骤(1)中，油相中，聚乳酸的浓度为10～100mg/mL，优选30mg/mL。

步骤(1)中，水相中，茯苓多糖的浓度为5～25mg/mL，优选15mg/mL。

步骤(1)中，油相和内水相的体积比为3～13：1，优选10：1。

步骤(2)中，丙二醇嵌段聚醚F68和溶解丙二醇嵌段聚醚F68所用水的固液比为1～11mg：1mL。

步骤(2)中，溶解丙二醇嵌段聚醚F68所用水和溶解聚乳酸所用丙酮的体积比为4～12：1。

步骤(2)中，减压蒸发的方法为：在旋转蒸发仪上以55℃和100rpm的条件进行减压蒸发。

步骤(2)中，离心的方法为3500rpm离心8min。

上述制备方法中的任意一项制备得到的茯苓多糖聚乳酸纳米乳也在本发明的保护范围之内。

上述茯苓多糖聚乳酸纳米乳在制备免疫增强药物中的应用也在本发明的保护范围之内。

按此方法制备的茯苓多糖聚乳酸纳米乳，包封率高达59.09％。得到茯苓多糖聚乳酸纳米乳后，利用马尔文粒度分析仪对茯苓多糖聚乳酸纳米乳的粒径、多分散系数(PDI)及表面电势进行了分析，并通过透射电镜对茯苓多糖聚乳酸纳米乳的表面形态进行了研 究，发现茯苓多糖聚乳酸纳米乳呈现均一的纳米分散体系。

体外将茯苓多糖以及茯苓多糖聚乳酸纳米乳以一定浓度重悬，用透析袋模拟体内半透膜，探究两者的释放规律。发现茯苓多糖被聚乳酸包裹后，明显减缓了药物的释放。说明聚乳酸有缓释效果。

体外探究茯苓多糖聚乳酸纳米乳对小鼠淋巴细胞的最大安全浓度，在安全浓度下刺激淋巴细胞增值。发现与其他空白组相比，载药纳米乳组在不同浓度下均能显著刺激淋巴细胞增值。表明了其具有较好的免疫增强功能，对提高动物机体的免疫功能，防治疾病具有重要应用价值。

有益效果

动物疫病主要靠疫苗来预防，但是很多疫苗存在免疫原性较弱等缺点，需要免疫增强剂辅助才能产生强大的免疫应答。现有的常用免疫增强剂如油佐剂、铝胶佐剂等常存在刺激性强、有残留等缺点。由于中药具有绿色安全的特点，从中药中开发免疫增强剂已成为热点。

茯苓多糖是茯苓中所含的主要有效成分之一，具有抗肿瘤，增强巨嗜细胞和T淋巴细胞的细胞毒作用，增强细胞的免疫反应等广泛的生物学功能和药理学作用。然而，茯苓多糖作为一种免疫增强剂直接用于兽医临床，存在着分子量较大、药物释放太快，药量过大，副作用增强、生物利用度低等问题，免疫增强作用相对较弱，从而限制了临床应用。利用聚乳酸包封茯苓多糖，不仅可以防止茯苓多糖不稳定，解决用药量大等问题，而且可以有效维持茯苓多糖在机体内的有效浓度，提高其生物利用度。

本发明采用复乳法将茯苓多糖制备成茯苓多糖聚乳酸纳米乳，所得纳米乳悬液包封率高，而且便于药物的吸收，可以使药物缓慢地的释放，有效地延长药效，具免疫增强作用，对抵抗疫病有重要意义。本发明作为一种新型中兽药，没有副作用。

与现有技术相比，本发明优点如下：

1.茯苓多糖聚乳酸纳米乳的制备国内外未见报道，本发明提供了一种茯苓多糖聚乳酸纳米乳的制备方法及其优化的条件，填补了国内外研究的空白。

2.茯苓多糖聚乳酸纳米乳的免疫增强活性未见报道。通过本发明的实施，证明茯苓多糖通过制备成茯苓多糖聚乳酸纳米乳后能够显著提高其免疫增强活性，表现为体外刺激小鼠淋巴细胞增值，与茯苓多糖相比，具有较强的缓释作用，从而长时间增强动物免疫功能。因此，茯苓多糖聚乳酸纳米乳可以作为研制新型免疫增强剂的材料，为研制新 型免疫增强剂提供了材料和示范。

附图说明

图1A为空白聚乳酸纳米乳的透射电镜图；

图1B为茯苓多糖聚乳酸纳米乳的透射电镜图；

图2为茯苓多糖聚乳酸纳米乳和空白聚乳酸纳米乳的体外药物释放对比图。

图3为药物单独刺激淋巴细胞增殖的条件下，淋巴细胞生长对比图；

图4为药物协同LPS作用对淋巴细胞增殖的条件下，淋巴细胞生长对比图；

图5为药物协同PHA作用对淋巴细胞增殖的条件下，淋巴细胞生长对比图。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例1 茯苓多糖聚乳酸纳米乳的制备

精确称取10ml丙酮和300mg聚乳酸于10ml EP管中，使用磁力搅拌器形成油相；精确称取15mg的茯苓多糖，溶于1ml去离子水，形成水相。一边搅拌油相，一边将水相逐滴滴加到油相中，直至形成稳定的W/O型初乳；另精确称取360mgF68溶于110ml去离子水中，一边搅拌F68溶液，一边将初乳用移液枪缓慢打入液面下，磁力搅拌1.5h，形成稳定的W/O/W型复乳；于旋转蒸发仪上55℃100rpm减压蒸发除去有机溶剂；使用3500转8min离心去除较大沉淀，收集上清，即得包裹茯苓多糖的聚乳酸纳米乳。

制备空白聚乳酸纳米乳的方法同上，所不同的是，内水相中不添加茯苓多糖。

在单一因素考察的基础上，确定影响茯苓多糖聚乳酸纳米乳包封率的3个主要影响因素，即F68浓度(mg/ml)、聚乳酸浓度(mg/ml)和聚乳酸和茯苓多糖比值(o/w1)3个因素，以此3个因素为自变量，每个因素又选择3个水平，以包封率为响应值，做3因素3水平共17个试验点(5个中心点)二次回归正交组合试验。试验设计及结果见表1。

对表1中试验结果进行响应面分析，经过二次回归拟合后，得到茯苓多糖聚乳酸纳米乳的包封率对F68浓度(mg/ml)、聚乳酸浓度(mg/ml)和聚乳酸和茯苓多糖比值(o/w₁)的二次多项回归方程为：Y＝+53.62+5.45X₁-2.47X₂+1.47X₃+4.70X₁X₂+2.40X₁X₃-3.45X₂X₃-7.69X₁ ²+1.42X₂ ²-4.24X₃ ²

表1 Box-Behnken试验设计表及结果

利用Design expert 7.0软件对表1的结果进行多元线性回归拟合，对模型进行方差分析，结果见表2。由表2可知，模型P＜0.0001，表示模型极显著；说明该模型成立，本实验方法可靠。失拟项P＝0.0845＞0.05，不显著，表明回归方程无失拟因素存在，回归式拟合的较好。进一步说明在试验范围内可以用来解释和预测试验结果。模型中的A、B、C、AB、AC、BC的“P”值均小于0.05，说明其对茯苓多糖聚乳酸纳米乳包封率有显著影响；相关性R²＝0.9862，校正决定系数R_Adj ²＝0.9685，仅有约2％的茯苓多糖聚乳酸 纳米乳包封率总变异不能由此模型进行解释。综上表明，此模型拟合度好。

表2响应面模型方差分析表

通过响应面设计法优化得到制备茯苓多糖聚乳酸纳米乳的最佳制备条件为：F68浓度为3.3mg/ml，聚乳酸浓度为30mg/ml，聚乳酸与茯苓多糖比值为10.25：1，所得茯苓多糖聚乳酸纳米乳的包封率高达59.09％。

实施例2 茯苓多糖聚乳酸纳米乳的表征

(1)粒径电位检测及透射电镜观察

分别取实施例1中制备得到的茯苓多糖聚乳酸纳米乳和空白聚乳酸纳米乳，使用马尔文粒径分析仪分析两种纳米粒的粒径和电势，结果见表3。

表面形态使用透射电镜分析，结果见图1A和图1B。

表3

由表格可以看出，茯苓多糖聚乳酸纳米乳和空白聚乳酸纳米乳大小相差不大，在245nm左右，PDI值较小，表明粒径分散较集中，电势均为负值。

由透射电镜图可以看出，茯苓多糖聚乳酸纳米乳和空白聚乳酸纳米乳均呈现较均匀分布，粒子呈现圆形，表面光滑。电镜及粒径、电势分析表明茯苓多糖聚乳酸纳米乳具有优良的物理化学性质。

(2)体外药物释放

选择PBS(PH＝7.4)作为释放介质，其中包含0.1％吐温80，其作用是增加纳米乳在PBS中的溶解度。简单来说，冻干后的粒子分别称重后在1ml释放介质中重悬，加入透析袋中。然后将透析袋两头封紧，放进装有30ml释放介质的锥形瓶中。将锥形瓶放入摇床中，37℃，100rpm，模拟体液环境。选择特定时间间隔(2,4,6,8,10,12,24,48,72,96h)，取0.5ml释放介质于1.5mlEP管中，并加入等量新的释放介质于锥形瓶中。EP管中样品茯苓多糖的含量使用紫外分光光度计定量分析。

如图2所示，茯苓多糖聚乳酸纳米乳在前12小时出现突释现象，然后以一个较平缓、持续的速率释放，最后96小时，药物释放达到顶峰；茯苓多糖在前10个小时基本释放完毕。这个现象表明包裹在聚乳酸中的茯苓多糖体外释放药物要比多糖本身单独释放缓慢的多，这是茯苓多糖聚乳酸纳米乳的缓释作用，由于纳米粒最外层稳定剂具有保护作用。

实施例3 茯苓多糖聚乳酸纳米乳体外免疫增强活性比较

以实施例1中制备得到的茯苓多糖聚乳酸纳米乳(PHYP)为研究对象，以茯苓多糖(PHY)和实施例1中制备得到的空白聚乳酸纳米乳(PLA)作为对照，探索其体外对小鼠淋巴细胞的增值影响。

(1)脾脏淋巴细胞的准备

用颈椎脱臼法处死小鼠，75％乙醇浸泡3-5min。在超净台内，将小鼠置于一平皿中，左侧面朝上，在最后一根肋骨处打开皮肤和腹腔，小心取出脾脏，将脾移入200目钢筛。用剪刀和镊子将脾脏破碎，加入少许PBS，用玻璃注射器套心轻轻研磨脾脏，边研边加 PBS(加5mL左右即可)，使细胞悬液流入平皿中。将细胞悬液混匀后加入10mL离心管中，以1500r·min^-1离心8min，弃上清，加入适量红细胞裂解液，静置3min，以1500r·min^-1离心8min，沉淀经PBS反复洗涤2次。用DMEM细胞培养液调节细胞密度至5.0×10⁶个·mL^-1。

(2)最大安全浓度的测定

用RPMI-1640细胞培养液分别将PHYP和PHY自1mg·mL^-1倍比稀释至11个浓度。在96孔细胞培养板中，加入各浓度的PHYP和PHY，每孔100μL，每个浓度重复4孔，同时加入RPMI-1640细胞培养液设细胞对照组，按2.1.1所制得的淋巴细胞悬液加入细胞培养板除空白调零孔外其余孔中，每孔100μL。置于细胞培养箱中37℃、5％CO₂条件下连续培养48h后，每孔加入30μL MTT，继续培养4h，加入DMSO 100μL裂解细胞，微量震荡器震荡5min，待沉淀完全溶解，酶联免疫检测仪中测定570nm波长处的吸光值(A₅₇₀值)。PHYP和PHY组的A₅₇₀值显著高于细胞对照组时，表示PHYP和PHY促进细胞生长显著。选择A₅₇₀值不显著低于细胞对照组时的PHYP和PHY的最大浓度作为它们的最大安全浓度，结果见表4。

表4

由表可见，PHYP浓度在1000-125μg·mL^-1时的A₅₇₀值显著小于细胞对照(P<0.05)，浓度62.5μg·mL^-1至0.977μg·mL^-1与细胞对照差异均不显著(P>0.05)，且浓度为3.906μg·mL^-11时A₅₇₀值高于对照组，说明在此浓度，PHYP促进淋巴细胞的生长。PHY在1000μg·mL^-1至250μg·mL^-1的A₅₇₀值显著小于细胞对照(P<0.05)，在浓度125μg·mL^-1至1.953μg·mL^-1与细胞对照差异均不显著(P>0.05)，且浓度为125μg·mL^-1到1.953μg·mL^-1时A₅₇₀值均高于对照组，说明在此浓度范围内，PHY促进淋巴细胞的生长。PHYP在62.5μg·mL^-1时的A₅₇₀值不显著小于细胞对照组(P>0.05)，PHY在125μg·mL^-1时的A₅₇₀值不显著小于细胞对照组(P>0.05)。因此，将62.5μg·mL^-1和125μg·mL^-1分别定为PHYP和PHY的最大安全浓度。

(3)淋巴细胞增殖测定

淋巴细胞制备同上，将细胞悬液加到96孔细胞板中，每孔80μL，每个样品重复12个孔，每孔100μL，其中4个孔每孔加PHA(20μg·mL^-1)20uL，另外4个孔每孔加LPS(10μg·mL^-1)20uL，剩余4个孔每孔加RPMI-1640(不含小牛血清)20μL。用PHA刺激T淋巴细胞增殖，LPS刺激B淋巴细胞增殖。37℃、5％CO₂条件下培养44h后，每孔加入30μL MTT，继续培养4h。将每孔中的上清弃去，加入100μL DMSO，在微量振荡器上振荡5min左右使沉淀完全溶解。用酶联免疫仪检测570nm波长处的吸光值(A₅₇₀)。

在药物单独刺激淋巴细胞增殖的情况下，由图3可知，PHYP组在3.906-62.5μg·mL^-1浓度的A₅₇₀值均显著高于PHY、PLA以及BL组(P<0.05)；PHY组在3.906-62.5μg·mL^-1浓度的A₅₇₀值均显著高于PLA组和BL组(P<0.05)；表明这些浓度下刺激淋巴细胞生长。PLA组与对照组的差异不明显。

在药物协同LPS作用对淋巴细胞增殖的情况下，如图4所示，在浓度为3.906-62.5μg·mL^-1时，PHYP组的A₅₇₀值均为最高，并且均显著高于PHY、PLA、LPS对照组以及BL对照组(P<0.05)；PHY组在3.906-62.5μg·mL^-1时的A₅₇₀值均显著高于LPS组(P>0.05)，且在3.906、7.813以及62.5μg·mL^-1均显著高于PLA组。表明它们在这些浓度均能协同LPS促进淋巴细胞增殖，并且PHYP协同LPS作用促进淋巴细胞增殖的效果在适合浓度下强于PHY。

在药物协同PHA刺激时淋巴细胞增殖的情况下，如图5所示，浓度范围在3.906-62.5μg·mL^-1时，PHYP组的A₅₇₀值均为最高，并且均显著高于PHA对照组及细胞 对照组(P<0.05)，且在3.906、7.813和62.5μg·mL^-1时显著高于PHY组(P<0.05)；PHY组在3.906-31.25μg·mL^-1时的A₅₇₀值均显著高于PLA组(P<0.05)，在3.906-62.5μg·mL^-1时的A₅₇₀值均显著高于PHA组(P<0.05)；PLA在浓度范围15.625-62.5μg·mL^-1时的A₅₇₀值均显著高于PHA组；而PHA组均显著高于BL空白对照组(P<0.05)。表明PHYP、PHY和PLA在这些浓度时，能协同PHA促进淋巴细胞的增殖，并且PHYP协同PHA作用促进淋巴细胞增殖的效果强于PHY和PLA，且显效范围大。

根据上述体外刺激淋巴细胞增值试验结果可以得出茯苓多糖聚乳酸纳米乳能够单独和协同PHA、LPS分别刺激T、B淋巴细胞增值，结果显示所有浓度组均显著比对照组高。说明本发明涉及的茯苓多糖聚乳酸纳米乳能够提高机体免疫功能，可用于提高动物机体免疫功能以达到抵抗疾病的目的。

Claims (3)

1.一种制备茯苓多糖聚乳酸纳米乳的方法，其特征在于，它包括如下步骤：

（1）将丙酮和聚乳酸混合后搅拌，得到油相；将茯苓多糖溶于水后得到水相；将水相加入油相中，搅拌形成稳定的W/O型初乳；

（2）将丙二醇嵌段聚醚F68溶于水后，加入步骤（1）中得到的W/O型初乳，搅拌形成稳定的W/O/W型复乳；W/O/W型复乳经减压蒸发和离心后收集上清液，即得茯苓多糖聚乳酸纳米乳；

步骤（1）中，油相中，聚乳酸的浓度为10~100mg/mL；

步骤（1）中，水相中，茯苓多糖的浓度为5~25 mg/mL；

步骤（1）中，油相和内水相的体积比为3~13：1；

步骤（2）中，丙二醇嵌段聚醚F68和溶解丙二醇嵌段聚醚F68所用水的固液比为1~11mg：1 mL；

溶解丙二醇嵌段聚醚F68所用水和溶解聚乳酸所用丙酮的体积比为4~12：1。

2.权利要求1所述的制备方法制备得到的茯苓多糖聚乳酸纳米乳。

3.权利要求2所述的茯苓多糖聚乳酸纳米乳在制备免疫增强药物中的应用。