CN108517342A - 一种多藻蛋白酶解制备多肽的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种多藻蛋白酶解制备多肽的方法，通过对含油量较高的小球藻进行提油处理，配合适量的螺旋藻和裸藻，均质后在pH3‑5条件下使用胃蛋白酶和菠萝蛋白酶的复合酶进行酶解，能有效提高水溶性蛋白及多肽的转化率，经超滤离心后得到的产品的形态具有较好地表面形态和均一性。
Description
技术领域
本发明涉及保健品技术领域，尤其涉及一种多藻蛋白酶解制备多肽的方法。
背景技术
目前，小球藻(Chlorella pyenoidosa)是一类普生性单细胞绿藻，属于绿藻门、小球藻属，生长速度快，易于培养，应用价值高。小球藻含有丰富的生物活性物质和药用成分，作为一种新型保健食品和药物蕴藏着巨大潜力。小球藻具有抗肿瘤活性、增加免疫力、解毒保肝、降压作用等，其粗蛋白含量高(50％左右)，品质好，已经成为小球藻应用领域十分活跃、备受重视的一个方面。
螺旋藻营养成分的特点是蛋白质含量高，而脂肪、纤维素含量低，并且还含有种类繁多的维生素，它是维生素B12和β-胡萝卜素含量最高的食品，螺旋藻所含的类脂几乎全都是重要的不饱和脂肪酸类，胆固醇含量极微。
裸藻富含人体所必需的维生素、矿物质、蛋白质、脂类、碳水化物等多种营养素和生物活性物质，具有抗氧化、降血脂、降血糖和抗肿瘤等多种生物学功效。目前国内外厂家生产的裸藻干粉，是采用将裸藻脱水干燥后再研磨成粉末的工艺制备而成。在制备裸藻干粉的过程中，包绕着裸藻细胞内容物的表层浆膜被直接干燥。由于该浆膜是由蛋白、脂类和糖类等物质组成，干燥后稳定性极强，很不易在人体胃肠道中消化，并会因此而影响机体对裸藻细胞内物质的吸收，也必将会因此而影响裸藻的生物活性。裸藻干燥重量中百分之五十是蛋白质，其质量优于植物产生的蛋白质，内含20种氨基酸，其中有异亮氨酸等9种人体必需的氨基酸，比小球藻更适合作为食品。
但这三种藻中所含的蛋白质均需通过人体的消化后才能被吸收。生物活性肽是指那些具有特殊生理活性或功能特性的肽类。绝大多数蛋白质都是具有一定功能作用的生物活性肽的前体物质，其肽链结构中存在着具有一定生物活性的氨基酸序列片段(功能区)，在正常状态下，其功能区肽段隐藏在肽链中，但一旦单独从蛋白质肽链中释放出来，在适当的环境下，就能显示出独特的生物活性，这个功能肽段就是生物活性肽。现代生物代谢研究发现：人类摄取的蛋白质经过消化道的多种酶水解后，更多的是以低肽的形式直接吸收，具有更高的营养价值和生物效价。酶水解法获得生物活性肽已经成为工业化生产生物活性肽的主要手段。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种富含易于被人体吸收的多肽的多藻蛋白酶解制备多肽的方法。
本发明通过生物工程在体外酶解后，使藻类蛋白成为生物活性肽而直接被吸收。
一种多藻蛋白酶解制备多肽的方法，包括以下步骤：
1)预处理：将小球藻进行提油处理；
2)均质：向步骤1)处理后的小球藻中加入螺旋藻和裸藻，加入干重5-8倍重量的水，于10-25℃、50-250MPa条件下破碎均质，得到均质液；
3)酶解：向步骤2)处理后的均质液中，以100-300IU/mL的浓度加入菠萝蛋白酶和胃蛋白酶组成的混合酶液，于30-40℃，pH＝3-6条件下酶解，得到酶解液；
4)灭酶：将酶解液升温至65-75℃灭酶，冷却至室温后将酶解液离心，取上清液；
5)超滤：经超滤离心管过滤截留分子量为5kDa以下的多肽分子；
6)干燥：对多肽分子进行真空冷冻干燥。
进一步地，步骤1中，向小球藻加入1,2-二甲氧基乙烷和水，破碎均质，静置，弃去上层有机相。
进一步地，小球藻、1,2-二甲氧基乙烷和水的质量比为1:(2-3):(2-3)。
进一步地，步骤2)中，所述小球藻、螺旋藻和裸藻的干重质量比为(3-5):(1-3):(0.01-0.1)。
进一步地，步骤2)中，所述小球藻、螺旋藻和裸藻的干重质量比为(3-3.5):(1-1.5):(0.01-0.03)。
进一步地，步骤2)中，所述小球藻、螺旋藻和裸藻的干重质量比为3:(0.8-1.2):(0.01-0.3)。
进一步地，步骤3)中，所述菠萝蛋白酶和胃蛋白酶的活力为(1-3):1。
进一步地，步骤3)中，pH＝3-4。
进一步地，步骤6)中，干燥温度为-20--30℃，压力为5-10Pa。
相比现有技术，本发明的有益效果在于：
本发明通过对含油量较高的小球藻进行提油处理，配合适量的螺旋藻和裸藻，均质后在pH3-5条件下使用胃蛋白酶和菠萝蛋白酶的复合酶进行酶解，能有效提高水溶性蛋白及多肽的转化率，经超滤离心后得到的产品的形态具有较好地表面形态和均一性。
附图说明
图1为实施例1的产品的扫描电镜(SEM)图；
图2为实施例2的产品的扫描电镜(SEM)图。
具体实施方式
下面，结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。
实施例1：
1)预处理：向300g小球藻加入700g 1,2-二甲氧基乙烷和0.8L水，于15℃、120MPa条件下破碎均质，静置，弃去上层有机相，
2)均质：向步骤1)处理后的小球藻中加入100g螺旋藻和2g裸藻，加入1.6L的水，于15℃、120MPa条件下破碎均质，得到均质液；
3)酶解：向步骤2)处理后的中，以200IU/mL的浓度加入菠萝蛋白酶和胃蛋白酶组成的混合酶液，于36℃，pH＝4条件下酶解，得到酶解液；菠萝蛋白酶和胃蛋白酶的活力比为2:1；
4)灭酶：将酶解液升温至70℃灭酶，冷却至室温后将酶解液于4000rpm离心，取上清液；
5)超滤：上清液经超滤离心管过滤截留分子量为5kDa以下的多肽分子；
6)干燥：于-25℃，压力为7.5Pa下对多肽分子进行真空冷冻干燥，收得干品。
实施例1得到的干品的扫描电镜(SEM)图如图1和图2所示，呈微米级的球状。
实施例2：
1)预处理：向300g小球藻加入700g 1,2-二甲氧基乙烷和0.8L水，于15℃、120MPa条件下破碎均质，静置，弃去上层有机相，
2)均质：向步骤1)处理后的小球藻中加入120g螺旋藻和3g裸藻，加入1.7L的水，于15℃、120MPa条件下破碎均质；
3)酶解：向步骤2)处理后的均质液中，以200IU/mL的浓度加入菠萝蛋白酶和胃蛋白酶组成的混合酶液，于36℃，pH＝4条件下酶解，得到酶解液；菠萝蛋白酶和胃蛋白酶的活力比为3:1；
4)灭酶：将酶解液升温至70℃灭酶，冷却至室温后将酶解液于4000rpm离心，取上清液；
5)超滤：上清液经超滤离心管过滤截留分子量为5kDa以下的多肽分子；
6)干燥：于-25℃，压力为7.5Pa下对多肽分子进行真空冷冻干燥，收得干品。
实施例3：
1)预处理：向300g小球藻加入700g 1,2-二甲氧基乙烷和0.8L水，于15℃、120MPa条件下破碎均质，静置，弃去上层有机相，
2)均质：向步骤1)处理后的小球藻中加入130g螺旋藻和4g裸藻，加入1.8L的水，于15℃、120MPa条件下破碎均质；
3)酶解：向步骤2)处理后的均质液中，以220IU/mL的浓度加入菠萝蛋白酶和胃蛋白酶组成的混合酶液，于36℃，pH＝4条件下酶解，得到酶解液；菠萝蛋白酶和胃蛋白酶的活力比为1:1；
4)灭酶：将酶解液升温至70℃灭酶，冷却至室温后将酶解液于4000rpm离心，取上清液；
5)超滤：上清液经超滤离心管过滤截留分子量为5kDa以下的多肽分子；
6)干燥：于-25℃，压力为7.5Pa下对多肽分子进行真空冷冻干燥，收得干品。
对比例1：
1)均质：向300g小球藻中加入100g螺旋藻和2g裸藻，加入3L水，于15℃、120MPa条件下破碎均质；
2)酶解：向步骤1)处理后的均质液中，以200IU/mL的浓度加入菠萝蛋白酶和胃蛋白酶组成的混合酶液，于30-40℃，pH＝4条件下酶解，得到酶解液；菠萝蛋白酶和胃蛋白酶的活力比为2:1；
3)灭酶：将酶解液升温至70℃灭酶，冷却至室温后将酶解液于4000rpm离心，取上清液；
4)超滤：上清液经超滤离心管过滤截留分子量为5kDa以下的多肽分子；
5)干燥：对多肽分子进行真空冷冻干燥。
对比例2：
1)预处理：向300g小球藻加入700g二甲氧基乙烷和0.8L水，于15℃、120MPa条件下破碎均质，静置，弃去上层有机相，
2)均质：向步骤1)处理后的小球藻中加入100g螺旋藻和2g裸藻，加入1.6L的水，于15℃、120MPa条件下破碎均质；
3)酶解：向步骤2)处理后的均质液中，以200IU/mL的浓度加入菠萝蛋白酶和胃蛋白酶组成的混合酶液，于36℃，pH＝6条件下酶解，得到酶解液；菠萝蛋白酶和胃蛋白酶的活力比为1:1；
4)灭酶：将酶解液升温至70℃灭酶，冷却至室温后将酶解液于4000rpm离心，取上清液；
5)超滤：上清液经超滤离心管过滤截留分子量为5kDa以下的多肽分子；
6)干燥：于-25℃，压力为7.5Pa下对多肽分子进行真空冷冻干燥，收得干品。
对比例3：
1)预处理：向300g小球藻加入700g二甲氧基乙烷和0.8L水，于15℃、120MPa条件下破碎均质，静置，弃去上层有机相，
2)均质：向步骤1)处理后的小球藻中加入100g螺旋藻和2g裸藻，加入1.6L的水，于15℃、120MPa条件下破碎均质；
3)酶解：向步骤2)处理后的均质液中，以200IU/mL的浓度加入菠萝蛋白酶和胃蛋白酶组成的混合酶液，于36℃，pH＝2条件下酶解，得到酶解液；菠萝蛋白酶和胃蛋白酶的活力比为1:1；
4)灭酶：将酶解液升温至70℃灭酶，冷却至室温后将酶解液于4000rpm离心，取上清液；
5)超滤：上清液经超滤离心管过滤截留分子量为5kDa以下的多肽分子；
6)干燥：于-25℃，压力为7.5Pa下对多肽分子进行真空冷冻干燥，收得干品。
对比例4：
1)预处理：向300g小球藻加入700g二甲氧基乙烷和0.8L水，于15℃、120MPa条件下破碎均质，静置，弃去上层有机相，
2)均质：向步骤1)处理后的小球藻中加入100g螺旋藻，加入1.6L的水，于15℃、120MPa条件下破碎均质；
3)酶解：向步骤2)处理后的均质液中，以200IU/mL的浓度加入菠萝蛋白酶和胃蛋白酶组成的混合酶液，于36℃、pH＝4条件下酶解，得到酶解液；菠萝蛋白酶和胃蛋白酶的活力比为1:1；
4)灭酶：将酶解液升温至70℃灭酶，冷却至室温后将酶解液于4000rpm离心，取上清液；
5)超滤：上清液经超滤离心管过滤截留分子量为5kDa以下的多肽分子；
6)干燥：于-25℃，压力为7.5Pa下对多肽分子进行真空冷冻干燥，收得干品。
对比例5
1)预处理：向400g小球藻加入900g二甲氧基乙烷和1L水，于15℃、120MPa条件下破碎均质，静置，弃去上层有机相，
2)均质：向步骤1)处理后的小球藻中加入2g裸藻，加入1.2L的水，于15℃、120MPa条件下破碎均质，得到均质液；
3)酶解：向步骤2)处理后的中，以200IU/mL的浓度加入菠萝蛋白酶和胃蛋白酶组成的混合酶液，于36℃、pH＝4条件下酶解，得到酶解液；
4)灭酶：将酶解液升温至70℃灭酶，冷却至室温后将酶解液于4000rpm离心，取上清液；
5)超滤：上清液经超滤离心管过滤截留分子量为5kDa以下的多肽分子；
6)干燥：于-25℃，压力为7.5Pa下对多肽分子进行真空冷冻干燥，收得干品。
对比例6
1)预处理：向300g小球藻加入700g二甲氧基乙烷和0.8L水，于15℃、120MPa条件下破碎均质，静置，弃去上层有机相，
2)均质：向步骤1)处理后的小球藻中加入100g螺旋藻和2g裸藻，加入1.6L的水，于15℃、120MPa条件下破碎均质，得到均质液；
3)酶解：向步骤2)处理后的中，以200IU/mL的浓度加入胃蛋白酶，于36℃，pH＝4条件下酶解，得到酶解液；
4)灭酶：将酶解液升温至70℃灭酶，冷却至室温后将酶解液于4000rpm离心，取上清液；
5)超滤：上清液经超滤离心管过滤截留分子量为5kDa以下的多肽分子；
6)干燥：于-25℃，压力为7.5Pa下对多肽分子进行真空冷冻干燥，收得干品。
对比例7
1)预处理：向300g小球藻加入700g二甲氧基乙烷和0.8L水，于15℃、120MPa条件下破碎均质，静置，弃去上层有机相，
2)均质：向步骤1)处理后的小球藻中加入100g螺旋藻和2g裸藻，加入1.6L的水，于15℃、120MPa条件下破碎均质，得到均质液；
3)酶解：向步骤2)处理后的中，以200IU/mL的浓度加入菠萝蛋白酶，于36℃，pH＝4条件下酶解，得到酶解液；
4)灭酶：将酶解液升温至70℃灭酶，冷却至室温后将酶解液于4000rpm离心，取上清液；
5)超滤：上清液经超滤离心管过滤截留分子量为5kDa以下的多肽分子；
6)干燥：于-25℃，压力为7.5Pa下对多肽分子进行真空冷冻干燥，收得干品。
性能检测与效果评价
1.可溶性蛋白的转化率
取实施例1-3和对比例1-7的酶解液，加入等体积的30wt％三氯乙酸，混合均匀，静置15min，然后离心，取上清液，测定蛋白含量P1，即为酶解液可溶性蛋白含量。
取实施例1-3和对比例1-7的均质液，测定总蛋白质含量P0。
结果如下表所示：
表1可溶性蛋白的转化率
| 实施例1 | 实施例2 | 实施例3 | 对比例1 | 对比例2 | |
| 转化率[％] | 52.3 | 50.9 | 50.4 | 34.8 | 32.7 |
| 对比例3 | 对比例4 | 对比例5 | 对比例6 | 对比例7 | |
| 转化率[％] | 53.1 | 50.2 | 50.5 | 33.6 | 23.8 |
由表1可知，对比例1当不进行提油处理时，高含量的油脂在一定程度导致了可溶性蛋白的转化率降低了；通过对比例2可知，pH超过5，导致蛋白酶的活性不高；对比例4和对比例5不含裸藻或螺旋藻，可溶性蛋白的转化率并没有受到较大幅度地降低；对比例6和对比例7只使用胃蛋白酶或只使用菠萝蛋白酶，可溶性蛋白的转化率大幅下降。
2.多肽转化率
取实施例1-3和对比例1-7的酶解液，计算游离氨基酸的含量P2，计算多肽转化率：
结果如下表所示。
表2多肽的转化率
| 实施例1 | 实施例2 | 实施例3 | 对比例1 | 对比例2 | |
| 转化率[％] | 47.6 | 46.9 | 45.1 | 30.2 | 29.3 |
| 对比例3 | 对比例4 | 对比例5 | 对比例6 | 对比例7 | |
| 转化率[％] | 31.7 | 46.0 | 46.8 | 30.3 | 22.9 |
由表2可知，采用本申请提供的方法的多肽转化率为45-48％，在pH＝2时，虽然可溶性蛋白的转化率可观，但其游离的氨基酸较多，导致多肽的转化率偏低。单独使用胃蛋白酶或只使用菠萝蛋白酶，多肽的转化率大幅下降。
上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。
Claims (9)
1.一种多藻蛋白酶解制备多肽的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)预处理：将小球藻进行提油处理；
2)均质：向步骤1)处理后的小球藻中加入螺旋藻和裸藻，加入干重5-8倍重量的水，于10-25℃、50-250MPa条件下破碎均质，得到均质液；
3)酶解：向步骤2)处理后的均质液中，以100-300IU/mL的浓度加入菠萝蛋白酶和胃蛋白酶组成的混合酶液，于30-40℃、pH＝3-6条件下酶解，得到酶解液；
4)灭酶：将酶解液升温至65-75℃灭酶，冷却至室温后将酶解液离心，取上清液；
5)超滤：经超滤离心管过滤截留分子量为5kDa以下的多肽分子；
6)干燥：对多肽分子进行真空冷冻干燥。
2.如权利要求1所述的多藻蛋白酶解制备多肽的方法，其特征在于，步骤1中，向小球藻加入1,2-二甲氧基乙烷和水，破碎均质，静置，弃去上层有机相。
3.如权利要求2所述的多藻蛋白酶解制备多肽的方法，其特征在于，小球藻、1,2-二甲氧基乙烷和水的质量比为1:(2-3):(2-3)。
4.如权利要求1所述的多藻蛋白酶解制备多肽的方法，其特征在于，步骤2)中，所述小球藻、螺旋藻和裸藻的干重质量比为(3-5):(1-3):(0.01-0.1)。
5.如权利要求1所述的多藻蛋白酶解制备多肽的方法，其特征在于，步骤2)中，所述小球藻、螺旋藻和裸藻的干重质量比为(3-3.5):(1-1.5):(0.01-0.03)。
6.如权利要求1所述的多藻蛋白酶解制备多肽的方法，其特征在于，步骤2)中，所述小球藻、螺旋藻和裸藻的干重质量比为3:(0.8-1.2):(0.01-0.3)。
7.如权利要求1所述的多藻蛋白酶解制备多肽的方法，其特征在于，步骤3)中，所述菠萝蛋白酶和胃蛋白酶的活力为(1-3):1。
8.如权利要求1所述的多藻蛋白酶解制备多肽的方法，其特征在于，步骤3)中，pH＝3-4。
9.如权利要求1所述的多藻蛋白酶解制备多肽的方法，其特征在于，步骤6)中，干燥温度为-20--30℃，压力为5-10Pa。
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