CN102000121B - 北虫草寡肽组合物及其制备方法和使用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种从北虫草中提取含有纳米寡肽的组合物的方法和通过该方法提取得到的组合物。本发明采用复合酶法水解北虫草，获得小分子的纳米寡肽，其特征在于，所述纳米寡肽的分子量主要分布在100-1000D之间，优选的，所述组合物中分子量为100-500D的纳米寡肽的高斯分布峰面积百分比超过50%。本发明提供的北虫草寡肽提取物中同时保留了其它活性成分，包括虫草素、蜕皮酮、腺苷、虫草多糖、虫草酸、微量元素、各族维生素、以及游离氨基酸。本发明还涉及从北虫草中提取得到的含有纳米寡肽的组合物在制备医药、保健品、化妆品中的应用。

Description

北虫草寡肽组合物及其制备方法和使用

技术领域

本发明涉及一种从北虫草中提取得到纳米寡肽的方法和通过该方法提取得到的组合物。本发明还涉及从北虫草中提取得到的含有纳米寡肽的组合物在医药、保健品、化妆品中的应用。

背景技术

冬虫夏草是麦角菌科虫草真菌(Cordycceps sinensis)的子座及其寄生主蝙蝠蛾(Heplalus armaricanus)幼虫尸体的复合体。现代药理实验证明，冬虫夏草具有抗衰老、提高免疫力、抗癌、抗病毒、抗惊厥及镇静作用、雄性激素样作用, 对心脑血管系统也有保护作用。由于受生长条件的限制，天然虫草产量有限，野生资源已受到过度的采掘，产量逐年减少，远远不能满足人们生活的需要。

北虫草(Cordyceps militaris (L.) Link)又称北冬虫夏草，俗称蛹虫草。目前北虫草液体、固体及蛹体培养技术已经成熟并进入了工业化生产。研究发现，人工培育的北虫草子实体中一般营养成分与天然冬虫夏草对比发现，虫草素与多糖含量比野生冬虫夏草要高，二者的氨基酸组成完全一致、不同氨基酸的含量略有差异但总量基本相当。药理试验证明，人工培养的北虫草子实体同样具有与天然虫草一样的药理功能。

北虫草含有多种营养成分。北虫草的子实体中一般营养成分如下：水分2．31％,灰分0．33％，粗蛋白28．67％，粗脂肪2．52％，粗纤维1．6％，核苷酸1．50％，SOD (鲜)3．78％，虫草多糖5．54％。蛋白质为虫草中含量最多的功效成分。过去的观点认为，动物的消化道只能吸收游离的氨基酸，即蛋白质必须分解成游离的氨基酸才能被吸收，近年来的研究发现，寡肽可以完整的形式被吸收进入循环系统而被组织利用。

在营养和化妆行业，对冬虫夏草进行提取处理获得更高纯度的有效成分物质是常用的手段。目前比较流行的虫草的营养制剂的提取方法是粗加工的方式，包括蒸煮、回流或索氏提取等方式。这些方法获得的虫草制剂中含有大量不需要的物质，另外，其有效成分物质的纯度仍然不够，特别是蛋白质通常还保留几乎完整的大分子形式。大分子形式的蛋白质生物利用度一般比较低，在营养和化妆行业中是不利的。

而多肽，特别是小分子肽有以下特点：

（1）不需消化，直接吸收。

（2）吸收时不需消耗人体能量。

（3）不增加人体胃肠功能负担。

（4）具优先吸收特点。

（5）吸收快速，比人体吸收大分子蛋白质快129600秒钟，较人体氨基酸快64800秒钟。

（6）以自身能量推动吸收。

（7）100%被吸收。

（8）在人体吸收功能降低时，人体能够被动吸收。

（9）具有载体作用，可将人体其它营养载在基体上，输送到人体细胞组织。

（10）在人体内变成运输工具，将各种微量元素送到人体各部位。

（11）具有极强的活性和生理功能多样性。

因此，人们通过各种水解方法把蛋白水解变成小的肽，以提高其生物利用度。

专利 CN200710030010.X中用酸解和超声波共同处理虫草粉，得到一种活性提取物。

专利 CN200510040961.6中用单一的中性蛋白酶处理含有虫草粉和其它如蚕蛹和蛋等营养物质的混合物，得到一种保健化妆品制品。

专利 CN200510016899.7中采用木瓜蛋白酶或胰蛋白酶对北虫草菌进行蛋白酶水解，然后再通过纳米机对水解产物进行处理，得到产物分子量分布在100-200nm范围。

专利CN200710077253.9中对含有包括虫草粉在内的三种菌类的混合物用单一的中性蛋白酶进行完全酶解处理，得到一种营养制品。

专利CN200710159152.6中对北虫草用胃蛋白酶、HAP碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰酶、碱性内切蛋白酶、纤维素溶壁酶中的一种或多种进行处理，得到一种营养制品。

然而，本领域仍然需要具有更低分子量的北虫草小分子肽制品，例如大部分为含有长度低于十个氨基酸，优选为两个到五个氨基酸的小分子肽，其分子的长度为0.1-10nm水平。

发明内容

 本发明提供了一种从北虫草中水解提取得到纳米寡肽的方法，其中采用复合酶法水解北虫草，获得含有小分子纳米寡肽的组合物，其特征在于，所述纳米寡肽的分子量主要分布在100-1000D之间。在本发明的一个方面，所述组合物中分子量为100-500D的纳米寡肽的高斯分布峰面积百分比超过50%，优选超过70%。在本发明的又一个方面，所述组合物中纳米寡肽的高斯分布峰值分子量约为 150-500D。在本发明的又一个方面，所述组合物中纳米寡肽的分子量具有如下的高斯分布：

 在本发明中，采用复合酶法水解北虫草，其中采用的酶是3种或3种以上水解酶的组合，所述水解酶选自胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、基质金属蛋白酶、中性蛋白酶和菠萝蛋白酶。优选的，在本发明的复合酶水解方法中采用的酶含有碱性蛋白酶、中性蛋白酶和胃蛋白酶。本发明采用的对北虫草进行水解的复合酶法，制备得到了分子量主要分布在100-1000D之间的纳米寡肽。在本发明的一个方面，所述组合物中分子量为1000-500D的纳米寡肽的高斯分布峰面积百分比超过50%，优选超过70%。现有技术中没有报道过从北虫草中获得上述分子量主要分布在100-1000D之间的纳米寡肽。不限于任何理论的限制，本发明的方法能够制备得到含有所述纳米寡肽的组合物，其中一个原因可能是由于酶具有专一性，一种酶只能水解特定肽键，水解度较低，得到的多为多肽，为100-500nm水平；而本专利方法，利用复合酶分布水解，得到分子量更低的小分子肽，多为二肽到四肽的寡肽，为0.1-10nm水平。

在本发明的又一个方面，在采用复合酶法对北虫草进行水解时，加入酶的顺序是碱性蛋白酶、中性蛋白酶和胃蛋白酶。在本发明的方法中，使用碱性蛋白酶、中性蛋白酶和胃蛋白酶以及根据上述加入酶的顺序，能够大大地改进本发明方法的工艺，相对不是使用所述酶和根据上述加入酶的顺序，能够减少很多工艺步骤，节省操作的时间，以及节约原料和中间材料。更重要的，而且出乎意料地发现，采用以上加入酶的顺序，能够更有效地得到需要的纳米寡肽提取物，即所述组合物中纳米寡肽分子量主要分布在100-1000D之间，多为二肽到四肽的寡肽。在本发明的一个方面，所述组合物中100-500D的纳米寡肽的高斯分布峰面积百分比超过50%，优选超过70%。在本发明的又一个方面，所述组合物中纳米寡肽的高斯分布峰值分子量约为 150-500D。

本发明提供的一种从北虫草中水解提取得到纳米寡肽的方法包括以下步骤：

a)       将虫草子实体烘干，粉碎成50-200目细粉；

b)      将所述细粉与去离子水按1:10-1:50混合；

c)       蛋白质变性处理，将混合液升温至90-95℃，保持10-15min；

d)      把所述混合液降温至50-60℃，按子实体干重的1重量%-3重量%加入50万u/g碱性蛋白酶，调节pH至8-9，50-60℃保温2-4h；

e)       降温至40-50℃，按子实体干重1重量%-3重量%加入15万u/g中性蛋白酶，调节pH至7-7.5，40-50℃保温2-4h；

f)        调pH至3.0-4.0，按子实体干重1重量%-3重量%加入5万u/g胃蛋白酶，升温至50-60℃，保持2-4h；

g)       升温至95-100℃，保持10-20min，灭酶；

h)      粗过滤；

i)         加重量2-3重量%的活性炭，70-75℃脱色0.5-1h；

j)         用硅藻土过滤机过滤得澄清微黄色小分子肽液体；

k)      浓缩，进行喷雾干燥或冷冻干燥得到淡黄色粉末。

在本发明的上述方法中，步骤a）中优选目数为100-150目，步骤b）中优选比例为1:10-1:20，步骤c）中优选温度为约90℃；时间为约10min，步骤d）中优选添加酶的量为子实体干重的1-1.2重量%，最优选为子实体干重的1重量%；优选温度为约50℃；优选pH8.2-8.5；维持时间为3-3.2h。步骤e）中优选添加酶的量为子实体干重的1-1.2重量%，最优选为子实体干重的1重量%；优选温度为约50℃；优选pH7.3；维持时间为3-3.2h。步骤f）中优选添加酶的量为子实体干重的1-3重量%，最优选为子实体干重的1重量%；优选ph3.6，优选温度为55℃，时间为3-3.2h。步骤g）中优选温度95℃，时间15min。本发明的方法中的优选技术方案中采用的使用酶的量和水解时间能够更有效地得到需要的纳米寡肽提取物，即分子量主要分布在100-1000D之间的纳米寡肽，在本发明的一个方面，所述组合物中100-500D的纳米寡肽的高斯分布峰面积百分比超过50%，优选超过70%。

本发明提供了一种从北虫草水解提取得到的组合物，所述水解为用复合酶法对北虫草蛋白进行水解，其特征在于，所述组合物中含有北虫草蛋白水解得到的纳米寡肽，所述纳米寡肽的分子量主要分布在100-1000D之间。在本发明的一个方面，所述组合物中100-500D的纳米寡肽的高斯分布峰面积百分比超过50%，优选超过70%。在本发明的又一个方面，所述组合物中纳米寡肽的高斯分布峰值分子量约为 150-500D。在本发明的又一个方面，所述组合物中小分子的寡肽的分子量具有以下的高斯分布：

在本发明的一个方面，其中水解所采用的酶是3种或3种以上水解酶的组合，所述水解酶选自胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、基质金属蛋白酶、中性蛋白酶和菠萝蛋白酶。在本发明的又一个方面，其中水解所采用的酶含有碱性蛋白酶、中性蛋白酶和胃蛋白酶，优选的，所示水解中加入酶的顺序是碱性蛋白酶、中性蛋白酶和胃蛋白酶。

本发明提供的从北虫草水解提取得到的组合物中还含有虫草素、蜕皮酮、腺苷、虫草多糖、虫草酸、麦角甾醇、胆醇、甘露醇、软脂酸脂、腺嘌呤、次黄嘌呤、胸腺嘧啶、亚油酸、黄酮类物质，激素样成分，维生素，微量元素和游离氨基酸等活性成分。在本发明的一个方面，本发明提供的从北虫草水解提取得到的组合物中含有虫草素，虫草多糖，磷，镁，锌，硒，天门冬氨酸，苏氨酸，丝氨酸，谷氨酸，脯氨酸，甘氨酸，丙氨酸，胱氨酸，缬氨酸，蛋氨酸，异亮氨酸，亮氨酸，酪氨酸，苯丙氨酸，赖氨酸，组氨酸，色氨酸，精氨酸。本发明的方法可以在提取物中除了纳米寡肽外，还有效地保留以上虫草的其它活性物质。其中维生素包括了A、B、C、D、E等各族维生素；微量元素包括了钙、锌、硒等32种；游离氨基酸包括22种，包括天门冬氨酸，苏氨酸，丝氨酸，谷氨酸，脯氨酸，甘氨酸，丙氨酸，胱氨酸，缬氨酸，蛋氨酸，异亮氨酸，亮氨酸，酪氨酸，苯丙氨酸，赖氨酸，组氨酸，色氨酸，精氨酸等。

本发明提供的北虫草提取物中含有独特的虫草纳米寡肽，聚集了冬虫夏草各种功能于一身，是传统与现代高科技结合的产物。本发明提供的北虫草提取物可以广泛应用在食品、保健品、化妆品领域。

本发明提供了如前面所述的从北虫草水解提取得到的含有纳米寡肽的组合物在制备医药、食品、保健品、化妆品中的应用。

在本发明的一个方面，提供了一种化妆品组合物，其含有如前面所述的从北虫草水解提取得到的含有纳米寡肽的组合物。

在本发明的一个方面，提供了一种保健品组合物，其含有如前面所述的从北虫草水解提取得到的含有纳米寡肽的组合物。

在本发明的一个方面，提供了一种食品组合物，其含有如前面所述的从北虫草水解提取得到的含有纳米寡肽的组合物。

在本发明的一个方面，提供了一种药物组合物，其含有如前面所述的从北虫草水解提取得到的含有纳米寡肽的组合物。

本发明提供的医药、食品、保健品、化妆品组合物的剂型包括为液体或粉末，即口服液、胶囊、片剂、丸等。

本发明可用于食品、保健品、药品、化妆品的添加剂并可以进行工业化生产。

本发明利用复合生物酶酶解技术，将北虫草蛋白水解成纳米寡肽，分子量主要分布在100-1000D之间，多为二肽、三肽、四肽等寡肽，从而获得北虫草寡肽提取物。本发明提供的北虫草寡肽提取物不仅能提供人体生长发育所需要的营养物质，而且具有独特的生物学功能。可防治高血压、高血脂、高血糖、血栓、动脉硬化、心脏病、抗氧化、抗疲劳、抗衰老、抗癌、抗病毒，提高机体免疫力，在适用生物酶对虫草蛋白质进行降解获得寡肽时，还发现某些寡肽具有原食品蛋白质组成氨基酸所没有的重要生理机能。

本发明得到的北虫草寡肽提取物中同时保留了其它活性成分，包括虫草素、蜕皮酮、腺苷、虫草多糖、虫草酸、麦角甾醇、胆醇、甘露醇、软脂酸脂、腺嘌呤、次黄嘌呤、胸腺嘧啶、亚油酸、黄酮类物质，激素样成分（不是激素），以及钙、锌、硒等32种微量元素，A、B、C、D、E、等各族维生素，以及游离氨基酸22种，包括天门冬氨酸，苏氨酸，丝氨酸，谷氨酸，脯氨酸，甘氨酸，丙氨酸，胱氨酸，缬氨酸，蛋氨酸，异亮氨酸，亮氨酸，酪氨酸，苯丙氨酸，赖氨酸，组氨酸，色氨酸，精氨酸等。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但不应以此限制本发明的保护范围。

实施例

1. 北虫草子实体粉末的制备 

将北虫草子实体置于低温真空干燥箱中，55℃烘干16h，破碎机粉碎成100目细粉。

2．虫草子实体寡肽的制备和提取

将子实体细粉与去离子水按1:12.5混合，搅拌加热至95℃，保温15min。保温结束后迅速降温50℃，加入子实体干重的1重量%的50万u/g碱性蛋白酶，用10%NaOH溶液调节pH至8.5，50℃保温3h。保温结束后，加入子实体干重的1重量%的15万u/g中性蛋白酶，用10%NaOH溶液调节pH至7.3，50℃保温3h。保温结束后，再加入子实体干重1重量%的5万u/g胃蛋白酶，再用10%HCl溶液调pH至3.6， 50℃保持3h。保温结束后，升温至95℃，保持15min，对酶进行灭活处理。灭活后，用300目以上粗砂布或中速滤纸过滤反应液。然后在滤液中加液重2%的粉末状活性炭，70℃搅拌脱色0.5h，然后用硅藻土过滤机过滤，得澄清微黄色透明的小分子肽液体，60℃真空浓缩至原液体量1/5，进行喷雾干燥或冷冻干燥得到淡黄色粉末。

3. 对虫草提取物寡肽的测量

根据本行业内常用的高效液相分析方法检测小分子肽的分子量分布的JY/T 024-1996, QB/T2879-2007标准对提取物的肽分子量分布做测定，得到其高斯分布结果如下：

4. 对虫草提取物其它营养成分的测量

另外，对提取物蛋白质含量和其它营养成分检测（虫草素、虫草多糖、微量元素、氨基酸等）做分析，检测结果如下：

本发明提供了一种新的虫草提取物，其中利用复合生物酶酶解技术，将北虫草蛋白水解成纳米寡肽，得到的寡肽分子量主要分布在100-1000D之间，多为二肽、三肽、四肽等寡肽，属于小分子结构，具有极易被人体吸收利用的特点。本发明提供的虫草提取物还含有大量的其它有益营养成分，包括虫草素、蜕皮酮、腺苷、虫草多糖、虫草酸、麦角甾醇、胆醇、甘露醇、软脂酸脂、腺嘌呤、次黄嘌呤、胸腺嘧啶、亚油酸、黄酮类物质，微量元素，各族维生素，以及游离氨基酸。本发明不仅能提供人体生长发育所需要的营养物质，而且具有独特的生物学功能。

 除非另外指出，本发明的实践将使用生物技术和有机化学、无机化学等的常规技术，显然除在上述说明和实施例中所特别描述之外，还可以别的方式实现本发明。其它在本发明范围内的技术方案与改进将对本发明所属领域的技术人员是显而易见的。根据本发明的教导，许多改变和变化是可行的，因此都在本发明的范围之内。

Claims (3)

1.一种从北虫草中水解提取得到纳米寡肽的方法，其中采用复合酶法水解北虫草，获得含有小分子纳米寡肽的组合物，其特征在于，所述纳米寡肽的分子量主要分布在100-1000D之间，所述组合物中分子量为100-500D的纳米寡肽的高斯分布峰面积百分比超过50％，

其中所述复合酶法中水解采用的酶是碱性蛋白酶、中性蛋白酶和胃蛋白酶，加入酶的顺序是碱性蛋白酶、中性蛋白酶和胃蛋白酶，

所述方法包括以下步骤：

a)将虫草子实体烘干，粉碎成50-200目细粉；

b)将所述细粉与去离子水按1∶10-1∶50混合；

c)蛋白质变性处理，将混合液升温至90-95℃，保持10-15min；

d)把所述混合液降温至50-60℃，按子实体干重的1重量％-3重量％加入50万u/g碱性蛋白酶，调节pH至8-9，50-60℃保温2-4h；

e)降温至40-50℃，按子实体干重1重量％-3重量％加入15万u/g中性蛋白酶，调节pH至7-7.5，40-50℃保温2-4h；

f)调pH至3.0-4.0，按子实体干重1重量％-3重量％加入5万u/g胃蛋白酶，升温至50-60℃，保持2-4h；

g)升温至95-100℃，保持10-20min，灭酶；

h)粗过滤；

i)加重量2-3重量％的活性炭，70-75℃脱色0.5-1h；

j)用硅藻土过滤机过滤得澄清微黄色小分子肽液体；

k)浓缩，进行喷雾干燥或冷冻干燥得到淡黄色粉末。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述组合物中分子量为100-500D的纳米寡肽的高斯分布峰面积百分比超过70％。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述组合物中纳米寡肽的分子量具有如下的高斯分布：