CN110241159A - 一种酶解蝇蛹制备抗氧化活性多肽的工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种酶解蝇蛹制备抗氧化活性多肽的工艺,通过使用蛋白酶将脱脂蝇蛹蛋白粉酶解,出人意料地获得了具有良好抗氧化活性的多肽。
Description
技术领域
本发明涉及蝇蛹深加工领域,具体涉及一种酶解蝇蛹制备抗氧化活性多肽的工艺。
背景技术
与其他抗氧化剂相比,抗氧化肽不仅具有清除自由基或者抑制生物大分子过氧化的功能,还容易被机体吸收,提供营养,有助于修复氧化损伤。目前,抗氧化肽的来源主要有两个方面,包括天然存在提取分离而得以及酶解制备而得,而酶解法制备抗氧化肽是最为常见的一种方式。
家蝇幼虫,又称五谷虫、蝇蛆,是一种营养成分丰富的中药材。目前已经有多篇文献报道蝇蛆蛋白、蝇蛆酶解多肽均具有抗氧化活性,如赵春江等报道蝇蛆肽对衰老小鼠有抗氧化作用,可升高衰老小鼠血清、肝脏和脑组织中SOD、CAT的活性,降低MDA的含量;朱丽等报道对于H2O2诱导的HepG2细胞的氧化损伤,蝇蛆多肽具有保护作用。但是目前对于家蝇的抗氧化研究主要集中幼虫阶段,对于其他阶段的研究却几乎是空白。
卢红妍等利用碱性蛋白酶酶解松仁清蛋白制备抗氧化肽,并通过超滤、SephadexG-25、Sephadex G-15及反向高效液相色谱进行纯化,得到两条分子量分别为572.67Da和538.65Da的抗氧化肽;李娜等以鳕鱼鱼鳔为原料,对比了6种不同蛋白酶酶解液的抗氧化活性,筛选得到最佳蛋白酶为复合蛋白酶;巫春旭等以DPPH自由基清除率为评价指标,通过单因素和正交试验优化了碱性蛋白酶酶解蝇蛆蛋白制备抗氧化肽的工艺条件。
王土连,张晟,黄绮薇,等.家蝇蝇蛆耐高温抗氧化多肽的筛选及性质分析[J].广东农业科学,2015,42(21):145-149.将家蝇(Musca domestica)蝇蛆进行不同高温的水浴处理,测量蝇蛆抗氧化性的变化.结果显示,50℃处理抗氧化活力变化不显著,80、100℃处理短时间内出现显著下降,但残留的抗氧化活力在随后的高温中保持稳定,提示家蝇蝇蛆存在耐高温抗氧化物质.将蝇蛆提取液在100℃处理不同时间以筛选耐高温抗氧化物质,结果表明,经100℃处理5min筛选到的抗氧化物质在50、80、100℃保温5h,甚至在120℃超高温条件下保温30min,其抗氧化活力均保持稳定.SDS-PAGE电泳结合三氯乙酸沉淀反应结果证明,该物质为分子量约为30ku的多肽。
蝇蛹是蝇幼虫变化到成虫的一种过渡形态,幼虫和蛹的蛋白种类及含含量存在较大差异,而每种蛋白酶都有各自独特的酶切位点,所以家蝇幼虫和蛹的抗氧化肽的酶解制备方案不可简单转用。一般认为蝇蛹蛋白的抗氧化活性较弱,而经过变性处理后的蝇蛹蛋白,原有的抗氧化活性成分基本不再保持其原有活性。现有技术中未见通过酶解蝇蛹制备抗氧化活性多肽的报导。
发明内容
本发明的目的在于提供一种酶解蝇蛹制备抗氧化活性多肽的工艺。
本发明所采取的技术方案是:
一种酶解蝇蛹制备抗氧化活性多肽的工艺,包括如下步骤:
1)将蝇蛹洗净、粉碎、脱脂得到蝇蛹粉;
2)将蝇蛹粉和水混合,之后加热至蛋白变性,得到蝇蛹粉混悬液;
3)将蝇蛹粉混悬液冷却至酶解温度,加入蛋白酶,调节pH至适合酶解,酶解完成后,将酶灭活,固液分离,取上清干燥得到多肽。
在一些实例中,将蝇蛹粉和水混合浸提至少3次,每次至少30min。
在一些实例中,蛋白酶的添加量为6000~8000U/g蝇蛹粉。
在一些实例中,蝇蛹粉和水的质量混合比为:1:(10~30)。
在一些实例中,蛋白酶选自碱性蛋白酶、中性蛋白酶、酸性蛋白酶、菠萝蛋白酶、胰蛋白酶、风味蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、α-糜蛋白酶中的至少一种。酶解的时间为0.5~1h。
在一些实例中,蛋白酶为碱性蛋白酶或风味蛋白酶。酶解的时间为0.5~1h。
一种抗氧化活性多肽,其按上述的工艺制备得到。
一种组合物,所述组合物含有上述的抗氧化活性多肽。
在一些实例中,所述组合物为食品、饲料化妆品添加剂或药用组合物。
本发明的有益效果是:
本发明的方法,可以酶解蝇蛹蛋白得到具有高抗氧化活性的多肽。为深入挖掘家蝇的经济价值,为完全变态昆虫的开发提供一种参考模式。本发明方法酶解得到的多肽,可以作为食品、饲料、化妆品添加剂,或用于制备抗氧化的药用组合物。
附图说明
图1是家蝇各生命阶段的蛋白分布比较;
图2是不同蛋白酶酶解产物的DPPH自由基清除率的比较;
图3是酶解温度对DPPH自由基清除能力的影响;
图4是酶解时间对DPPH自由基清除能力的影响;
图5是加酶量对DPPH自由基清除能力的影响;
图6是酶解物的DPPH自由基清除能力;
图7是酶解物的亚铁离子螯合能力;
图8是家蝇蛹碱性蛋白酶酶解物对SH-SY5Y细胞的预保护作用。
具体实施方式
一种酶解蝇蛹制备抗氧化活性多肽的工艺,包括如下步骤:
1)将蝇蛹洗净、粉碎、脱脂得到蝇蛹粉;
2)将蝇蛹粉和水混合,之后加热至蛋白变性,得到蝇蛹粉混悬液;
3)将蝇蛹粉混悬液冷却至酶解温度,加入蛋白酶,调节pH至适合酶解,酶解完成后,将酶灭活,固液分离,取上清干燥得到多肽。
蛋白变性可以通过加热至一定温度保温实现,特别的,可以通过煮沸
在一些实例中,将蝇蛹粉和水混合浸提至少3次,每次至少30min。
在一些实例中,蛋白酶的添加量为6000~8000U/g蝇蛹粉。这样可以比较高效地进行酶解。
在一些实例中,蝇蛹粉和水的质量混合比为:1:(10~30)。这种浓度下有利于酶解反应的进行。
在一些实例中,蛋白酶选自碱性蛋白酶、中性蛋白酶、酸性蛋白酶、菠萝蛋白酶、胰蛋白酶、风味蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、α-糜蛋白酶中的至少一种。酶解的时间为0.5~1h。
在一些实例中,蛋白酶为碱性蛋白酶或风味蛋白酶。酶解的时间为0.5~1h。这种蛋白酶的酶解产物具有较高的收率,同时具有更好的抗氧化活性。
一种抗氧化活性多肽,其按上述的工艺制备得到。
一种组合物,所述组合物含有上述的抗氧化活性多肽。
在一些实例中,所述组合物为食品、饲料化妆品添加剂或药用组合物。
下面结合实施例,进一步说明本发明的技术方案。
家蝇各生命阶段的蛋白分布比较
收集家蝇卵、幼虫(1龄、2龄、3龄)、蛹和成虫(公、母)的活体样本,洗净研磨成肉酱,用PIPA裂解液提取各样本的总蛋白质,BCA法进行蛋白定量,取一定的蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),得到的胶块进行考马斯亮蓝染色,观察各样本中蛋白质的分布情况。
不同蛋白酶酶解家蝇蛹蛋白产物的抗氧化活性比较
按照下表进行酶解,检测并计算各酶解产物的产率和DPPH自由基清除率。
酶解液的体外抗氧化能力检测方法:
酶解液的DPPH自由基清除能力:
取50μLDPPH溶液加入96孔板,加入50μL双蒸水,混合静置30分钟,于519nm测得A0;
取50μL无水乙醇加入96孔板,加入50μL双蒸水,混合静置30分钟,于519nm测得A1;
取50μL样品加入96孔板,加入50μLDPPH溶液,混合静置30分钟,于519nm测得A2;
取50μL样品加入96孔板,加入50μL无水乙醇,混合静置30分钟,于519nm测得A3。
DPPH自由基清除率按照下式计算:
清除率(%)=[1-(A2-A3)/(A0-A1)]×100%
所有试验数据重复测定三次,取平均值。
酶解液的亚铁离子螯合能力:
于96孔板中分别加入70μL双蒸水、10μL FeCl2溶液、20μL菲洛嗪溶液,室温孵育10min,于562nm测得A0;
于96孔板中分别加入90μL双蒸水、10μL FeCl2溶液,室温孵育10min,于562nm测得A1;
于96孔板中分别加入70μL样品溶液、10μL FeCl2溶液、20μL菲洛嗪溶液,室温孵育10min,于562nm测得A2;
于96孔板中分别加入70μL样品溶液、10μL FeCl2溶液、20μL双蒸水,室温孵育10min,于562nm测得A3。
EDTA-二钠作为阳性对照。
亚铁离子螯合能力按照下式计算:
亚铁离子螯合能力(%)=[1-(A2-A3)/(A0-A1)]×100%
试验重复三次,结果取平均值。
降低H2O2诱导的SH-SY5Y细胞的死亡率
SH-SY5Y是人骨髓神经母细胞瘤细胞株,常作为研究阿尔兹海默症等神经退行性疾病的细胞模型,本发明用高、中、低三种浓度的碱性蛋白酶酶解物作用于SH-SY5Y细胞,预保护24h,移去药物,再用400μM H2O2刺激2h造成氧化损伤(细胞培养的环境:DMEM高糖培养基+10%胎牛血清+1%青霉素/链霉素,37℃,5%CO2),用MTT法检测细胞的存活率。
试验材料与仪器
1、原料:家蝇蛹有广东盈亨生物科技有限公司提供。
2、主要试剂:蛋白酶均购自北京索莱宝生物科技有限公司;DPPH试剂、FeCl2粉末、菲洛嗪购自上海麦克林生化科技有限公司;无水乙醇、EDTA-二钠购自天津大茂化学试剂厂;Bradford蛋白浓度测定试剂盒、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒、考马斯亮蓝R250购自碧云天生物技术公司;DMEM高糖培养基、胎牛血清、青霉素/链霉素、胰酶(含EDTA)购自Gibco(美国)。
3、主要仪器与设备如下:
实验结果:
家蝇各生命阶段的蛋白分布比较
从图1可以看出,家蝇各生命阶段的蛋白质种类及含量差别较大,且总体趋势为蛋白质不断积累的过程。对比家蝇幼虫和蛹,可知两者有明显的区别,蛹的蛋白较幼虫的更为丰富,特别是在75KD及以上的部分,多出数条蛋白条带。蛋白的积累可能与家蝇成虫生活的环境更为复杂有关。家蝇幼虫和成虫的蛋白类型差异极大,提示其活性也可能存在极大的区别。家蝇幼虫的处理工艺和家蝇蛹的处理工艺不通用。
不同酶解物酶解家蝇蛹的产率和抗氧化活性效果对比
不同酶解物酶解家蝇蛹的产率如表1所示:
表1、酶解家蝇蛹的产率表
酶解物的产率高低依次为:胃蛋白酶>碱性蛋白酶>胰蛋白酶>木瓜蛋白酶>α-糜蛋白酶>菠萝蛋白酶>风味蛋白酶>中性蛋白酶>酸性蛋白酶。图2为家蝇蛹的九种蛋白酶的酶解物的DPPH自由基清除率的比较,碱性蛋白酶的活性最强,风味蛋白酶其次。综合产率和活性的比较,碱性蛋白酶为酶解家蝇蛹得到抗氧化肽的最优蛋白酶。
酶解温度对家蝇蛹酶解液DPPH自由基清除能力的影响
在料液比为1:20,pH9.5,加酶量6000U/g,酶解时间30min的条件下,探索酶解温度对家蝇蛹酶解液DPPH自由基清除能力的影响,酶解温度分别设置为45、50、55、60、65℃。
由图3可知,当酶解温度在45-60℃之间时,家蝇蛹酶解液的DPPH自由基清除能力不断增加,而在65℃时,清除率急剧下降到52%,这可能与碱性蛋白酶的活力有关,温度过高会导致没酶活力下降,甚至失活。所以本发明选择60℃为酶解反应的最优温度。
酶解时间对家蝇蛹酶解液DPPH自由基清除能力的影响
在料液比为1:20,pH9.5,加酶量6000U/g,酶解温度55℃的条件下,探索酶解时间对家蝇蛹酶解液DPPH自由基清除能力的影响,酶解时间分别设置为15、30、45、60、75min。
图4表明,随着酶解时间的增加,酶解液的DPPH自由基清除率不断增加,且在30min后几乎保持稳定,略微有下降趋势,说明在30min时酶解液中游离出的抗氧化肽的比例较高,当酶解时间延长,酶解更充分,可能使部分活性肽段水解,所以在60min后清除率有所下降。最终本发明选择的理想酶解时间为30min。
加酶量对家蝇蛹酶解液DPPH自由基清除能力的影响
在料液比为1:20,pH9.5,酶解温度55℃,酶解时间30min的条件下,探索加酶量对家蝇蛹酶解液DPPH自由基清除能力的影响,加酶量分别设置为2000、4000、6000、8000、10000U/g。
图5表明,不同加酶量对家蝇蛹酶解液DPPH自由基清除能力的影响整体呈平缓上升的趋势,当加酶量从2000U/g上升到6000U/g时,清除率逐渐增加,之后再增加加酶量,清除率变化不明显,稍微有下降的趋势,说明在加酶量为6000U/g时,体系已经达到饱和状态,所以本发明选择6000U/g的加酶量为最优条件。
综合来看,在所探索的三个酶解因素中,温度和时间对酶解过程影响较大,加酶量的影响较为缓和。最终优化的试验条件为:酶解温度60℃,酶解时间30min,加酶量6000U/g。
最佳酶解工艺制备得到的家蝇蛹的抗氧化肽的体外抗氧化活性检测
如图6所示,酶解物对DPPH自由基的清除能力具有浓度依赖性,试验测得其清除活性的IC50值为0.383mg/mL,是王丽媛等在“家蝇幼虫酶解物的制备及其抗氧化活性的研究”中报道的活性(IC50为3.78mg/mL)的10倍左右,提示本试验的酶解条件下,家蝇蛹的酶解物比家蝇幼虫的酶解物具有最高的抗氧化活性。
如图7所示,家蝇蛹的酶解物还具有亚铁离子螯合能力,且其活性具有浓度依赖性,试验测得其活性的IC50值为0.567mg/mL说明酶解物具有较好的抗氧化活性。
最佳酶解工艺制备得到的家蝇蛹的抗氧化肽的对SH-SY5Y细胞的预保护作用
实验结果如图8所示,与对照组相比,模型组(只给H2O2)的存活率显著下降,当给予不同浓度(12.5、25、50μg/mL)酶解物和12.5μMVc预保护24h后,存活率显著升高,且这种预保护作用与酶解物的浓度具有依赖性,随酶解物的浓度的升高,保护作用越强。这一结果提示家蝇蛹酶解物具有神经保护作用。
最后应说明的是:以上实施例仅用以说明本发明的技术方案,而非对其限制;尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明,本领域的普通技术人员应当理解,其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分技术特征进行等同替换;而这些修改或者替换,并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
Claims (10)
1.一种酶解蝇蛹制备抗氧化活性多肽的工艺,包括如下步骤:
1)将蝇蛹洗净、粉碎、脱脂得到蝇蛹粉;
2)将蝇蛹粉和水混合,之后加热至蛋白变性,得到蝇蛹粉混悬液;
3)将蝇蛹粉混悬液冷却至酶解温度,加入蛋白酶,调节pH至适合酶解,酶解完成后,将酶灭活,固液分离,取上清干燥得到多肽。
2.根据权利要求1所述的工艺,其特征在于:将蝇蛹粉和水混合浸提至少3次,每次至少30min。
3.根据权利要求1所述的工艺,其特征在于:蛋白酶的添加量为6000~8000U/g蝇蛹粉。
4.根据权利要求1所述的工艺,其特征在于:蝇蛹粉和水的质量混合比为:1:(10~30)。
5.根据权利要求1~4任一项所述的工艺,其特征在于:蛋白酶选自碱性蛋白酶、中性蛋白酶、酸性蛋白酶、菠萝蛋白酶、胰蛋白酶、风味蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、α-糜蛋白酶中的至少一种。
6.根据权利要求1~4任一项所述的工艺,其特征在于:蛋白酶为碱性蛋白酶或风味蛋白酶。
7.根据权利要求1~4任一项所述的工艺,其特征在于:酶解的时间为0.5~1h。
8.一种抗氧化活性多肽,其特征在于:其按权利要求1~7任一项所述的工艺制备得到。
9.一种组合物,其特征在于:所述组合物含有权利要求8所述的抗氧化活性多肽。
10.根据权利要求9所述的组合物,其特征在于:所述组合物为食品、饲料化妆品添加剂或药用组合物。
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Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN110812469A (zh) * | 2019-11-06 | 2020-02-21 | 中山大学 | 多肽ar12在制备抗氧化剂中的应用 |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101392020A (zh) * | 2008-11-06 | 2009-03-25 | 中山大学 | 家蝇蛹天然抗菌肽制品及其制备方法和应用 |
CN102000121A (zh) * | 2010-11-05 | 2011-04-06 | 北京中生奥普寡肽技术研究所 | 北虫草寡肽组合物及其制备方法和使用 |
CN103602712A (zh) * | 2013-10-28 | 2014-02-26 | 南昌大学 | 一种冷榨茶饼制备活性蛋白肽的方法 |
CN108456707A (zh) * | 2018-05-16 | 2018-08-28 | 西南大学 | 一种蚕蛹蛋白抗氧化肽的制备方法及蚕蛹蛋白抗氧化肽的应用 |
-
2019
- 2019-05-08 CN CN201910380672.2A patent/CN110241159A/zh active Pending
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101392020A (zh) * | 2008-11-06 | 2009-03-25 | 中山大学 | 家蝇蛹天然抗菌肽制品及其制备方法和应用 |
CN102000121A (zh) * | 2010-11-05 | 2011-04-06 | 北京中生奥普寡肽技术研究所 | 北虫草寡肽组合物及其制备方法和使用 |
CN103602712A (zh) * | 2013-10-28 | 2014-02-26 | 南昌大学 | 一种冷榨茶饼制备活性蛋白肽的方法 |
CN108456707A (zh) * | 2018-05-16 | 2018-08-28 | 西南大学 | 一种蚕蛹蛋白抗氧化肽的制备方法及蚕蛹蛋白抗氧化肽的应用 |
Non-Patent Citations (6)
Title |
---|
R.J.L.MUNKS ET AL.: "Antioxidant gene expression in the blood-feeding fly Glossina morsitans morsitans", 《INSECT MOLECULAR BIOLOGY》 * |
孙婷婷 等: "家蝇蛹的营养成分分析及抗氧化肽制备工艺研究", 《饲料工业》 * |
巫春旭 等: "蝇蛆抗氧化肤的制备及其纯化", 《农业与技术》 * |
徐萍 等: "虫蛹活性多肽的制备、分离和生物活性研究进展", 《生物技术进展》 * |
段钢 等: "《酶制剂应用技术问答》", 31 May 2014, 中国轻工业出版社 * |
罗永康: "《生物活性肽功能与制备》", 31 March 2019, 中国轻工业出版社 * |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN110812469A (zh) * | 2019-11-06 | 2020-02-21 | 中山大学 | 多肽ar12在制备抗氧化剂中的应用 |
CN110812469B (zh) * | 2019-11-06 | 2021-06-22 | 中山大学 | 多肽ar12在制备抗氧化剂中的应用 |
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