JP2008228727A - ローヤルゼリー分解酵素含有物 - Google Patents
ローヤルゼリー分解酵素含有物 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2008228727A JP2008228727A JP2008024453A JP2008024453A JP2008228727A JP 2008228727 A JP2008228727 A JP 2008228727A JP 2008024453 A JP2008024453 A JP 2008024453A JP 2008024453 A JP2008024453 A JP 2008024453A JP 2008228727 A JP2008228727 A JP 2008228727A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- royal jelly
- enzyme
- degrading enzyme
- fraction
- degradation
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Images
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
Landscapes
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Jellies, Jams, And Syrups (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
【解決手段】西洋ミツバチ (Apis mellifera) の2〜3日齢の女王蜂幼虫から、下記工程を有する方法で調製されたローヤルゼリー分解酵素含有物;(a)前記女王蜂幼虫の体組織懸濁物を6℃以下で遠心処理することにより、白色固形の上層、溶液の中層、沈殿による下層の3層に分離する工程(b)前記中層をローヤルゼリー分解酵素含有物として回収する工程、該ローヤルゼリー分解酵素含有物に含有されることを特徴とするローヤルゼリー分解酵素、該ローヤルゼリー分解酵素含有物又は該ローヤルゼリー分解酵素を用いて調製されたローヤルゼリー分解物、及び、該ローヤルゼリー分解酵素含有物又は該ローヤルゼリー分解酵素を用いることを特徴とするローヤルゼリーの分解方法。
【選択図】なし
Description
また、本発明は、該ローヤルゼリー分解酵素含有物等を用いて調製することを特徴とするローヤルゼリー分解物、並びに、該ローヤルゼリー分解酵素含有物等を用いるローヤルゼリーの分解方法を提供することを目的とする。
(a)前記女王蜂幼虫の体組織懸濁物を6℃以下で遠心処理することにより、白色固形の上層、溶液の中層、沈殿による下層の3層に分離する工程。
(b)前記中層をローヤルゼリー分解酵素含有物として回収する工程。
また、本発明は、前記遠心処理が、8,000〜12,000×g、5分以上の遠心処理であることを特徴とするローヤルゼリー分解酵素含有物を提供するものである。
また、本発明は、西洋ミツバチの2〜3日齢の女王蜂幼虫から、下記工程を有する方法で調製されたローヤルゼリー分解酵素含有物を提供するものである。
(a’)前記女王蜂幼虫を氷冷生理食塩水にて洗浄した後、裏ごしすることにより、乳白色の体組織懸濁物を調製する工程。
(b’)前記体組織懸濁物をpH7.0の50mMリン酸緩衝液を用いて希釈した後、10,000×g、5℃で10分間の遠心処理をすることにより、白色固形の上層、黄白色に濁った溶液の中層、白色からやや褐色の沈殿による下層の3層に分離する工程。
(c’)前記中層をローヤルゼリー分解酵素含有物として回収する工程。
また、本発明は、前記いずれか記載のローヤルゼリー分解酵素含有物を用いて調製されたローヤルゼリー分解物を提供するものである。
また、本発明は、前記いずれか記載のローヤルゼリー分解酵素含有物を用いて、ローヤルゼリーをpH9で4時間以上酵素処理することにより得られる、下記の特徴を有するローヤルゼリー分解物を提供するものである。
(1)神経細胞に対する非特異的な細胞変性作用が、未酵素処理のローヤルゼリー水溶性画分よりも軽減していること、
(2)アミロイドによる神経細胞死誘導に対する抑制作用が、未酵素処理のローヤルゼリー水溶性画分とほぼ同等であること、
(3)グリア細胞に対する細胞増殖作用が、未酵素処理のローヤルゼリー水溶性画分よりも増大していること、
(4)ヒトロタウィルス感染に対する感染阻害作用が、未酵素処理のローヤルゼリー水溶性画分よりも増大していること。
また、本発明は、前記いずれか記載のローヤルゼリー分解酵素含有物を用いて、ローヤルゼリーをpH9で4時間以上酵素処理することにより得られるローヤルゼリー分解物を有効成分とする抗酸化剤を提供するものである。
また、本発明は、前記いずれか記載のローヤルゼリー分解酵素含有物を用いて、ローヤルゼリーをpH9で4時間以上酵素処理することにより得られるローヤルゼリー分解物を有効成分とする細胞増殖剤を提供するものである。
また、本発明は、前記いずれか記載のローヤルゼリー分解酵素含有物を用いて、ローヤルゼリーをpH9で4時間以上酵素処理することにより得られるローヤルゼリー分解物を有効成分とする感染阻害剤を提供するものである。
また、本発明は、前記いずれか記載のローヤルゼリー分解酵素含有物を用いて、ローヤルゼリーをpH9で4時間以上酵素処理することにより得られるローヤルゼリー分解物を有効成分とする神経細胞死誘導抑制剤を提供するものである。
また、本発明は、前記いずれか記載のローヤルゼリー分解酵素含有物を用いることを特徴とするローヤルゼリーの分解方法を提供するものである。
また、本発明は、いずれか記載のローヤルゼリー分解酵素含有物に含有されることを特徴とするローヤルゼリー分解酵素を提供するものである。
また、本発明は、酵素活性の至適pHが7又は9であることを特徴とするローヤルゼリー分解酵素を提供するものである。
また、本発明は、前記いずれか記載のローヤルゼリー分解酵素を用いて調製されたローヤルゼリー分解物を提供するものである。
また、本発明は、前記いずれか記載のローヤルゼリー分解酵素を用いることを特徴とするローヤルゼリーの分解方法を提供するものである。
また、本発明のローヤルゼリー分解酵素含有物等により分解されたローヤルゼリー分解物は、生理活性の高い機能性ペプチド等を豊富に含有するため、ローヤルゼリーの生理活性の調査・研究において、非常に効率の良い試料を提供し得る。さらに、本発明のローヤルゼリー分解物を用いることにより、従来食されているローヤルゼリー含有食品等よりも、機能性と消化吸収性に優れた食品等を提供することができる。
その他、本発明のローヤルゼリー分解方法により、ローヤルゼリーを効率よく分解することができる。
まず、後記実施例1に記載する方法により調製したRJ分解酵素含有物のタンパク質濃度を、BSAを標準物質としてLowry法を用いて測定した後、pH7の50mMリン酸緩衝液を用いて希釈することにより、6mg/mLのRJ分解酵素溶液を調製した。
次に、8mLの緩衝液に、1mLの後記参考例2に記載する方法により調製したRJタンパク質溶液(30mg/mL)と、1mLの該RJ分解酵素溶液(6mg/mL)を添加して混合した酵素反応液を調製した。該酵素反応液を37℃で反応させ、氷冷して反応を停止させた後、SDS−PAGEによって、RJタンパク質の変化を確認した。分離したRJタンパク質は、CBB R−250を用いて染色した。緩衝液は、pH4、5、及び5.5の50mMの酢酸緩衝液、pH6、6.5、7、及び7.5の50mMのリン酸緩衝液、pH8及び9の50mMのTri−HCl緩衝液を、それぞれ用いた。
約15gの3日齢の西洋ミツバチの女王蜂幼虫を、採取した後、氷冷した生理食塩水で洗浄した。その後、ポリエステル製の平均100メッシュの布(「テトロン」、東レ社製)を用いて女王蜂幼虫を裏ごしすることで、幼虫の表皮を破り、体液及び内臓を搾り出した。これにより、乳白色の幼虫懸濁物を調製した。
RJ(中国産)10mLに、pH7.0の50mMリン酸緩衝液20mLを加えて混合して、RJ希釈溶液を調製した。該RJ希釈溶液を、25,000×g、5℃で20分間遠心した後、不溶性成分を除去し、上清を回収した。その後、該上清を、pH7.0の50mMリン酸緩衝液を用いて希釈し、30mg/mLのRJタンパク質溶液を調製した。
1.RJ分解酵素含有物の調製
参考例1に記載する方法により調製した幼虫懸濁物を、pH7の50mMリン酸緩衝液を用いて2倍希釈した後、10,000×g、5℃で10分間遠心した。該遠心処理により、白色固形の上層、黄白色に濁った溶液の中層、白色からやや褐色の沈殿による下層の3層に分離された。該上層は脂質分、該下層は不溶性の体組織等と推定される。該中層を回収した後、さらに10,000×g、5℃で10分間遠心して3層に分離し、中層をRJ分解酵素含有物として回収した。該RJ分解酵素含有物を、除去しきれなかった不溶性の組織片を除去し、かつ滅菌するために、0.2μmのセルロースアセテート系フィルター(DISMIC−25CS、ADVANTEC社製)を用いて濾過した。これにより、黄色透明なRJ分解酵素含有物を得た。
該RJ分解酵素含有物のタンパク質濃度を、BSAを標準物質としてLowry法を用いて測定し、pH7の50mMリン酸緩衝液を用いて、3mg/mLのRJ分解酵素溶液を調製した。
8mLの緩衝液に、1mLの前記参考例2に記載する方法により調製したRJタンパク質溶液(30mg/mL)と、前記実施例1に記載する方法により調製した1mLのRJ分解酵素溶液(6mg/mL)を添加して混合した酵素反応液を調製した。該緩衝液として、pH7の50mMのリン酸緩衝液、若しくは、pH9の50mMのTri−HCl緩衝液を用いた。該酵素反応液を37℃で反応させ、氷冷して反応を停止させた後、SDS−PAGEによって、RJタンパク質を分離した。CBB R−250を用いて染色したゲルを乾燥させた後、蛍光スキャナーTyphoon 9400(アマシャムバイオサイエンス社製)を用いて染色像を得た。
反応時間を60分までとした以外は、全て実施例1のpH9の条件下における反応と同様にして、RJタンパク質を分解し、SDS−PAGEによって、RJタンパク質を分離して、各バンドの強度を定量した。図4の(a)はゲルの染色像を、(b)は約46kDaのバンドの強度比を、それぞれ示したものである。図中のレーンの上の数字は、それぞれの反応時間を、Mは分子量マーカーを表している。また、矢印アが約51kDa、矢印イが約46kDaをそれぞれ示している。
反応時間を24時間までとした以外は、全て実施例1のpH7の条件下における反応と同様にして、RJタンパク質を分解した。その後、氷冷して反応を停止させた酵素反応液を、Superdex 200 HR 10/30(ファルマシア社製)を用いてゲル濾過クロマトグラフィーを行い、該酵素反応溶液中に含有されるタンパク質を分画した。ゲル濾過クロマトグラフィーは、溶離液として0.15Mの塩化ナトリウムを含む50mMのリン酸緩衝液(pH7)を用いて、流速0.5mL/min、5℃の条件で行った。分画されたタンパク質を検出するために、UV検出器を用いて280nmの吸光度を測定した。
反応時間の経過に伴い、約350kDa及び約60kDaのタンパク質が減少する一方、約5kDa、約3kDa、及び数百Daのタンパク質が増加していることが、図5の結果から明らかである。増加している約5kDa等のタンパク質は、約350kDa等のタンパク質の分解物であることが推察される。つまり、本発明のRJ分解酵素含有物により、RJの高分子タンパク質が分解されることが、ゲル濾過クロマトグラフィーによる分画の結果からも確認できた。
参考例2と同様にしてRJタンパク質溶液(30mg/mL)を調製した。また、希釈後の濃度を3mg/mLとした以外は全て実施例1と同様にしてRJ分解酵素溶液(3mg/mL)を調製した。
8mLの緩衝液に、1mLの該RJタンパク質溶液(30mg/mL)と、1mLの該RJ分解酵素溶液(3mg/mL)を添加して混合した酵素反応液を調製した。該緩衝液として、pH7の50mMのリン酸緩衝液、若しくは、pH9の50mMのTri−HCl緩衝液を用いた。該酵素反応液を4、20、37、及び50℃で、それぞれ反応させ、氷冷して反応を停止させた。各温度の恒温槽で該酵素反応液を混合した時点を反応開始時点とし、反応時間を4、16、24時間とした。氷冷後の該酵素反応液を、実施例1と同様にRJタンパク質を分離することにより、反応温度の影響を観察した。
これに対し、4℃では、pH7及び9の双方において、約51kDaと約46kDaのタンパク質の分解はほとんど観察されなかった。20℃では、37℃の場合と比較し、分解反応の進行はゆるやかであったものの、約51kDaと約46kDaのタンパク質の分解が観察された。一方、50℃では、37℃よりもさらに分解反応は速やかであり、pH7及び9の双方において、反応開始4時間の時点で大部分のタンパク質が分解されていることが確認された。
本発明のRJ分解酵素含有物を用いて得られたRJ分解物が有する、脳神経細胞への生理活性を調べた。具体的には、初代培養したマウス胎児海馬神経細胞の、アミロイドによる神経細胞死誘導に対するRJ分解物の影響を調べた。なお、マウス胎児海馬神経細胞は、マウス胎児から常法により採取した海馬神経細胞を、グリア細胞を培養した96穴マルチウェルプレートに、4.0×104cells/wellとなるようにまき、37℃、5%CO2雰囲気下で培養した。細胞培養液として、B27サプリメント含有ニューロバーサルメディウム(ギブコ社製)を用いた。実験には、培養後1週間経過後の細胞を用いた。
次に、前記参考例2に記載する方法により調製したRJタンパク質溶液に代えて、該RJ水溶性粗分画溶液を用いたこと、及び、反応時間を4時間としたこと以外は、全て実施例1と同様にして、該RJ水溶性粗分画溶液中に含有されるRJタンパク質を分解し、RJ分解物を得た。
その後、抗Map2抗体を用いた免疫染色やヘキスト33342色素染色により死細胞を識別し、各ディッシュ中のマウス胎児海馬神経細胞の生存数、グリア細胞の生存数をそれぞれ測定した。さらに、顕微鏡観察により、細胞変形が観察されたマウス胎児海馬神経細胞数を測定した。なお、細胞変形とは、神経細胞が、樹状突起を有する細胞体と軸索からなる神経細胞特有の形態から変化することを意味する。該変化には、例えば、突起形成、軸索の萎縮、多軸索化、神経細胞同士の凝集、神経細胞の死滅等がある。
本発明のRJ分解酵素含有物を用いて得られたRJ分解物が有する、ヒトロタウィルス感染に対する感染阻害活性を調べるため、中和活性試験を行った。具体的には、アカゲザルの胎児腎臓由来のMA104細胞の細胞培養液中に、ヒトロタウィルスと共に、RJ若しくはRJ分解物を添加することにより、ヒトロタウィルス感染に対するRJ分解物の影響を観察した。RJとして、実施例4と同様にして調製したRJ水溶性粗分画溶液を用いた。また、RJ分解物として、反応時間を24時間とした以外は全て実施例4と同様にして調製したpH7で分解して得たRJ分解物、又はpH9で分解して得たRJ分解物を、それぞれ用いた。なお、MA104細胞は、37℃、5%CO2雰囲気下で培養した。細胞培養液として、10%FCS(牛胎児血清)及び10%TPB(トリプトースホスフェートブロース)含有Eagle’ MEM培地(日水製薬社製)に、若干量の抗生物質等を添加したものを用いた。
本発明のRJ分解酵素含有物を用いて得られたRJ分解物が有する、細胞増殖活性を調べるため、ラットの小腸由来のIEC−6細胞を用いてWST−1法を行った。具体的には、IEC−6細胞を2.0×105cells/mLとなるようにまいて24時間培養した後、培養液をRJ分解物含有培養液に交換して、さらに24時間培養する。その後、培養液中に、テトラゾリウム塩WST−1(和光純薬工業社製)を添加して2時間培養した後、細胞培養液の450nmの吸光度を測定することにより、フォルマザン産物の産生量を測定した。RJ分解物として、反応時間を24時間とした以外は全て実施例4と同様にして調製したpH7で分解して得たRJ分解物、又はpH9で分解して得たRJ分解物を、それぞれ用いた。なお、IEC−6細胞の培養は常法により行った。
この結果、pH7で分解して得たRJ分解物では、RJ分解物の濃度が1mg/mL以下である場合には、細胞増殖促進傾向が、1mg/mL以上である場合には、細胞増殖抑制傾向が、それぞれ観察された。
本発明のRJ分解酵素含有物を用いて得られたRJ分解物が有する細胞増殖活性をより詳細に解析するために、RJ分解物を脱塩処理した後の細胞増殖活性を調べた。
1.脱塩処理
まず、反応時間を24時間とした以外は全て実施例4と同様にして、本発明のRJ分解酵素含有物を用いて、pH7で酵素処理して得たRJ分解物(以下、RJ分解物(pH7)ということがある。)、及びpH9で酵素処理して得たRJ分解物(以下、RJ分解物(pH9)ということがある。)を、それぞれ調製した。
得られたRJ分解物(pH7)とRJ分解物(pH9)を、それぞれ、Hi Trap Desaltingカラム(GEヘルスケアバイオサイエンス社製)を用いてサイズ分画を行った。吸光度(280nm)及び伝導率を測定して得られた溶出パターンに従って、脱塩したフラクション(以下、フラクションD1)と塩を含むフラクション(以下、フラクションD2)の2つのフラクションを分取した。
図6は、Hi Trap Desaltingカラムを用いたカラムクロマトグラフィーにおいて、吸光度(280nm)及び伝導率を測定した結果得られたチャート図である。実線がRJ分解物(pH9)の吸光度、点線がRJ分解物(pH7)の吸光度、二点鎖線がRJ分解物(pH9)の伝導率、一点鎖線がRJ分解物(pH7)の伝導率を、それぞれ示している。図中、「D1」がフラクションD1として分取した画分であり、「D2」がフラクションD2として分取した画分である。
細胞の培養液として、FCS等の増殖因子を含有しない培養液(対照培養液)にRJ分解物(pH9)のフラクションD1(フラクションD1(pH9))を含有させた培養液又は対照培養液にRJ分解物(pH7)のフラクションD1(フラクションD1(pH7))を含有させた培養液を用いた以外は、実施例7と同様にして、各培養液を用いて培養した場合の細胞増殖量を測定した。ポジティブコントロールとして10%FCS含有培養液を、ネガティブコントロールとして対照培養液を、それぞれ用いた。各培養液を用いて培養した場合の細胞増殖量は、対照培養液を添加した場合に産生されたフォルマザン産物量に対する、各培養液を添加した場合に産生されたフォルマザン産物量の比率で表した。
図7は、各培養液を用いて培養した場合の細胞増殖量を示した図である。図7(a)は、フラクションD1(pH9)を含有させた培養液を用いて培養した場合の結果であり、図7(b)は、フラクションD1(pH7)を含有させた培養液を用いて培養した場合の結果である。図中、「NC」は対照培養液を、「PC」は10%FCS含有培養液を、それぞれ示している。また、各濃度は、各培養液中のフラクションD1由来のタンパク質濃度を示している。
図7(a)の結果に示されるように、培養液中のフラクションD1(pH9)濃度依存的に、細胞増殖量が増大することが分かった。特にフラクションD1(pH9)濃度が50.5μg/mLの培養液を用いて培養した場合には、10%FCS含有培養液を用いた場合とほぼ同程度に細胞増殖が促進されていた。但し、フラクションD1(pH9)濃度が84.2μg/mL以上の培養液の場合には、濃度依存的に細胞増殖量が減少する傾向が観察されたことから、フラクションD1(pH9)による細胞増殖促進効果(細胞増殖活性)には、至適濃度があることが示唆された。
一方で、図7(b)の結果に示されるように、培養液にフラクションD1(pH7)を含有させた場合には、細胞増殖量はほとんど変化せず、フラクションD1(pH7)は細胞増殖に著しい影響を与えることはないことが明らかになった。
すなわち、実施例8の結果からも、本発明のRJ分解酵素含有物を用いて、pH9で酵素処理して得たRJ分解物は細胞増殖活性を有することが明らかである。
本発明のRJ分解酵素含有物を用いて得られたRJ分解物が有する細胞増殖活性をより詳細に解析するために、RJ分解物を粗精製した後の細胞増殖活性を調べた。
1.粗精製
実施例8において調製したRJ分解物(pH9)のフラクションD2(フラクションD2(pH9))及びRJ分解物(pH7)のフラクションD2(フラクションD2(pH7))を、Cosmosil(登録商標)5C18−ARカラム(ナカライテスク社製)を用いて、粗精製を行った。吸着バッファーとして、0.05%TFA(トリフルオロ酢酸)溶液を、溶出バッファーとして、0.05%TFA含有90%アセトニトリル溶液を、それぞれ用いた。吸光度(215nm及び280nm)及び伝導率を測定して得られた溶出パターンに従って、非吸着フラクション(以下、フラクションC1)と吸着フラクション(以下、フラクションC2)の2つのフラクションを分取した。
図8は、Cosmosil(登録商標)5C18−ARカラムを用いたカラムクロマトグラフィーにおいて、吸光度(215nm)及び伝導率を測定した結果得られたチャート図である。実線がフラクションD2(pH9)の吸光度、点線がフラクションD2(pH7)の吸光度、二点鎖線がフラクションD2(pH9)の伝導率、一点鎖線がフラクションD2(pH7)の伝導率を、それぞれ示している。図中、「C1(pH7)」がフラクションC1(pH7)として、「C1(pH9)」がフラクションC1(pH9)として、「C2(pH7)」がフラクションC2(pH7)として、「C2(pH9)」がフラクションC2(pH9)として、それぞれ分取した画分である。
細胞の培養液として、フラクションD2(pH9)のフラクションC1(フラクションC1(pH9))を希釈した培養液又はフラクションD2(pH7)のフラクションC1(フラクションC1(pH7))を希釈した培養液を用いた以外は、実施例7と同様にして、各培養液を用いて培養した場合の細胞増殖量を測定した。なお、フラクションC1(pH9)又はフラクションC1(pH7)の希釈には、対照培養液を用いた。
図9は、各培養液を用いて培養した場合の細胞増殖量を示した図である。図9(a)は、フラクションC1(pH9)を含有させた培養液を用いて培養した場合の結果であり、図9(b)は、フラクションC1(pH7)を含有させた培養液を用いて培養した場合の結果である。図中、「NC」は対照培養液を、「PC」は10%FCS含有培養液を、それぞれ示している。
図9(a)と(b)の結果に示されるように、フラクションC1(pH9)とフラクションC1(pH7)のいずれを含有させた培養液においても、細胞増殖が促進されていた。両者を比較すると、フラクションC1(pH7)を含有させた場合よりも、フラクションC1(pH9)を含有させた場合のほうが、細胞増殖促進効果が高い傾向が観察された。
細胞の培養液として、対照培養液にフラクションD2(pH9)のフラクションC2(フラクションC2(pH9))を含有させた培養液又は対照培養液にフラクションD2(pH7)のフラクションC2(フラクションC2(pH7))を含有させた培養液を用いた以外は、実施例7と同様にして、各培養液を用いて培養した場合の細胞増殖量を測定した。
図10は、各培養液を用いて培養した場合の細胞増殖量を示した図である。図10(a)は、フラクションC2(pH9)を含有させた培養液を用いて培養した場合の結果であり、図10(b)は、フラクションC2(pH7)を含有させた培養液を用いて培養した場合の結果である。図中、「NC」は対照培養液を示している。また、各濃度は、各培養液中のフラクションC2由来のタンパク質濃度を示している。
この結果、培養液にフラクションC2(pH9)を含有させた場合には、培養液中の濃度が3.42μg/mL以下では、濃度依存的に細胞増殖量が増大し、3.42μg/mL超では、濃度依存的に細胞増殖量が減少する傾向が観察された。一方、培養液にフラクションC2(pH7)を含有させた場合には、培養液中の濃度が4.67μg/mL以下では、濃度依存的に細胞増殖量が増大し、4.67μg/mL超では、濃度依存的に細胞増殖量が減少する傾向が観察された。また、両者を比較すると、フラクションC2(pH7)を含有させた場合よりも、フラクションC2(pH9)を含有させた場合のほうが、細胞増殖促進効果が高い傾向が観察された。
本発明のRJ分解酵素含有物を用いて得られたRJ分解物が有する抗酸化活性を調べた。
1.RJ分解物の調製
RJ(中国産)に純水を加えて懸濁したものを、孔径10kDの透析膜を用いて、純水にて72時間透析した。透析膜内液を回収し、凍結乾燥した後、再び純水に懸濁し、30mg/mLのRJタンパク質溶液を調製した。
1mLの該RJタンパク質溶液に、1mLのRJ分解酵素含有物(3mg/mL)、8mLのトリス−塩酸バッファー(pH9.0)を加え、37℃で24時間インキュベートした。その後、孔径500Daの透析膜を用いて、純水にて5日間透析した。透析膜内液を回収し、凍結乾燥したものを、RJ分解物とした。なお、RJ分解酵素含有物は、実施例1と同様にして調製したものを用いた。
RJ分解物の抗酸化活性は、柳内ら(日本食品科学工学会誌、第51巻第5号、第238〜246ページ、2004年)の方法に従い、一酸化塩素(ClO・)によるBSA分解に対するRJ分解物の影響を調べることにより測定した。
具体的には、まず、BSA含有PBS(リン酸緩衝生理食塩水)に、PBSを用いて希釈したRJ分解物を添加することにより、BSA(最終濃度40μg/mL)及びRJ分解物(最終濃度0、0.3、0.5、1.0、又は2.0μg/mL)を含有するPBS試料溶液を調製した。該PBS試料溶液に、最終濃度1.7mMとなるように次亜塩素酸ナトリウムを加え、37℃で30分間インキュベートした。その後、SDS−PAGEによって、PBS試料溶液中のタンパク質を分離し、CBB染色することにより検出した。CBB染色像をスキャナーで取り込んだ後、BSAに相当するバンドの濃度を解析した。各PBS試料溶液のBSA濃度は、次亜塩素酸ナトリウムを添加しなかったPBS試料溶液をブランクとし、ブランクのBSA濃度を1とした場合の相対濃度を調べた。なお、バンドの濃度解析は、アメリカ国立衛生研究所(National Institutes of Health)が提供する解析ソフトImageJを用いて行った。また、RJ分解物に代えて、公知の抗酸化剤であるアスコルビン酸(最終濃度0、3.0、4.0、5.0、又は7.5mM)又はカルノシン(最終濃度0、2.5、5.0、7.5、又は10.0mM)を添加したPBS試料溶液についても、同様にBSA濃度を調べた。
図11は、各PBS試料溶液のBSA濃度の結果を示した図である。図11(a)はRJ分解物を添加した場合の結果であり、図11(b)はアスコルビン酸を添加した場合の結果であり、図11(c)はカルノシンを添加した場合の結果である。この結果、RJ分解物を添加しなかった場合には、BSAはCBB染色によりバンドが検出されず、ほぼ全てのBSAが、分解されていた。これに対して、RJ分解物を添加した場合には、アスコルビン酸やカルノシンと同様に、PBS試料溶液への添加量依存的にBSAの相対濃度は大きくなった。これは、次亜塩素酸ナトリウムから産生された一酸化塩素によるBSAの分解が、RJ分解物により抑制されたためであると推察される。
また、図11の結果を元に、一酸化塩素によるBSA分解を50%まで抑制する濃度を算出したところ、RJ分解物では0.92±0.24mg/mLであり、アスコルビン酸では0.67±0.01mg/mL(3.83±0.08mM)であり、カルノシンでは0.84±0.10mg/mL(3.65±0.32mM)であった。すなわち、一酸化塩素によるBSA分解に対する抗酸化力において、RJ分解物は混合物であるにもかかわらず、公知の抗酸化剤であるアスコルビン酸やカルノシンに匹敵する抗酸化力を有していることが認められた。
これら実施例10の結果から、本発明のRJ分解酵素含有物を用いて、pH9で酵素処理して得たRJ分解物は抗酸化活性を有することが明らかである。
Claims (14)
- 西洋ミツバチ (Apis mellifera) の2〜3日齢の女王蜂幼虫から、下記工程を有する方法で調製されたローヤルゼリー分解酵素含有物。
(a)前記女王蜂幼虫の体組織懸濁物を6℃以下で遠心処理することにより、白色固形の上層、溶液の中層、沈殿による下層の3層に分離する工程。
(b)前記中層をローヤルゼリー分解酵素含有物として回収する工程。 - 前記遠心処理が、8,000〜12,000×g、5分以上の遠心処理であることを特徴とする請求項1記載のローヤルゼリー分解酵素含有物。
- 西洋ミツバチの2〜3日齢の女王蜂幼虫から、下記工程を有する方法で調製されたローヤルゼリー分解酵素含有物。
(a’)前記女王蜂幼虫を氷冷生理食塩水にて洗浄した後、裏ごしすることにより、乳白色の体組織懸濁物を調製する工程。
(b’)前記体組織懸濁物をpH7.0の50mMリン酸緩衝液を用いて希釈した後、10,000×g、5℃で10分間の遠心処理をすることにより、白色固形の上層、黄白色に濁った溶液の中層、白色からやや褐色の沈殿による下層の3層に分離する工程。
(c’)前記中層をローヤルゼリー分解酵素含有物として回収する工程。 - 請求項1〜3のいずれか記載のローヤルゼリー分解酵素含有物を用いて調製されたローヤルゼリー分解物。
- 請求項1〜3のいずれか記載のローヤルゼリー分解酵素含有物を用いて、ローヤルゼリーをpH9で4時間以上酵素処理することにより得られる、下記の特徴を有するローヤルゼリー分解物。
(1)神経細胞に対する非特異的な細胞変性作用が、未酵素処理のローヤルゼリー水溶性画分よりも軽減していること、
(2)アミロイドによる神経細胞死誘導に対する抑制作用が、未酵素処理のローヤルゼリー水溶性画分とほぼ同等であること、
(3)グリア細胞に対する細胞増殖作用が、未酵素処理のローヤルゼリー水溶性画分よりも増大していること、
(4)ヒトロタウィルス感染に対する感染阻害作用が、未酵素処理のローヤルゼリー水溶性画分よりも増大していること。 - 請求項1〜3のいずれか記載のローヤルゼリー分解酵素含有物を用いて、ローヤルゼリーをpH9で4時間以上酵素処理することにより得られるローヤルゼリー分解物を有効成分とする抗酸化剤。
- 請求項1〜3のいずれか記載のローヤルゼリー分解酵素含有物を用いて、ローヤルゼリーをpH9で4時間以上酵素処理することにより得られるローヤルゼリー分解物を有効成分とする細胞増殖剤。
- 請求項1〜3のいずれか記載のローヤルゼリー分解酵素含有物を用いて、ローヤルゼリーをpH9で4時間以上酵素処理することにより得られるローヤルゼリー分解物を有効成分とする感染阻害剤。
- 請求項1〜3のいずれか記載のローヤルゼリー分解酵素含有物を用いて、ローヤルゼリーをpH9で4時間以上酵素処理することにより得られるローヤルゼリー分解物を有効成分とする神経細胞死誘導抑制剤。
- 請求項1〜3のいずれか記載のローヤルゼリー分解酵素含有物を用いることを特徴とするローヤルゼリーの分解方法。
- 請求項1〜3のいずれか記載のローヤルゼリー分解酵素含有物に含有されることを特徴とするローヤルゼリー分解酵素。
- 酵素活性の至適pHが7又は9であることを特徴とする請求項11記載のローヤルゼリー分解酵素。
- 請求項11又は12記載のローヤルゼリー分解酵素を用いて調製されたローヤルゼリー分解物。
- 請求項11又は12記載のローヤルゼリー分解酵素を用いることを特徴とするローヤルゼリーの分解方法。
Priority Applications (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2008024453A JP5154964B2 (ja) | 2007-02-23 | 2008-02-04 | ローヤルゼリー分解酵素含有物 |
CN2013103290177A CN103463133A (zh) | 2007-02-23 | 2008-02-22 | 蜂王浆分解酶含有物 |
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2007043138 | 2007-02-23 | ||
JP2007043138 | 2007-02-23 | ||
JP2008024453A JP5154964B2 (ja) | 2007-02-23 | 2008-02-04 | ローヤルゼリー分解酵素含有物 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2008228727A true JP2008228727A (ja) | 2008-10-02 |
JP5154964B2 JP5154964B2 (ja) | 2013-02-27 |
Family
ID=39902293
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2008024453A Expired - Fee Related JP5154964B2 (ja) | 2007-02-23 | 2008-02-04 | ローヤルゼリー分解酵素含有物 |
Country Status (2)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP5154964B2 (ja) |
CN (2) | CN103463133A (ja) |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2011097932A (ja) * | 2009-10-08 | 2011-05-19 | Morikawa Kenkodo Kk | 加工ハチの子の製造方法 |
JP2012092046A (ja) * | 2010-10-27 | 2012-05-17 | Akitaya Honten:Kk | 上皮細胞の増殖促進方法、及び上皮細胞の増殖促進剤 |
JP2013082701A (ja) * | 2011-09-30 | 2013-05-09 | Yamada Bee Farm Corp | 養蜂産品を含むグネツム組成物 |
JP6117453B1 (ja) * | 2015-10-16 | 2017-04-19 | 国立大学法人東北大学 | ローヤルゼリー分画の製造方法 |
Families Citing this family (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101623061B (zh) * | 2009-05-22 | 2012-06-20 | 史杰山 | 一种利用鲜蜂皇胎和蜂粮制备保健营养液的方法 |
CN102260660B (zh) * | 2011-07-05 | 2012-09-26 | 北京师范大学 | 蜂王肠道酶及其制备方法和用途 |
CN102260728B (zh) * | 2011-07-05 | 2014-08-06 | 北京师范大学 | 一种蜂王浆多肽及其用途 |
CN107205459A (zh) | 2015-01-22 | 2017-09-26 | 株式会社山田养蜂场本社 | 组合物 |
CN106511492B (zh) * | 2016-12-27 | 2019-12-20 | 南昌大学 | 一种瓜子金提取物的制备及其促海马神经发生的应用 |
CN110951811B (zh) * | 2019-12-30 | 2021-08-31 | 云南天卉蜂业科技有限公司 | 一种糖基化蜂王浆抗氧化肽及其制备方法 |
-
2008
- 2008-02-04 JP JP2008024453A patent/JP5154964B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2008-02-22 CN CN2013103290177A patent/CN103463133A/zh active Pending
- 2008-02-22 CN CNA200810007986XA patent/CN101250508A/zh active Pending
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
JPN6012049147; Nature Vol.443, 2006, p.931-949 * |
JPN6012049152; Comp. Biochem. Physiol. Vol.38B, 1971, p.197-210 * |
JPN6012049155; Insect Biochem. Vol.7, 1977, p.463-467 * |
JPN6012049158; Insect Biochem. Vol.8, 1978, p.203-211 * |
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2011097932A (ja) * | 2009-10-08 | 2011-05-19 | Morikawa Kenkodo Kk | 加工ハチの子の製造方法 |
JP2012092046A (ja) * | 2010-10-27 | 2012-05-17 | Akitaya Honten:Kk | 上皮細胞の増殖促進方法、及び上皮細胞の増殖促進剤 |
JP2013082701A (ja) * | 2011-09-30 | 2013-05-09 | Yamada Bee Farm Corp | 養蜂産品を含むグネツム組成物 |
JP6117453B1 (ja) * | 2015-10-16 | 2017-04-19 | 国立大学法人東北大学 | ローヤルゼリー分画の製造方法 |
WO2017065314A1 (ja) * | 2015-10-16 | 2017-04-20 | 国立大学法人東北大学 | ローヤルゼリー分画の製造方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN103463133A (zh) | 2013-12-25 |
CN101250508A (zh) | 2008-08-27 |
JP5154964B2 (ja) | 2013-02-27 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP5154964B2 (ja) | ローヤルゼリー分解酵素含有物 | |
JP6828054B2 (ja) | ウォールナットオリゴペプチド粉、その調製方法と使用 | |
US9394513B2 (en) | Method for fermentation and cultivation, fermented plant extract, fermented plant extract powder, and composition containing the extract of fermented plant | |
CN111670997B (zh) | 增强免疫复合蛋白肽酶解液的制备方法、增强免疫复合蛋白肽饮品及其制备方法 | |
TWI516280B (zh) | 紅藜萃取物用於製備促進膠原蛋白生成及抗皮膚老化之組合物之用途 | |
KR101467903B1 (ko) | 흑미의 담자균류균사 발효 및 생물전환공정을 통해 생산된 면역증강제 | |
CN109069546B (zh) | 可食用燕窝提取物和提取方法 | |
KR101207899B1 (ko) | 굴을 이용한 다량의 타우린 및 gaba을 함유하는 기능성 발효소재 및 그의 제조방법 | |
CN109777849B (zh) | 一种脱苦桃仁提取蛋白酶解多肽的制备方法 | |
JP2007306898A (ja) | 冬虫夏草を用いた機能性食品とその製造方法 | |
JP2008056645A (ja) | 酵素処理されたローヤルゼリー中の蛋白質とポリペプチドとの反応により得られた抗酸化ペプチドおよびその製造方法 | |
JP4917584B2 (ja) | 可溶化蜂の子処理物、その製造方法、抗酸化剤、ace阻害剤、血圧降下剤、皮膚繊維芽細胞増殖促進剤、疲労回復剤、血流改善剤、並びに可溶化蜂の子処理物を含有する医薬品、化粧品又は飲食品 | |
KR101904702B1 (ko) | 면역 증강용 기능성 건강식품 조성물 및 이의 제조방법 | |
CN110547384B (zh) | 一种小黄鱼骨胶原抗菌肽及其应用 | |
JP2003327540A (ja) | ヒアルロニダーゼ阻害、抗アレルギー活性および免疫賦活物質 | |
JP2013039087A (ja) | プロテオグリカンを含有してなる飲料水及びその製造方法 | |
KR20200079215A (ko) | 누에콜라겐 건강식품 조성물과 이의 제조방법 | |
García et al. | Novel applications of protein by-products in biomedicine | |
JP2007297324A (ja) | ペプチド及びその製造方法、並びにアンジオテンシン変換酵素阻害剤 | |
KR20120079977A (ko) | 바지락 가수분해물을 유효성분으로 함유하는 항암제 조성물 | |
JP2011036241A (ja) | アンジオテンシン変換酵素阻害ペプチドの製造方法 | |
KR100974080B1 (ko) | 열처리를 이용한 태반 추출물의 제조 방법 | |
JP2011241192A (ja) | 甲殻類の疾病防除剤およびこれを含有する飼料 | |
CN112048534B (zh) | 一种具有提高白藜芦醇功效活性的马鲛鱼蛋白水解物及其制备方法 | |
CN110106221B (zh) | 海参寡肽及其制备方法与应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A711 | Notification of change in applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A711 Effective date: 20080828 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20080828 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20081028 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20101222 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20120925 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20121026 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20121113 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20121206 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20151214 Year of fee payment: 3 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 5154964 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |