CN110812469A - 多肽ar12在制备抗氧化剂中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了多肽AR12在制备抗氧化剂中的应用。发明通过实验发现多肽AR12可以有效地清除各种自由基以及螯合金属离子,具有较强的抗氧化活性和细胞内抗氧化损伤的作用,有望应用于各种对安全性有更高要求的药品、食品、护肤品中,提高对应产品的抗氧化能力;或单独作为抗氧化剂,用于各种生物实验中。多肽AR12也可用于食品保鲜;或作为膳食补充剂用于清除体内多余的自由基、预防或延缓衰老;或作为药品或辅助用药用于治疗与氧化损伤有关的神经退行性疾病、炎症或肿瘤等疾病。
Description
技术领域
本发明涉及多肽的新应用。
背景技术
在生物体内,存在一种氧化还原平衡,当机体发生衰老、疾病时,这种氧化还原平衡会遭到破坏,偏移向氧化方向,积累过量的各种自由基、氧化物,如活性氧自由基(ROS)和活性氮自由基(RNS)等。这些氧化物质极易与DNA、蛋白质、磷脂等结合,造成细胞内各细胞器的氧化损伤,进而加速疾病的进程。已有研究表明,神经退行性疾病、炎症或肿瘤等疾病的进展均与细胞的氧化损伤有关。因此,在防治疾病的过程中,抗氧化剂的使用十分重要。而人工合成的抗氧化剂,如叔丁基对羟基茴香醚、二丁基羟基甲苯等,均有报道表明其具有潜在的急性毒性和发育毒性,所以对天然来源的抗氧化剂的研究得以重视。近二十年来,不断有抗氧化肽从动植物中发现,抗氧化肽具有低毒高效、容易被吸收的特点,发展前景十分广阔。
多肽ARFEELCSDLFR(AR12)是一条由12个氨基酸组成的多肽链,分子量为1485.66Da。2005年Chih-Wen Shu等首次从人非小细胞肺癌H460细胞中的HSP70-1/2蛋白的胰蛋白酶酶解物中鉴定到多肽AR12;2007年Kuhla Bjorn等从德国荷斯坦奶牛下丘脑组织的胰蛋白酶酶解物中也鉴定到了多肽AR12,来源于热休克蛋白Heat-shock 70-kD protein1B;在2012年时,Liz M.B.Teles从创伤病人的嗜中性粒细胞蛋白中再次鉴定到了多肽AR12,来源同样是热休克蛋白HSPA1A。多篇文献报道证明多肽AR12是热休克蛋白的一个组成部分,但该多肽的功能尚未见报道。
目前主要通过酶解法和发酵法来制备抗氧化肽,巫春旭等用碱性蛋白酶水解蝇蛆蛋白,获得了具有DPPH清除活性的抗氧化肽;刘彬等得到了具有清除氧自由基作用的家蝇幼虫提取物;王土连等对蝇蛆耐高温抗氧化多肽进行了性质分析,发现经过100℃处理5min筛选到的抗氧化物质在50、80、100℃保温5h,甚至在120℃超高温条件下保温30min,抗氧化活性均保持稳定。然而,这种酶解产物的抗氧化能力来源不清楚,同样的酶解条件下,得到的产物也因为原料的不可避免的差异而存在较大的波动。
家蝇(Musca Domestica L.)是一种营养成分丰富的资源型昆虫。家蝇的幼虫及蛹壳又称为五谷虫,在中医应用于治疗消化系统疾病已有一千多年的历史。现在主要用于医学清创、作为营养添加剂用于饲料养殖。家蝇的幼虫和蛹含有丰富的营养成分,蛋白质含量高达60%(干重),脂质含量在20%(干重)以上,且研究表明,蝇蛆蛋白和蝇蛆油脂具有多种生物学功效,如赵春江等报道蝇蛆肽对衰老小鼠具有治疗作用,可显著升高衰老小鼠血清、肝脏和脑组织中的SOD、CAT等的活性,并降低MDA的含量;朱丽等报道蝇蛆多肽可保护双氧水诱导损伤的HepG2细胞。
发明人在家蝇蛹蛋白的特定碱性蛋白酶酶解产物中检测到有多肽AR12。
发明内容
本发明的目的在于提供多肽AR12的新应用。
本发明所采取的技术方案是:
本发明的第一个方面,提供:
多肽AR12在制备抗氧化剂中的应用,所述多肽AR12的氨基酸序列为ARFEELCSDLFR(SEQ ID NO.:1)。
在一些应用的实例中,所述抗氧化剂为口服制剂、外用制剂中的一种。
在一些应用的实例中,所述抗氧化剂为用于溶液体系的抗氧化剂。
在一些应用的实例中,所述抗氧化剂用于清除DPPH自由基、ABTS自由基、羟基自由基和/或螯合金属离子。
在一些应用的实例中,所述抗氧化剂用于保护细胞免受氧化损伤。
在一些应用的实例中,所述抗氧化剂用于:
食品保鲜;
清除体内多余的自由基、预防或延缓衰老;
治疗或辅助治疗因细胞氧化损伤导致的神经退行性疾病、炎症或肿瘤。
本发明的第二个方面,提供:多肽AR12在制备抗氧化添加剂中的应用,所述多肽AR12的氨基酸序列为ARFEELCSDLFR。
在一些应用的实例中,所述添加剂用于药品、食品或护肤品。
在一些应用的实例中,所述添加剂用于:
食品保鲜;
清除体内多余的自由基、预防或延缓衰老;
治疗或辅助治疗因细胞氧化损伤导致的神经退行性疾病、心脑血管疾病、肿瘤或炎症。
本发明的第三个方面,提供:
多肽AR12作为抗氧化能力检测标志物中的应用,所述多肽AR12的氨基酸序列为ARFEELCSDLFR。
本发明的第四个方面,提供:
一种检测产物抗氧化能力的方法,包括定量所述产物中多肽AR12的含量,所述多肽AR12的氨基酸序列为ARFEELCSDLFR。
本发明的有益效果是:
本发明通过实验发现,多肽AR12可以有效地清除各种自由基以及螯合金属离子,具有较强的抗氧化活性和细胞内抗氧化损伤的作用,有望应用于各种对安全性有更高要求的药品、食品、护肤品中,提高对应产品的抗氧化能力;或单独作为抗氧化剂,用于各种生物实验中。多肽AR12也可用于食品保鲜;或作为膳食补充剂用于清除体内多余的自由基、预防或延缓衰老;或作为药品或辅助用药用于治疗与氧化损伤有关的神经退行性疾病、炎症或肿瘤等疾病。
附图说明
图1是AR12在溶液中的抗氧化活性;
图2是AR12对PC12细胞存活率的影响;
图3是AR12对双氧水刺激的PC12细胞的凋亡率的影响;
图4是AR12对双氧水刺激的PC12细胞内ROS的影响;
图5是AR12对双氧水刺激的PC12细胞线粒体膜电位的影响;
图6是AR12对双氧水刺激的PC12细胞内MDA和SOD活性的影响;
图7是AR12对SHSY5Y细胞和HepG2细胞存活率的影响。
具体实施方式
本发明的第一个方面,提供:
多肽AR12在制备抗氧化剂中的应用,所述多肽AR12的氨基酸序列为ARFEELCSDLFR。
在一些应用的实例中,所述抗氧化剂为口服制剂、外用制剂中的一种。口服制剂和外用制剂中,还可以添加各种接受的辅助。
在一些应用的实例中,所述抗氧化剂为用于溶液体系的抗氧化剂。溶液体系既可以是体外的溶液体系,如实验用溶液体系。也可以是体内的溶液体系。
在一些应用的实例中,所述抗氧化剂用于清除DPPH自由基、ABTS自由基、羟基自由基和/或螯合金属离子。
在一些应用的实例中,所述抗氧化剂用于保护细胞免受氧化损伤,特别是各种自由基造成的氧化损伤。
在一些应用的实例中,所述抗氧化剂用于:
食品保鲜;
清除体内多余的自由基、预防或延缓衰老;
治疗或辅助治疗因细胞氧化损伤导致的神经退行性疾病、心脑血管疾病、肿瘤或炎症。
本发明的第二个方面,提供:多肽AR12在制备抗氧化添加剂中的应用,所述多肽AR12的氨基酸序列为ARFEELCSDLFR。
在一些应用的实例中,所述添加剂用于药品、食品或护肤品。
在一些应用的实例中,所述添加剂用于:
食品保鲜;
清除体内多余的自由基、预防或延缓衰老;
治疗或辅助治疗因细胞氧化损伤导致的神经退行性疾病、心脑血管疾病、肿瘤或炎症。
本发明的第三个方面,提供:
多肽AR12作为抗氧化能力检测标志物中的应用,所述多肽AR12的氨基酸序列为ARFEELCSDLFR。
本发明的第四个方面,提供:
一种检测产物抗氧化能力的方法,包括定量所述产物中多肽AR12的含量,所述多肽AR12的氨基酸序列为ARFEELCSDLFR。
下面结合实验,进一步说明本发明的技术方案。
以下实验中,多肽AR12的纯度为98%。
实验材料与仪器
1.原料:家蝇蛹由广东盈亨生物科技有限公司提供。
2.主要试剂:DPPH试剂、MTT以及DMSO购自上海麦克林生化科技有限公司;水杨酸、硫酸亚铁、乙醇等分析纯试剂均购自天津大茂试剂厂;RPMI 1640培养基、胎牛血清、青霉素/链霉素、胰酶均购自Gibco;AnnexinⅤ-FITC/PI染料购自美国BD公司;ABTS法检测试剂盒、FRAP法检测试剂盒、活性氧检测试剂盒、线粒体膜电位检测试剂盒、MDA检测试剂盒以及SOD检测试剂盒均购自碧云天生物科技有限公司。
3.主要仪器与设备如下:
实验方法:
DPPH自由基清除能力
1)取50μL DPPH溶液加入96孔板,加入50μL双蒸水,混合静置30分钟,于519nm测得A0;
2)取50μL无水乙醇加入96孔板,加入50μL双蒸水,混合静置30分钟,于519nm测得A1;
3)取50μL样品加入96孔板,加入50μL DPPH溶液,混合静置30分钟,于519nm测得A2;
4)取50μL样品加入96孔板,加入50μL无水乙醇,混合静置30分钟,于519nm测得A3。
DPPH自由基清除率按照下式计算:
清除率(%)=[1-(A2-A3)/(A0-A1)]×100%
所有试验数据重复测定三次,取平均值。
ABTS自由基清除能力
根据试剂盒的方法,在96孔板中加入200μL ABTS工作液和10μL待测溶液,混匀后室温孵育5min,于740nm处检测吸光度。维生素C和谷胱甘肽作为阳性对照。ABTS自由基清除率按照下式计算:
清除率(%)=(1-A1/A0)×100
式中:A0是空白组,以蒸馏水代替待测溶液;A1是试验组,即加入待测溶液。
羟基自由基清除能力
采用水杨酸-硫酸亚铁反应体系,将8μL 18mM水杨酸、52μL样品溶液、8μL 18mMFeSO4溶液混匀,加入32μL 0.1%H2O2启动反应,静置30min,于510nm处检测吸光度。维生素C作为阳性对照。羟基自由基清除率按照下式计算:
清除率(%)=[1-(A2-A1)/A0]×100
式中:A0是空白组,以蒸馏水代替待测溶液;A1是对照组,以蒸馏水代替FeSO4溶液;A2是试验组,即加入待测溶液。
FRAP法测试还原能力
标准曲线测定:配制系列浓度(0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mM)的标准物质FeSO4·7H2O,96孔板的每个检测孔中加入180μL FRAP工作液、5μL待测溶液,37℃孵育3-5min,于539nm测定吸光值,绘制浓度-吸光度曲线。根据标准曲线计算样品的还原能力,表示为N mM样品的还原能力为X mM FeSO4·7H2O。维生素C和谷胱甘肽作为阳性对照。
亚铁离子螯合能力
亚铁离子能与菲洛嗪络合形成紫色络合物,在562nm处有特征吸收,本实验采用亚铁离子-菲洛嗪体系检测抗氧化肽的亚铁螯合能力。将70μL待测溶液、10μL FeCl2溶液、20μL菲洛嗪溶液混合均匀,室温孵育10min,于562nm测得吸光度。EDTA-二钠作为阳性对照。亚铁离子螯合能力按照下式计算:
亚铁离子螯合能力(%)=[1-(A2-A1)/A0]×100
式中:A0是空白组,以蒸馏水代替待测溶液;A1是对照组,以蒸馏水代替FeCl2溶液;A2是试验组,即加入待测溶液。
AR12对H2O2诱导的PC12细胞存活率的影响
PC12来源于褐家鼠肾上腺嗜铬细胞瘤,是一种使用广泛的神经细胞株。本发明使用纯化的多肽作用于PC12细胞,预保护24h,移除药物,再用800μM H2O2刺激2h造成氧化损伤(细胞培养的环境:RPMI 1640培养基+10%胎牛血清+1%青霉素/链霉素,37℃,5%CO2),使用MTT法检测细胞的存活率。
AR12对H2O2诱导的PC12细胞凋亡率的影响
使用AnnexinⅤ-FITC/PI染色法检测多肽对PC12细胞的抗凋亡作用。先用纯化的多肽预保护PC12细胞24h,吸除药物,再用300μM H2O2刺激2h造成氧化损伤。收集细胞,进行染色,在流式细胞仪上检测细胞的凋亡率。
AR12对H2O2诱导的PC12细胞内ROS含量的影响
使用DCFH-DA探针法检测细胞内ROS的含量。先使用纯化的多肽预保护PC12细胞24h,吸除药物后,加入DCFH-DA探针装载20min,洗掉探针,再用300μM H2O2刺激2h造成氧化损伤,收集细胞,在流式细胞仪上检测细胞内ROS的含量变化。
AR12对H2O2诱导的PC12细胞线粒体膜电位的影响
使用JC-1染色法检测细胞线粒体膜电位的变化。先使用纯化的多肽预保护PC12细胞24h,吸除药物后再用300μM H2O2刺激2h造成氧化损伤,加入JC-1染料染色20min,洗掉多余的染料后,在激光共聚焦显微镜下观察细胞线粒体膜电位的变化情况。
AR12对H2O2诱导的PC12细胞内MDA和SOD含量及活性的影响
在使用多肽预保护细胞24h,300μM H2O2刺激细胞2h造成氧化损伤后,收集细胞的内容物,BCA法检测其蛋白的含量,使用MDA与硫代巴比妥酸显色法和WST-8法分别检测细胞内MDA的含量和SOD的活性。
实验结果:
AR12在溶液中的抗氧化能力评价
图1展示了AR12的自由基清除能力、亚铁离子螯合能力以及还原能力。如图1A所示,AR12显示出较强的DPPH自由基清除能力,在同等浓度下,AR12对DPPH自由基清除的能力弱于维生素C,但强于谷胱甘肽,且随着浓度的增加,其DPPH自由基清除率逐步上升,呈现出浓度依赖性的关系。图1B显示AR12可浓度依赖性地清除ABTS自由基,但活性稍弱于维生素C和谷胱甘肽。图1C显示,谷胱甘肽清除羟基自由基的能力较弱,当其浓度达到4mM时,清除率仍小于40%,而AR12显示出良好的羟自由基清除能力,1mM AR12的清除能力就可以达到50%以上,当其浓度为4mM时,羟自由基的清除能力相当于同等浓度的维生素C。由图1D可知,AR12还具有较好的亚铁离子螯合能力,其活性虽不及阳性对照EDTA-二钠,但是当浓度在2.5mM以上时,两者的活性并无显著差别,即AR12的亚铁离子螯合能力稍弱于EDTA-二钠。图1E和1F展示了多肽AR12的还原能力,与谷胱甘肽相比,相同浓度AR12的还原能力较强,且呈现出随浓度增加的趋势。综合看来,多肽AR12具有较强的自由基清除能力、金属离子螯合能力以及还原能力。
AR12在细胞内抗氧化损伤的作用
由图2B可知,AR12在给定浓度下对PC12细胞不仅没有毒性作用,相反还能促进细胞的增殖。图2C显示,未经药物保护,只用双氧水刺激的PC12细胞与空白对照组相比,存活率显著下降,而当给予不同浓度的AR12预保护后,细胞的存活率显著升高,说明AR12对双氧水刺激的PC12细胞具有浓度依赖性的保护作用。
图3中,a为正常组细胞的凋亡情况,b为氧化损伤模型组细胞的凋亡情况,c、d、e图分别为给予100、50和25μM AR12预保护后细胞的凋亡情况,从f图中统计的数据可以看出,只用双氧水刺激的PC12细胞凋亡率显著上升至34.40%,而给予不同浓度的AR12预保护后,凋亡率又下降至21.90%、12.12%、8.24%,说明AR12对双氧水刺激的PC12细胞具有浓度依赖性的抗凋亡作用。
由图4和图5可以看出,AR12的预保护能够显著减少双氧水刺激的PC12细胞内的ROS,并能够有效地恢复膜电位,从而减轻双氧水造成的氧化损伤。
由图6可以知道,AR12还可以有效降低双氧水刺激的PC12细胞内的MDA含量,减轻氧化损伤,同时能够增加细胞内的SOD的含量或者活性,增强细胞抵御氧化损伤的能力。
由图7A和7B可知,AR12在其他细胞模型上也同样具有抗氧化损伤的作用。如图7A,人骨髓神经母细胞瘤细胞株SHSY5Y在600μM H2O2的刺激下,生存率显著下降,当给予50μM以上的AR12或者10μM的维生素C预保护24h后,其存活率又显著升高。同样,根据图7B,10μM的维生素C和100μM的AR12可以显著提高H2O2刺激下的人肝母细胞瘤细胞株HepG2的存活率。
综合以上的结果可知,多肽AR12可以有效地清除各种自由基以及螯合金属离子,具有较强的抗氧化活性和细胞内抗氧化损伤的作用,有望应用于各种对安全性有更高要求的药品、食品、护肤品中,提高对应产品的抗氧化能力;或单独作为抗氧化剂,用于各种生物实验中。多肽AR12也可用于食品保鲜;或作为膳食补充剂用于清除体内多余的自由基、预防或延缓衰老;或作为药品或辅助用药用于治疗与氧化损伤有关的神经退行性疾病、肿瘤或炎症等疾病。
最后应说明的是:以上实施例仅用以说明本发明的技术方案,而非对其限制;尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明,本领域的普通技术人员应当理解,其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分技术特征进行等同替换;而这些修改或者替换,并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 中山大学
<120> 多肽AR12在制备抗氧化剂中的应用
<130> AR12
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工多肽
<400> 1
Ala Arg Phe Glu Glu Leu Cys Ser Asp Leu Phe Arg
1 5 10
Claims (10)
1.多肽AR12在制备抗氧化剂中的应用,所述多肽AR12的氨基酸序列为ARFEELCSDLFR。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于:所述抗氧化剂为口服制剂、外用制剂中的一种。
3.根据权利要求1所述的应用,其特征在于:所述抗氧化剂为用于溶液体系的抗氧化剂。
4.根据权利要求1所述的应用,其特征在于:所述抗氧化剂用于清除DPPH自由基、ABTS自由基、羟基自由基和/或螯合金属离子。
5.根据权利要求1所述的应用,其特征在于:所述抗氧化剂用于保护细胞免受氧化损伤。
6.多肽AR12在制备抗氧化添加剂中的应用,所述多肽AR12的氨基酸序列为ARFEELCSDLFR。
7.根据权利要求6所述的应用,其特征在于:所述添加剂用于药品、食品或护肤品。
8.根据权利要求6所述的应用,其特征在于:所述添加剂用于:
食品保鲜;
清除体内多余的自由基、预防或延缓衰老;
治疗或辅助治疗因细胞氧化损伤导致的神经退行性疾病、心脑血管疾病、肿瘤或炎症。
9.多肽AR12作为抗氧化能力检测标志物中的应用,所述多肽AR12的氨基酸序列为ARFEELCSDLFR。
10.一种检测产物抗氧化能力的方法,包括定量所述产物中多肽AR12的含量,所述多肽AR12的氨基酸序列为ARFEELCSDLFR。
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