CN114763370B - 一种抗氧化十肽及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抗氧化十肽及其制备方法和应用，属于活性肽领域。本发明的抗氧化十肽的氨基酸序列为Ala‑Tyr‑Asn‑Ile‑Pro‑Val‑Asn‑Ile‑Ala‑Arg，实验证明其对H2O2处理诱导PC‑12细胞损伤具有显著的抑制作用，可有效降低H2O2处理诱导PC‑12细胞氧化应激，可以很好地改善和防治氧化应激的相关疾病，尤其是神经损伤疾病的作用。此外，本发明提供了所述抗氧化十肽的制备方法，可利用核桃蛋白进行酶解后分离得到；或通过多肽固相合成法将氨基酸连接得到。
Description
技术领域
本发明属于活性肽领域，具体涉及一种抗氧化十肽及其制备方法和应用。
背景技术
随着全球社会老龄化现象的日益严重，老年痴呆等神经退行性疾病已经成为全球公众健康问题，亟待解决。因此，探索和研究具有改善或治疗与神经损伤相关的功能物质已成为热点和难点。氧化应激是指机体内产生的活性氧（ROS）水平和内源性抗氧化能力之间的细胞氧化还原失去平衡，抗氧化能力相对不足，机体内ROS相对增加，攻击机体内生物大分子，如蛋白质和DNA等，进而导致细胞和组织损伤。氧化应激在神经元功能障碍和神经退行性变的进展中起着关键作用。此外，发生在中枢神经系统中的氧化应激随着年龄的增加而增加，进而导致与年龄相关的神经退行性疾病的发生，如阿兹海默症和帕金森症等。因此，拮抗机体的氧化应激，恢复机体内氧化系统与抗氧化系统的平衡状态，可有效改善或抑制机体的神经损伤。
活性肽属于重要的食品功能因子，具有抗氧化、神经保护和免疫调节等生物活性，可广泛应用于食品和保健品，深受消费者的喜爱。核桃蛋白是一种优质的植物蛋白资源，将其进行酶解改性后，功能特性得到极大的改善。与核桃蛋白相比，核桃肽具有更好的营养价值和生理功能，在食品和保健食品等领域具有广泛的开发和利用前景。尽管目前已有不少关于核桃活性肽的报道，但具有较高活性的核桃肽产品仍然很少。此外，活性肽的生物活性与其化学结构，特别是氨基酸序列高度相关。因此，有必要开展核桃活性肽的制备工艺、结构鉴定与活性评价研究，揭示主要核桃活性肽的化学结构，有助于提高核桃产品的附加价值和市场竞争力，推动核桃产业的发展。
发明内容
为此，本发明的第一个目的在于提供一种抗氧化十肽，其氨基酸序列为：Ala-Tyr-Asn-Ile-Pro-Val-Asn-Ile-Ala-Arg（SEQ ID NO.1），即AYNIPVNIAR。本发明的抗氧化十肽AYNIPVNIAR可抑制H2O2诱导的神经细胞损伤，同时缓解H2O2诱导的神经细胞氧化应激反应，具有潜在的脑部神经保护功效。
本发明的第二个目的在于提供上述抗氧化十肽的制备方法。
在一实施例中，采用酶解法并结合超滤和ODS色谱柱进行分离纯化，从核桃蛋白酶解液中获取，具体地包括以下步骤：
（1）将核桃蛋白加入去离子水中，高速剪切分散后，调节pH值至7.5~8.5，先加入胰蛋白酶于37℃搅拌1~2 h，随后加热至45~60℃，加入碱性蛋白酶；再搅拌水解4~12 h，分步酶解结束后高温灭酶，离心取上清液，得到核桃蛋白水解液；在酶解过程中，酶的用量以核桃蛋白的质量为计算基准，其中胰蛋白酶0.5~2.0%，碱性蛋白酶1~2.5%；
（2）核桃蛋白水解液经超滤膜（3 kDa）后收集透过液，浓缩、冷冻干燥后获得核桃蛋白酶解液的低分子量组分；
（3）核桃蛋白酶解液的低分子量组分采用ODS色谱柱进行纯化，用乙醇水溶液作为洗脱剂，流速为2.0~5.0 mL/min，检测波长为220 nm，收集合并成多个洗脱峰组分，检测抗氧化活性较强的组分从而获得抗氧化十肽。
优选地，所述的高温灭酶是90℃下处理10~15 min。
优选地，是用乙醇水溶液作为洗脱剂，从体积比5：95~40：60梯度洗脱。
优选地，流速为4.0 mL/min，检测波长为220 nm，收集乙醇与水体积比为20：80洗脱的组分。
本发明的第三个目的在于提供上述抗氧化十肽在制备防治神经损伤的药物或食品中的应用。
优选地，所述的食品包括保健食品。
优选地，所述的防治神经损伤是指神经细胞氧化损伤。
更优选地，所述的神经细胞氧化损伤是指H2O2诱导的神经细胞氧化应激。
更优选地，所述的神经细胞是PC-12细胞。
本发明的第四个目的在于提供一种防治神经损伤的药物或食品，含有上述的抗氧化十肽作为活性成分以及在药学或食品上可接受的载体或赋形剂。
优选地，所述的食品包括保健食品。
本发明的第四个目的在于提供核桃蛋白在制备上述的抗氧化十肽中的应用。
优选地，采用酶解法并结合超滤和ODS色谱柱进行分离纯化，从核桃蛋白酶解液中获取抗氧化十肽。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
1. 本发明的抗氧化十肽结构清晰明了，可通过对核桃蛋白酶解物进行分离纯化获得，也可通过多肽固相合成法获取。
2. 实验表明本发明的抗氧化十肽可显著提高H2O2处理后PC-12细胞存活率，并呈浓度梯度效应，同时缓解H2O2诱导的神经细胞氧化应激反应，说明该抗氧化十肽对H2O2诱导的神经细胞损伤具有较好的抑制作用，具有潜在的脑部神经保护作用，可用于制备防治神经损伤的药物、食品。
3. 本发明能够推动核桃的深加工利用，提升核桃产品附加值和市场竞争力，促进该行业的可持续发展。
附图说明
图1是抗氧化十肽的二级质谱图。
图2是抗氧化十肽对H2O2诱导的PC-12细胞活力的影响，其中不同字母表示平均值具有显著性差异（p< 0.05）。
图3是抗氧化十肽对H2O2诱导的PC-12细胞内ROS水平的影响，其中不同的字母表示平均值具有显著性差异（p< 0.05）。
具体实施方式
本发明下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。
本发明的术语“包括”和“具有”以及它们任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。例如包含了一系列步骤的过程、方法、装置、产品或设备没有限定于已列出的步骤或模块，而是可选地还包括没有列出的步骤，或可选地还包括对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤。
以下结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1：高分化PC-12细胞培养
PC-12细胞系来自能移植的雄性大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤，可表达神经生长因子(NGF)受体。高分化PC-12细胞呈多角形，与神经细胞表型相似。高分化PC-12细胞采用RPMI1640培养基培养，其中加入10%胎牛血清，50 units/mL青霉素和50 µg/mL链霉素。细胞在37℃、5%CO2中进行培养。根据细胞生长情况及时进行换液和传代。
实施例2：总抗氧化能力的测定方法
多肽的总抗氧化能力的测定采用氧自由基吸收能力（ORAC）法。本实验所用试剂均用75 mM 磷酸二氢钾-磷酸氢二钾（磷酸盐缓冲溶液，pH=7.4）缓冲溶液配制，且现配现用。标准品Trolox（维生素E水溶性类似物）需配制成系列浓度(6.25，12.5，25，50 μM)。待测样品用磷酸盐缓冲溶液稀释。具体操作步骤如下：在96孔黑色底部透明微孔板相应的微孔中加入20 μL磷酸盐缓冲溶液（空白对照）或经磷酸盐缓冲溶液稀释的抗氧化物质（Trolox或待测样品），37 °C下暗处孵育10 min；然后加入200 μL荧光工作液（荧光素钠），在37 °C下暗处孵育20 min；随后迅速在各个微孔中加入20 μLABAP溶液（自由基诱发剂），在多功能酶标仪中连续测定其荧光强度的变化（37 °C，每1.5 min测定一次，总时长为75 min，激发波长为485 nm，发射波长为538 nm）。以Trolox为标准品绘制标准曲线，所有样品都采用三个平行试验。
根据抗氧化剂作用下的荧光熄灭曲线下面积（AUC）与无抗氧化剂存在时（空白对照）自由基的AUC计算抗氧化剂的保护面积——荧光熄灭曲线的延迟部分面积（NetAUC）。
Net AUC的计算公式为：Net AUC = AUC样品 - AUC空白对照 式1
根据Trolox浓度和NetAUC之间的回归方程来计算ORAC值，并表示为每克样品的Trolox当量（μmol Trolox equivalents (TE)/g）。
实施例3：抗氧化十肽的分离纯化及结构鉴定
（1）核桃蛋白酶解物的制备：将核桃蛋白（广州合诚实业有限公司）加入去离子水中（1:12，g/mL），高速剪切分散后，调节pH值至8.0，按照核桃蛋白的质量先加入1.0%（w/w）的胰蛋白酶（上海源叶生物科技有限公司）于37 °C搅拌1 h，随后加热至55 °C，加入1.0%（v/w）的碱性蛋白酶（诺维信Alcalase2.4 L）；再搅拌水解8 h，随后95 °C下灭酶15 min；离心取上清液，得到核桃蛋白水解液；
（2）抗氧化十肽的分离纯化：核桃蛋白水解液经超滤膜（3 kDa）后收集透过液，浓缩、冷冻干燥后获得核桃蛋白酶解液的低分子量组分。该组分继续采用ODS色谱柱（20×250mm）进行纯化，用乙醇水溶液作为洗脱剂，按乙醇体积分数以5%的幅度在400 min内从5%逐渐上升到40%梯度洗脱，流速为4.0 mL/min，检测波长为220 nm，收集合并成9个洗脱峰组分。按照实施例2所述的总抗氧化能力的测定方法进行检测，选择抗氧化活性较强的组分WPH-6（乙醇体积分数为20%洗脱的目标活性肽成分）进行高分辨率质谱分析，证实该组分中含有本发明的抗氧化十肽。
表1不同洗脱峰组分的总抗氧化能力（不同字母表示平均值具有显著性差异（p<0.05））
通过测定不同组分的氧自由基吸收能力来反映提取物的总抗氧化活性。氧自由基吸收能力（ORAC），又称为抗氧化能力；ORAC值越大，说明该物质对氧自由基的吸收能力越强，抗氧化活性越高。通过利用ODS色谱柱纯化核桃蛋白酶解液低分子量（MW＜3 kDa）组分，共获得9个主要组分。它们的总抗氧化活性如表1所示，其中组分WPH-6的ORAC值最高。因此，采用UHPLC- LTQ-Orbitrap-Elite分析组分WPH-6的特定氨基酸序列，得到本发明的抗氧化十肽AYNIPVNIAR，其二级质谱图信息如图1A所示。
该抗氧化十肽在阳离子模式下的分子离子峰m/z为565.8174，z为2。m/z896.5309、782.4882、669.4040、572.3514和473.2830分别为碎片Asn-Ile-Pro-Val-Asn-Ile-Ala-Arg（y8）、Ile-Pro-Val-Asn-Ile-Ala-Arg（y7）、Pro-Val-Asn-Ile-Ala-Arg（y6）、Val-Asn-Ile-Ala-Arg（y5）和Asn-Ile-Ala-Arg（y4）的y离子信号；m/z 349.1506和235.1077分别为碎片Ala-Tyr-Asn（b3）和Ala-Tyr（b2）的b离子信号。这些信号的存在证实了该抗氧化十肽的结构为Ala-Tyr-Asn-Ile-Pro-Val-Asn-Ile-Ala-Arg（SEQ ID NO.1）。
实施例4：多肽固相法合成Ala-Tyr-Asn-Ile-Pro-Val-Asn-Ile-Ala-Arg
将二氯树脂溶胀、洗涤、脱除Fmoc保护基后加入氨基酸进行缩合反应，重复脱除-保护-缩合的过程，直至所有的氨基酸连接完毕。切割树脂，得到多肽Ala-Tyr-Asn-Ile-Pro-Val-Asn- Ile-Ala-Arg粗品，利用ODS色谱柱（20×250 mm）进行纯化，以乙醇水溶液作为洗脱剂，以乙醇与水的体积比15：85~40：60梯度洗脱，流速为4.0 mL/min，检测波长为220nm，收集乙醇与水体积比为20：80的组分，获得多肽纯品，其纯度大于95%。再利用UHPLC-LTQ-Orbitrap-Elite对合成多肽进行分析，发现与被鉴定物质的出峰保留时间一致，均为19.98 min，且质谱碎片一致（见图1B），表明成功合成本发明抗氧化十肽。
UHPLC分析条件：色谱柱为ACE EXCEL 1.7 C18-PFP （2.1 × 100 mm）；洗脱溶剂分别为A：0.1%甲酸水溶液，B：乙腈；洗脱程序为：0~3 min，5% B；3~25 min，40%B；25~28min，95%B；28~33 min，95%B；33~34 min，5%B；34-38 min，5%B。
实施例5：抗氧化十肽对H2O2诱导的PC-12细胞活力的影响
取100 μL对数生长期的高分化PC-12细胞（1×104个/孔）接种于96孔板中，置于37°C、5%CO2的培养箱中培养24 h。弃去生长培养基（实施例1所述的RPMI 1640培养基）后加入100 μL的含不同浓度（0.1 mg/mL、0.2 mg/mL、0.5 mg/mL和1mg/mL）本发明抗氧化十肽的培养基，对照孔加入等体积生长培养基（RPMI 1640培养基）。置于培养箱中继续培养12 h后弃掉培养基，在96孔板中加入含100 μM H2O2的RPMI 1640培养基（空白对照孔加入等体积RPMI1640培养基）。置于培养箱中继续孵育12 h后，采用Cell Counting Kit-8（CCK8）试剂盒（碧云天生物）检测细胞活力。
CCK8试剂盒，是一种基于2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐（WST-8）而广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的快速、高灵敏度检测的试剂盒。在电子耦合试剂存在的情况下，WST-8可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成水溶性的橙黄色结晶甲瓒（formazan）。当细胞增殖越多越快，其颜色越深；细胞毒性越大，其颜色越浅。采用酶联免疫检测仪测定其在450 nm下吸光值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，吸光值与细胞数目呈线性关系。
H2O2作用12 h后，弃掉旧培养基，加入110 μL含CKK8溶液的RPMI 1640培养基（CKK8溶液：RPMI 1640培养基=1:10，v/v），37 oC下避光孵育2 h后，采用酶标仪检测450 nm下吸光值，计算细胞活力，计算公式如式2所示。实验重复三次。
其中：A对照表示仅加入生长培养基处理的细胞；A样品表示加入不同浓度多肽样品和过氧化氢处理的细胞。
结果如图2所示。结果表明H2O2处理可显著诱导PC-12细胞死亡，模型组（抗氧化十肽浓度为0 mg/mL）中细胞存活率仅为32.04%。抗氧化十肽可显著提高H2O2处理后PC-12细胞存活率至52.37%~100%，并呈浓度梯度效应。这一结果说明高浓度（≥ 1 mg/mL）抗氧化十肽预处理可完全抑制H2O2所诱导的PC-12细胞死亡。
实施例6： 抗氧化十肽对H2O2诱导的PC-12细胞ROS生成量的影响
将1 mL对数生长期的高分化PC-12细胞以1×105个/孔的密度种植于12孔细胞培养板中。37 °C下孵育24 h后，弃掉生长培养基并分别加入1 mL的含不同浓度（0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.5mg/mL、1mg/mL）的抗氧化十肽培养基（实施例1所述的RPMI 1640培养基）进行处理，对照孔加入等体积培养基。预处理12 h后，再加入含100 μM H2O2的培养基继续孵育12h（空白对照孔加入等体积培养基），然后弃掉培养基，磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗2遍后，加入含DCFH-DA（终浓度为10 μM）的无血清DMEM培养基，37 °C下孵育25 min后收集细胞，PBS清洗3遍后，将细胞重悬于Hank's平衡盐溶液并接种到黑色96孔板。采用多功能酶标仪检测荧光变化（激发波长为485 nm，发射波长为525 nm）。将对照组的荧光水平标准化，并以百分比计算。
结果如图3所示，表明H2O2处理可诱导PC-12细胞内ROS的生成，引起细胞内氧化应激。本发明的抗氧化十肽可有效抑制胞内ROS的累积，减轻PC-12细胞氧化应激状态。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 中国科学院华南植物园
<120> 一种抗氧化十肽及其制备方法和应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 10
<212> PRT
<213> 核桃(Juglans regia L.)
<400> 1
Ala Tyr Asn Ile Pro Val Asn Ile Ala Arg
1 5 10
Claims (5)
1.一种抗氧化十肽，其特征在于，氨基酸序列为Ala-Tyr-Asn-Ile-Pro-Val-Asn-Ile-Ala-Arg。
2.一种制备权利要求1所述的抗氧化十肽的方法，其特征在于，选自以下任一种方法：
i. 所述的抗氧化十肽是利用核桃蛋白进行酶解后分离得到；
ii. 所述的抗氧化十肽是通过多肽固相合成法将氨基酸连接得到；
所述的利用核桃蛋白进行酶解后分离得到，包括以下步骤：
（1）将购自广州合诚实业有限公司的核桃蛋白按1g/12mL加入去离子水中，高速剪切分散后，调节pH值至8.0，按照核桃蛋白的质量先加入1.0%（w/w）的胰蛋白酶，于37 °C搅拌1h，随后加热至55 °C，加入1.0%（v/w）的碱性蛋白酶；再搅拌水解8 h，随后95 °C下灭酶15min；离心取上清液，得到核桃蛋白水解液；
（2）核桃蛋白水解液经3 kDa超滤膜超滤后收集透过液，浓缩、冷冻干燥后获得核桃蛋白酶解液的低分子量组分；
（3）低分子量组分继续采用ODS色谱柱进行纯化，用乙醇水溶液作为洗脱剂，按乙醇体积分数以5%的幅度在400 min内从5%逐渐上升到40%梯度洗脱，流速为4.0 mL/min，检测波长为220 nm，收集乙醇体积分数为20%洗脱的目标活性肽成分，即为权利要求1所述的抗氧化十肽。
3.权利要求1所述的抗氧化十肽在制备治疗神经细胞氧化损伤的药物中的应用，所述的神经细胞氧化损伤是指H2O2诱导的神经细胞氧化应激。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的神经细胞是PC-12细胞。
5.一种治疗神经细胞氧化损伤的药物，其特征在于，含有权利要求1所述的抗氧化十肽作为活性成分以及在药学上可接受的载体。
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Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 不同蛋白源酶解产物对过氧化氢诱导损伤PC12 细胞 的保护作用研究;李文治等;《现代食品科技》;第32卷(第10期);22-27 * |
| 长白山核桃源五肽对过氧化氢诱导PC12细胞 氧化损伤的保护作用及机理;郭勇等;《食品科学》;第40卷(第13期);143-149 * |
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|---|---|
| CN114763370A (zh) | 2022-07-19 |
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