KR20190050927A - Mmp2 유전자 발현 및 콜라겐 분해를 억제하는 조성물을 제조하기 위한 미모사 추출물의 용도 - Google Patents
Mmp2 유전자 발현 및 콜라겐 분해를 억제하는 조성물을 제조하기 위한 미모사 추출물의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 기질금속단백질분해효소2(MMP2) 유전자 발현을 억제하는 조성물을 제조하기 위한 미모사 추출물의 용도 및 콜라겐 분해를 억제하는 조성물을 제조하기 위한 미모사 추출물의 용도를 제공한다. 본 발명에 따른 미모사 추출물은 물, 알코올류, 또는 알코올-물 혼합물을 용제로 미모사를 추출함으로써 제조된다. 상기 미모사 추출물은 피부 섬유모세포 중의 MMP2의 유전자 발현을 억제하여 피부 중의 콜라겐의 분해를 줄임에 따라, 피부 탄성 및 치밀성을 향상시키고 피부의 잔주름 및 주름을 감소시키며 피부 노화를 지연시킬 수 있다.
Description
본 발명은 미모사 추출물의 용도에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 기질금속단백질분해효소2(MMP2) 유전자 발현 및 콜라겐 분해를 억제하는 조성물을 제조하기 위한 미모사 추출물의 용도에 관한 것이다.
콜라겐(collagen)은 동물 체내에서 함량이 매우 높은 단백질로서, 체내 총 단백질의 약 25%를 차지한다. 콜라겐은 주로 동물 체내의 인대, 힘줄, 연골, 각막과 같은 결합조직의 세포외 기질에 분포되고 결합조직 중의 제일 주요한 단백질이며 결합조직의 약 20%~30%를 차지한다. 콜라겐은 섬유상의 구조를 가지고 결합조직이 필요한 역학적 지지 및 강도를 제공할 수 있으며 혈액의 응고, 상처의 치유, 조직의 수복 등에도 관련되는 매우 중요한 구조성 단백질에 속한다. 인체 내의 콜라겐은 폴리펩타이드 조성의 차이에 따라 다양한 유형으로 나눌 수 있는데, 그 중, 피부 구조와 제일 밀접한 관계를 가지는 것은 제1형, 제3형 및 제4형 콜라겐이다. 진피층에는 제1형 및 제3형의 콜라겐이 포함되는데 이는 피부의 수분 유지 및 탄성 향상에 관련되고, 상피조직 하방의 기저막에는 제4형의 콜라겐이 포함되는데 이는 피부의 수분 전달 및 영양분의 유지에 관련된다.
나이의 증가와 자외선의 장기적인 조사에 따라, 피부 중의 콜라겐은 점차적으로 유실되어 피부의 함수량이 감소하게 되고, 피부의 건조 상태는 더 나아가서 피부 탄성 손실, 주름 생성 및 모공 확장 등 문제를 초래하게 된다. 따라서, 피부 중의 콜라겐을 보충하고 콜라겐의 합성을 증가하며 콜라겐의 분해를 감소하는 것은 이미 피부 노화를 지연시키고 피부 건강을 유지시키는 연구 중점이 되어 있는 실정이다. 직접 콜라겐을 함유한 미용품을 피부 표면에 바르는 방법은 피부 표피층의 차단 작용으로 인하여, 피부 심층의 콜라겐을 효과적으로 보충할 수 없는 문제가 있다. 한편, 구강복용 방식으로 콜라겐을 섭취할 때에는 고분자의 콜라겐이 소화기 계통에서 소분자의 아미노산으로 분해되고 인체의 각 부위에서 섭취한 상기와 같은 아미노산은 꼭 필요한 콜라겐으로 합성되는 것이 아니기 때문에, 콜라겐을 구강 복용하는 방법은 피부의 콜라겐 합성 향상 효과에 제한을 받게 된다.
이에 따라, 콜라겐의 분해를 효과적으로 억제할 수 있는 새로운 조성물을 개발하여 콜라겐의 유실을 감소하고 피부 노화를 방지하는 것이 급히 필요한 실정이다.
따라서, 본 발명의 목적은 기질금속단백질분해효소2(matrix metalloproteinase 2, MMP2) 유전자 발현을 억제하는 조성물을 제조하기 위한 미모사(Mimosa pudica) 추출물의 용도를 제공하는데 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 콜라겐 분해를 억제하는 조성물을 제조하기 위한 미모사 추출물의 용도를 제공하는데 있고, 그 중, 상기 미모사 추출물은 용제를 이용하여 미모사를 추출함으로써 얻어진다.
본 발명에 따른 일 실시예에 있어서, 상기 용제는 물, 알코올류, 또는 알코올-물 혼합물이고, 상기 용제와 미모사의 액체-고체 비율은 5~20:1~5이며, 상기 추출은 50℃~100℃에서 진행된다.
본 발명에 따른 일 실시예에 있어서, 상기 미모사 추출물은 미모사 물 추출물이고, 그 농도는 적어도 0.5 mg/mL이다.
본 발명에 따른 일 실시예에 있어서, 상기 콜라겐은 제4형 콜라겐이다.
본 발명에 의하여 물, 알코올류, 알코올-물 혼합물을 용제로 추출하여 얻어진 미모사 추출물은, 피부 섬유모세포 중의 MMP2의 유전자 발현을 억제하여 세포 외기질 중의 제4형 콜라겐의 분해를 줄일 수 있고 최종적으로 피부 중의 콜라겐 함량을 증가시키는 효과를 이룰 수 있으며, 이에 따라 피부 탄성 및 치밀성을 향상시키고 피부의 잔주름 및 주름을 감소시키며 피부 노화를 지연시킬 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 미모사 추출물은 MMP2 유전자의 발현 및 콜라겐의 분해를 억제하는 조성물의 제조에 사용될 수 있고, 상기 조성물은 분말 형상, 과립 형상, 액체 형상, 겔 형상 또는 페이스트 형상일 수 있으며, 식품, 음료, 약품, 시약 또는 영양 보충제로 제조될 수 있고, 구강 복용하거나 또는 피부에 바르는 등 방식으로 개체에 사용될 수 있다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시 방식에 대하여 더 상세하게 설명하도록 한다. 하기 내용에 기재된 실시예들은 본 발명의 특징 및 사용에 대하여 설명하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위를 한정하고자 하는 것이 아니고, 본 기술을 숙지한 모든 자는 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않는 범위 내에서 변경 및 수정을 진행할 수 있다. 따라서, 본 발명의 보호 범위는 첨부된 청구항의 범위에 의하여 정의되어야 할 것이다.
도 1은 본 발명에 따른 미모사 추출물에 의하여 처리된 인간 피부 섬유모세포 및 대조군의 인간 피부 섬유모세포 중의 콜라겐 상대 생성량을 도시한 것이다.
도 2는 본 발명에 따른 미모사 추출물에 의하여 처리된 인간 피부 섬유모세포 중 MMP2 유전자의 상대 발현량을 도시한 것이다.
도 2는 본 발명에 따른 미모사 추출물에 의하여 처리된 인간 피부 섬유모세포 중 MMP2 유전자의 상대 발현량을 도시한 것이다.
본 발명은 콜라겐 분해를 억제하는 조성물을 제조하기 위한 미모사 추출물의 용도를 제공한다. 본 발명에 따른 미모사 추출물은 용제를 이용하여 미모사를 추출함으로써 얻어지고, 그 중, 상기 용제는 물, 알코올류, 또는 알코올-물 혼합물이며, 상기 용제와 상기 미모사의 액체-고체 비율은 5~20:1~5이고, 상기 추출은 50℃~100℃에서 진행된다. 콜라겐 함량 실험 및 콜라겐 분해 관련 유전자의 발현량에 대한 분석에 의하여, 본 발명에 따른 미모사 추출물은 인간 피부 섬유모세포의 콜라겐 생산량을 향상시킬 수 있고 상기 생산량의 증가는 MMP2 유전자의 발현량 감소와 관련이 있음을 입증하였다. 따라서, 본 발명에 따른 미모사 추출물은 MMP2 유전자 발현을 억제하는 조성물을 제조하기 위한 용도로 사용될 수도 있다.
정의
본 명세서에서 사용한 수치는 근사치이고 모든 실험 데이터는 20%의 범위 내에서 표시되었으며, 비교적 바람직하게는 10%의 범위, 더욱 바람직하게는 5%의 범위 내에서 표시되었다.
재료 및 방법
재료
Gibco로부터 Earle's 평형염류용액을 포함한 Eagle's 최소 필수 배지(Eagle's minimum essential medium, MEM 배지로 약함), 소태아 혈청(fetal bovine serum, FBS로 약함), 을 구매하고, 비필수 아미노산, 중탄산나트륨, 피르빈산나트륨, 및 인산완충용액(phosphate buffered saline, PBS로 약함)을 구매하였다.
세포 배양
이하 실시예는 인간 피부 섬유모세포(Human skin fibroblast) CCD-966SK(BCRC 60153)를 이용하여 진행되었다. 인간 피부 섬유모세포는 37℃, 5% 이산화탄소의 조건하에서 10% FBS, 0.1 mM 비필수 아미노산, 1.5 g/L 중탄산나트륨, 1mM 피르빈산나트륨을 첨가한 MEM 배지(이하 세포 배지로 약함)에서 배양시켰다.
콜라겐 함량 실험
본 발명은 가용성 콜라겐 분석 키트(Sircol Soluble Collagen Assay Kit, Bicolor)를 이용하여 세포가 분비한 콜라겐의 함량을 측정하였는 바, 그 대략적인 순서는 다음과 같다. 우선 1000 μL의 세포 배지를 취하여 200 μL의 콜라겐 분리/농축 시약과 혼합한 다음 4℃에서 반복적으로 뒤집으면서 일정한 시간 동안 배양하고, 이어서 12000 rpm의 회전속도로 상기 혼합액을 10분 동안 원심분리한 다음 상청액을 제거하였다. 이어서, 나머지 침전물을 1000 μL의 Sircol 착색제와 30분 동안 혼합한 다음 다시 12000 rpm의 회전 속도로 상기 착색제 혼합액을 10분 동안 원심분리하여 콜라겐 침전물을 형성하였다. 상청액을 제거한 다음 우선 750 μL의 산성염 용액으로 상기 콜라겐 침전물을 세척하고 여분의 액체를 제거하고, 250 μL의 알칼리성 시약으로 상기 콜라겐 침전물을 용해한 다음 효소면역분석기(ELISA reader, BioTek)를 이용하여 상기 콜라겐 용액이 555 nm 파장에서의 흡광도를 측정하였다. 수용성 콜라겐 표준 물질의 표준 곡선과 비교하여, 측정 대상 세포 배지 중의 콜라겐 함량을 계산해 낼 수 있다. 통계 분석은 Excel 소프트웨어의 스튜던트 t 분포를 이용하여 판정하였다.
유전자 발현량 분석
본 발명은 정량적 중합효소연쇄반응(quantitative polymerase chain reaction, Q-PCR로 약함)을 통하여 세포 중 콜라겐의 분해에 관련되는 효소의 유전자 발현량을 측정하였는 바, 그 대략적인 순서는 다음과 같다. 제조업체의 사용설명에 따라, 리보핵산 추출 키트(RNA Extraction Kit, Geneaid)를 이용하여 세포로부터 RNA를 분리해낸 다음 37℃에서 역전사 효소 SuperScript® III Reverse Transcriptase (Invitrogen)을 통하여 RNA를 상보적 디옥시리보핵산(cDNA)으로 전사하고, 이어서, Q-PCR 키트(KAPA CYBR FAST qPCR Kit (2X), KAPA Biosystems), MMP2 유전자를 상대로 한 순방향 프라이머 5'-GATACCCCTTTGACGGTAAGGA-3' (서열 번호 1) 및 역방향 프라이머 5'-CCTTCTCCCAAGGTCCATAGC-3' (서열 번호 2), 및 중합효소연쇄반응기(StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems)을 이용하여 상기 cDNA에 대하여 PCR를 진행하여 유전자 발현량 데이터를 취득하였다.
실시예 1
미모사 추출물의 제조
우선, 미모사를 깨끗이 씻어서 자연 건조시킨 다음, 균질기를 이용하여 미모사를 연삭한다. 이어서, 물, 알코올류, 또는 알코올-물 혼합물을 용제로 미모사 균질물을 추출하되, 상기 용제와 미모사 균질물의 혼합 액체-고체 비율은 5~20:1~5로 한다. 추출 온도는 50℃~100℃ 사이로 하고, 바람직하게는 75℃~95℃ 사이로 한다. 본 실시예 중의 추출 시간은 0.5~2 시간으로 한다.
상기 추출 단계를 거쳐 취득한 미모사 추출물을 실온 상태까지 냉각시킨 다음 400 메시(mesh)의 여과망으로 여과하여 잔여 고형물을 제거한다. 상기 여과 후의 미모사 추출물을 더 나아가서 45℃~70℃에서 진공 농축하여 농축 산물을 취득한다. 고체 상태의 미모사 추출물을 취득하기 위하여, 분무 건조 방식을 이용하여 상기 진공 농축을 거친 미모사 추출물 중의 용제를 제거하여 미모사 추출물 분말을 취득한다.
실시예 2
미모사 추출물의 섬유 모세포 콜라겐 생산량 향상 효과
본 발명에 따른 미모사 추출물이 피부 세포의 콜라겐 생산량에 대한 영향을 검증하기 위하여, 본 실시예는 콜라겐 함량 실험을 통하여 인간 피부 섬유모세포 CCD-966SK를 미모사 물 추출물로 처리한 다음의 콜라겐 생산량 변화를 분석하였다. 우선, 인간 피부 섬유모세포를 2×104세포/웰의 밀도로 500 μL의 세포 배지를 포함한 24 웰 플레이트의 각 웰에 접종하고, 37℃에서 24시간 동안 배양한 다음 세포 배지를 제거하고 PBS 용액을 이용하여 세포를 세척한다. 이어서, 500 μL, 1 mg/mL의 미모사 물 추출물과 500 μL의 FBS를 포함하지 않은 세포 배지를 각 웰의 세포에 첨가하고, 또한 500 μL의 FBS를 포함하지 않은 세포 배지만 사용하여 세포를 처리하여 대조군으로 사용한다. 상기 2개 군의 세포를 37℃에서 48시간 동안 배양한 다음, 각 웰로부터 세포 배지를 수집하여 그 중의 콜라겐 함량을 측정하였다.
도 1은 본 발명에 따른 미모사 추출물에 의하여 처리된 인간 피부 섬유모세포 및 대조군 세포 중의 콜라겐 상대 생성량을 도시한 것이다. 도 1에 도시된 바와 같이, 대조군의 인간 피부 섬유모세포에 비하여, 미모사 추출물로 처리된 인간 피부 섬유모세포에서는 세포 배지 중의 콜라겐 함량이 선명하게 약 8.3배 증가되었다. 상기 결과로부터 알 수 있는 바, 미모사 추출물은 피부 섬유모세포의 콜라겐 생산량을 향상시키는 효과를 가진다.
실시예 3
미모사 추출물의 콜라겐 분해 관련 유전자 발현량 억제 효과
더 나아가서 본 발명에 따른 미모사 추출물이 콜라겐 분해효소의 유전자 발현에 대한 조절 작용을 설명하기 위하여, 본 실시예는 Q-PCR를 통하여 인간 피부 섬유모세포 CCD-966SK (BCRC 60153)를 미모사 물 추출물로 처리한 다음 콜라겐 분해 관련 유전자의 발현량 변화를 측정하였다. 우선, 인간 피부 섬유모세포를 1.5×105개 세포/웰의 밀도로 2 mL의 세포 배지를 포함한 6 웰 플레이트의 각 웰에 접종한 다음 37℃에 두고 배양하였다. 이어서, 0.5 mg/mL 또는 1mg/mL의 미모사 물 추출물로 세포를 24시간 처리한 다음, 처리된 세포를 수집하여 Q-PCR를 진행하였다. 대조군의 인간 피부 섬유모세포는 미모사 물 추출물을 포함하지 않은 세포 배지로 처리하였다.
상기 인간 피부 섬유모세포 중의 기질금속단백질분해효소2(MMP2) 유전자 상대 발현량은 도 2에 도시된 바와 같고, 도면 중 세로축의 유전자 상대 발현량은 대조군 세포 중 MMP2 유전자의 RNA 발현량을 상대로 한 배수를 의미한다. MMP2는 제4형 콜라겐 분해효소(type IV collagenase)로도 불리우는데, 세포에서 합성된 다음 세포외 기질로 분비되어 상피조직 하방의 기저막 중의 제4형 콜라겐을 분해시키는 기능을 한다. 도 2에 도시된 바와 같이, 인간 피부 섬유모세포를 0.5 mg/mL 농도 이상의 미모사 추출물로 처리하였을 때 MMP2의 유전자 발현을 현저하게 낮출 수 있다. 상기 세포를 0.5 mg/mL의 미모사 추출물로 처리하였을 때, MMP2 유전자 발현량은 약 대조군 세포의 46%이였다. 상기 결과에 의하여, 본 발명에 따른 미모사 추출물이 피부 섬유모세포 중의 MMP2의 유전자 발현을 억제할 수 있고 이에 따라 피부 중의 콜라겐 분해에 대한 억제효과를 가지고 있음을 알 수 있다.
상기와 같이, 본 발명에 의하여 물, 알코올류, 알코올-물 혼합물을 용제로 추출하여 얻어진 미모사 추출물은, 피부 섬유모세포 중의 MMP2의 유전자 발현을 억제하여 세포 외기질 중의 제4형 콜라겐의 분해를 줄일 수 있고 최종적으로 피부 중의 콜라겐 함량을 증가시키는 효과를 이룰 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 미모사 추출물은 MMP2 유전자의 발현 및 콜라겐의 분해를 억제하는 조성물의 제조에 사용될 수 있고, 상기 조성물은 분말 형상, 과립 형상, 액체 형상, 겔 형상 또는 페이스트 형상일 수 있으며, 식품, 음료, 약품, 시약 또는 영양 보충제로 제조될 수 있고, 구강 복용하거나 또는 피부에 바르는 등 방식으로 개체에 사용될 수 있다.
SEQUENCE LISTING
<110> TCI Co., Ltd
<120> Use of Mimosa pudica extracts for manufacture of composition for inhibiting MMP2 gene expression and collagen degradation
<130> 106B0169-I1
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> artificial sequences
<220>
<223> PCR primer
<400> 1
gatacccctt tgacggtaag ga 22
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> artificial sequences
<220>
<223> PCR primer
<400> 2
ccttctccca aggtccatag c 21
Claims (13)
- 용제를 이용하여 미모사 (Mimosa pudica)를 추출함으로써 얻어지는 미모사 추출물을 포함하는, 기질금속단백질분해효소2 (matrix metalloproteinase 2: MMP2) 유전자의 발현을 억제하는 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 용제는 물, 알코올류, 또는 알코올-물 혼합물인 것을 특징으로 하는 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 용제와 상기 미모사의 액체-고체 비율은 5~20:1~5인 것을 특징으로 하는 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 추출은 50℃~100℃ 사이의 온도에서 진행되는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 미모사 추출물은 미모사-물 추출물이고, 그 농도는 적어도 0.5 mg/mL인 것을 특징으로 하는 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 조성물은 구강 복용하거나 또는 피부에 바르는 방식으로 투여되는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 용제를 이용하여 미모사를 추출함으로써 얻어지는 미모사 추출물을 포함하는, 콜라겐 분해를 억제하는 조성물.
- 청구항 7에 있어서, 상기 용제는 물, 알코올류, 또는 알코올-물 혼합물인 것을 특징으로 하는 조성물.
- 청구항 7에 있어서, 상기 용제와 상기 미모사의 액체-고체 비율은 5~20:1~5인 것을 특징으로 하는 조성물.
- 청구항 7에 있어서, 상기 추출은 50℃~100℃ 사이의 온도에서 진행되는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 청구항 7에 있어서, 상기 미모사 추출물은 미모사-물 추출물이고, 그 농도는 적어도 0.5 mg/mL인 것을 특징으로 하는 조성물.
- 청구항 7에 있어서, 상기 콜라겐은 제4형 콜라겐인 것을 특징으로 하는 조성물.
- 청구항 7에 있어서, 상기 조성물은 구강 복용하거나 또는 피부에 바르는 방식으로 투여되는 것을 특징으로 하는 조성물.
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