CN113151279B - hsa_circ_0001236及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物医药领域技术领域，具体公开了骨髓间充质干细胞外泌体来源hsa_circ_0001236，序列为SEQ ID NO:1。本发明还公开了上述hsa_circ_0001236在制备诊断或治疗骨关节产品上的应用。本发明提供的hsa_circ_0001236能够促进骨髓间充质干细胞成软骨分化、抑制软骨退变并促进软骨修复。

Description

hsa_circ_0001236及其应用
技术领域
本发明属于生物医药领域技术领域，尤其涉及一种hsa_circ_0001236及其应用。
背景技术
随着人口老年化的发展，骨关节炎(Osteoarthritis,OA)已成为困扰老年人的常见疾病之一。骨关节炎是以关节软骨退变、破坏为主要特点，一旦关节软骨破坏严重，关节两侧的骨面将直接接触摩擦，引发持续且难以缓解的疼痛，极大的影响患者的生活质量，造成患者活动量减少。治疗时，可通过关节置换手术来治疗该疾病，但是会给患者造成巨大的经济负担。因此，现阶段寻找能够缓解、治疗骨关节炎的方法显得尤为重要。
circRNAs是一类在哺乳动物中普遍存在的、具有稳定闭合环状结构的内源性RNA分子，具有高度的保守性，其与含5’和3’末端的传统线性RNA(linear RNA)不同之处在于：circRNAs由外显子跳读或直接反向剪切形成，不受RNA外切酶影响，表达更稳定，不易降解且具有组织特异性。近年研究表明，circRNAs与疾病的发生和发展有密切关联，因此circRNAs已成为继miRNA及lncRNA之后又一临床疾病研究热点。已有研究表明circRNAs与骨关节炎的发生发展密切关联。因此，进一步寻求能够用于缓解、治疗骨关节炎的circRNAs具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种有助于缓解、治疗骨关节炎的骨髓间充质干细胞外泌体来源hsa_circ_0001236及其应用。
为了达到上述目的，本发明提供hsa_circ_0001236，序列为SEQ ID NO:1。
本发明还提供了上述hsa_circ_0001236在骨关节炎诊断或治疗上的应用。
本技术方案的原理和有益效果在于：
(1)本技术方案所提供的骨髓间充质干细胞外泌体来源hsa_circ_0001236(简称hsa_circ_0001236)能够促进骨髓间充质干细胞成软骨分化、抑制软骨退变并促进软骨修复，对缓解、治疗骨关节炎具有重要意义。
(2)本技术方案将人骨髓间充质干细胞体外成软骨分化21天，收集细胞上清，提取外泌体，利用高通量测序方法，比较成软骨分化第0天和第21天细胞上清外泌体中circRNAs的表达谱获得hsa_circ_0001236，hsa_circ_0001236在成软骨分化过程中上调了2.65倍。
(3)本技术方案利用过表达hsa_circ_0001236的外泌体与软骨小球共培养21天，检测成软骨分化相关指标，发现hsa_circ_0001236能够促进骨髓间充质干细胞成软骨分化、抑制软骨退变。
(4)本技术方案利用过表达hsa_circ_0001236的外泌体包装腺相关病毒并将其注射入DMM骨关节炎模型小鼠膝关节腔，发现hsa_circ_0001236能够抑制软骨退变并促进软骨基质的合成。
附图说明
图1为实验一中Western Blot验证外泌体特异性抗原CD63在BMSCs和外泌体的表达差异图；
图2为实验一中高通量测序热图；
图3为实验二中RT-qPCR验证成软骨分化诱导的BMSCs外泌体中该环状RNA表达量图；
图4为实验二中RT-qPCR验证正常软骨细胞和骨关节炎软骨细胞中该环状RNA表达量图；
图5为实验三中阿尔新蓝(Alcian Blue)染色(A)和Col2A1免疫组化(B)验证过表达hsa_circ_0001236的外泌体与BMSCs共培养并诱导成软骨分化形成的软骨小球比对照组有丰富的软骨基质和胶原成分图；
图6为实验四中番红固绿染色图，其中normal：正常小鼠软骨组，OA：DMM模型骨关节炎小鼠软骨组，OA+Exos：关节腔注射空白外泌体腺相关病毒的骨关节炎小鼠软骨组，OA+circ-0001236-Exos：关节腔注射过表达hsa_circ_0001236外泌体的关节炎小鼠软骨组。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
一、本实施例公开了hsa_circ_0001236，hsa_circ_0001236序列如SEQ ID NO:1所示。
二、本实施例还公开了上述hsa_circ_0001236在骨关节炎诊断或治疗上的应用。具体地，可以用于制备骨关节炎诊断产品或治疗产品，产品为引物、探针、试剂盒、药品或外泌体。
三、实验一：获取hsa_circ_0001236；
S1、获取外泌体与鉴定；
(1)骨髓间充质干细胞(BMSCs)经成软骨诱导分化培养，可逐渐诱导成软骨分化，形成软骨小球，诱导过程培养基上清中即含有所需的外泌体。
具体操作如下：获取成人(18-45岁，无恶性肿瘤和代谢性疾病)骨髓样本，采用I型胶原酶(购自Sigma公司)消化，采用Percoll分离液(购买自Gibico公司)梯度离心分离得到单核细胞，平面培养获得具有旺盛生长活性的BMSCs P0，传代至P3代BMSCs，消化、离心收集细胞后，培养基重悬，再次离心后采用PBS(购买自Gibico公司)清洗，收集至1.5mL离心管，离心后弃去上清，加入成软骨分化诱导液12.5μL/孔后种入24孔板，37℃培养、干燥90min后，加入500μL成软骨分化完全培养液(采用成软骨分化诱导液1mL与TGF-β3细胞因子10μL制得)。每72h更换一次培养基，再加入500μL成软骨分化完全培养液持续诱导分化21天。成软骨分化诱导液和成软骨分化完全培养液属于OriCell生产的成人骨髓间质干细胞成软骨诱导分化培养基试剂盒。
收集21天软骨小球与成软骨分化21天的人骨髓间充质干细胞培养基上清。
将成软骨分化21天的人骨髓间充质干细胞培养基上清每50mL一份，以3000g离心15min以除去细胞和细胞碎片，得到上清液。将上清液转移至无菌离心管，并加入SBI生产的ExoQuick-TC外泌体提取试剂盒的提取液10mL，颠倒混匀后，4℃孵育过夜(过夜时间＞12h)，在1500g室温离心30min，弃去上清液后，再次以1500g室温离心5min，彻底弃去液体层，得到外泌体。
(2)采用western blot(WB)鉴定外泌体蛋白标志物CD63；
将外泌体经细胞裂解液(ripa)处理，提取蛋白质，按照WB实验常规步骤鉴定外泌体表面标志物CD63。实验结果说明EXO(外泌体)沉淀提取蛋白有CD63表达，但是BMSCs无该标志物表达，证实了使用上述方法能够从BMSCs上清成功获取外泌体。
具体地，WB实验常规步骤如下：将人软骨细胞、软骨小球及外泌体在含有1％蛋白酶的细胞裂解液(RIPA Buffer，CWBIO Inc)中裂解，12000g离心40min后，分离出蛋白质上清，测定浓度(Nanodrop)并配平样品浓度，加入5x Loading Buffer(CWBIO Inc)，金属浴100℃5min至蛋白变性。
用10％十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳，并转移到硝酸纤维素膜上，在室温下用5％脱脂牛奶浸泡封闭40-60min，CD63(购买自Abcam)及一抗稀释液4℃孵育过夜；相应种属二抗室温孵育1h，配制发光液(ECL，Thermo Fisher)并成像仪(ChemiDoc Touch，BIO-RAD)获取条带图像，实验结果如图1所示。
S2、提取成软骨分化第0天和第21天细胞上清外泌体中总RNA；
采用脱氧核糖核酸酶I处理的RNeasy Mini Kit试剂盒(购买自Qiagen)分别提取成软骨分化第0天和第21天细胞上清外泌体中总RNA。总RNA(1μg)通过M-MLV反转录酶(购买自Takara)反转录合成cDNA，cDNA用于实时定量PCR(qPCR)。qPCR在含10μL的SYBR GreenPCR Master Mix，2.5μL cDNA，200nmol/L引物，共20μL的总反应体系中进行，检测使用Biorad CFX Touch II实时PCR系统(Biorad)，实验重复3个附孔。
S3、通过高通量测序确定hsa_circ_0001236；
如图2所示，利用高通量测序，按照S1的操作，设置两组实验，一组BMSCs+成软骨分化诱导液+成软骨分化完全培养液进行诱导成软骨分化21天(成软骨分化第21天)，另一组BMSCs+空白PBS(相当于成软骨分化第0天)作为空白对照，比较这两组细胞上清外泌体中circRNAs的表达谱，找出差异的环状RNA，即为hsa_circ_0001236。
高通量测序的具体操作步骤如下：按照S2的方法分别提取两组细胞总RNA后，采用康成公司提供的Arraystar Human circRNA Array V2进行高通量RNA芯片分析，即使用RNase R(Epicentre，Inc)消化总RNA，以去除线性RNA并富集环状RNA；进而以随机引物方法(Arraystar超级RNA标记试剂盒，Arraystar)将富集的环状RNA扩增并转录为荧光cRNA；标记的cRNA与Arraystar Human circRNA Array V2(8x15K，Arraystar)杂交，清洗载玻片后扫描并识别阵列(Agilent Scanner G2505C)。Agilent Feature Extraction software(version 11.0.1.1)分析采集的阵列图像。使用R软件limma软件包执行分位数归一化和后续数据处理。
通过Volcano Plot过滤鉴定了两组之间具有统计学意义差异表达的circRNA。通过倍数变化过滤鉴定了成软骨分化第0天和第21天细胞上清外泌体中差异表达的circRNA，进行了层次聚类，发现有26个circRNAs上调，与成软骨分化第0天细胞上清外泌体中circRNAs的表达谱相比，hsa_circ_0001236在成软骨分化过程中上调了2.65倍。
S4、实时荧光定量PCR(RT-qPCR)验证上述测序结果；
根据S1所述方法获取BMSCs成软骨分化第0天和第21天外泌体，并根据S2的方法提取外泌体总RNA，总RNA(1μg)通过M-MLV反转录酶(购买自Takara)反转录合成cDNA，cDNA用于实时定量PCR(qPCR)。qPCR在含10μL的SYBR Green PCR Master Mix，2.5μL cDNA，200nmol/L引物，共20μL的总反应体系中进行，检测使用Biorad CFX Touch II实时PCR系统(Biorad)，实验重复3个附孔。
针对目的环状RNA，即hsa_circ_0001236，选择最优qPCR引物，引物设计参数包括引物大小18-22bp，产物大小100-200bp，引物退火温度为60℃，引物GC含量为45％-55％。
hsa_circ_0001236引物设计：
hsa_circ_0001236-F1:5'-ACTACCTGTGCAAAGCCAGA-3'；
hsa_circ_0001236-R1:5'-CCCTCACGGTAGGTGTAGTC-3'；
综上，与成软骨分化第0天BMSCs上清外泌体中circRNAs的表达谱相比，发现成软骨分化第21天的hsa_circ_0001236显著上调，该结果提示我们BMSC成软骨分化过程中hsa_circ_0001236以外泌体形式分泌到细胞外的程度显著上调，hsa_circ_0001236有利于新生软骨形成，能够抑制关节炎软骨的退变。
四、实验二：在膝骨关节炎软骨和正常软骨样本中探究hsa_circ_0001236表达量动力学规律
S1、分组设置，软骨细胞获取、培养；
设置正常组(normal cartilage/normal cases)：取自下肢肿瘤但未累及膝关节的截肢患者、外伤性截肢患者；骨关节炎组(OA/Chondro-cases)：取自50岁以上因中重度膝骨关节炎进行过膝关节置换的患者，该组关节软骨处于退变状态。
分别获取正常组和骨关节炎组的股骨髁和胫骨平台，把股骨髁和胫骨平台的表面关节软骨切成1mm3大小，然后用蛋白酶4mg/mL(Roche，Inc)预处理1h，清洗后用胶原酶P(购买自Roche)0.25mg/mL消化过夜(7-12h)，过滤、离心后获得人膝关节软骨细胞，然后进行常规平面培养，具体培养方法如下：将离心后软骨细胞以配制10％FBS和1％青霉素、链霉素的DMEM F-12培养基(购买自Gibico)重悬，种入6孔板，每孔细胞数约2×106-4×106，每3天换液一次。
S2、qRT-PCR检测hsa_circ_0001236在正常组和OA组软骨细胞表达量差异
按照实验一的S2操作步骤，分别提取正常组(normal cartilage/normal cases)和骨关节炎组(OA/Chondro-cases)软骨细胞总RNA。
按照实验一的S4操作步骤，检测hsa_circ_0001236在正常组和OA组软骨细胞表达量。实验结果发现hsa_circ_0001236在正常组(normal cartilage/normal cases)中表达量是骨关节炎组(OA/Chondro-cases)软骨表达量的5倍，实验结果如图3和图4所示。实验结果证明hsa_circ_0001236在骨关节炎软骨细胞中高表达，提示其与软骨退变正相关，其对软骨细胞的主要功能可能是促进炎症进展、诱导退变进程。
五、实验三：利用过表达外泌体hsa_circ_0001236与BMSCs诱导成软骨分化的软骨小球共培养21天，检测细胞外基质与成软骨分化相关指标，发现外泌体hsa_circ_0001236能够促进骨髓间充质干细胞成软骨分化、抑制软骨退变。
S1、获取过表达hsa_circ_0001236的BMSCs外泌体、空白载体的BMSCs外泌体及配制相应培养基：
构建hsa_circ_0001236过表达载体与空白载体，并分别导入质粒(优选为大肠杆菌)中扩增，利用
Figure BDA0003062088400000051
3000转染试剂(购买自Gibco Life Technologies)将两个质粒分别转染到人BMSCs，48h后收集细胞进行定量实时PCR，检测目的基因过表达效率。
分别收集已确认过表达效率的两组BMSCs培养基上清，并按照实验一S1方法获取两组外泌体，并利用分光光度计测定浓度(ND1000，Nanodrop)。
将上述两组BMSCs外泌体以200μg/mL加入成软骨完全培养液。
S2、设置空白组(NC-hMSCs)、过表达实验组(hMSCs+circ-0001236-Exo)和过表达对照组(hMSCs-Exo-Control)：
空白组(NC-hMSCs)：BMSCs培养基中仅加入实验一的S1中(1)所述的骨髓间充质干细胞成软骨完全培养液。
将实验一S1获得的hsa_circ_0001236的BMSCs外泌体添加入成软骨分化完全培养液并用于诱导培养BMSCs成软骨分化，得到过表达实验组(hMSCs+circ-0001236-Exo)；将实验三S1获得的空白载体的BMSCs外泌体添加入成软骨完全培养液并用于诱导培养BMSCs成软骨分化，则为过表达对照组(hMSCs-Exo-Control)。
上述三组BMSCs进行成软骨诱导分化0天与21天后分别获取软骨小球进行试验。
S3、阿尔新蓝(Alcian Blue)染色
分别将空白组(NC-hMSCs)、过表达实验组(hMSCs+circ-0001236-Exo)和过表达对照组(hMSCs-Exo-Control)获得的软骨小球置于10％甲醛室温下固定3d，无水乙醇脱水，二甲苯冲洗后石蜡包埋切片，片厚5μm，阿尔新蓝染色，镜下观察软骨形成及软骨基质情况，实验结果如图5中的A。
S4、石蜡切片免疫组化
分别将空白组(NC-hMSCs)、过表达实验组(HMSCs+circ-0001236-Exo)和过表达对照组(HMSCs-Exo-Control)获得的软骨小球石蜡切片放入二甲苯Ⅰ15min→二甲苯Ⅱ15min→二甲苯III15min→无水乙醇Ⅰ5min→无水乙醇Ⅱ5min→85％酒精5min→75％酒精5min→蒸馏水洗。
上述切片置于柠檬酸抗原修复缓冲液(pH6.0)的修复盒中于微波炉内进行抗原修复，中火8min至沸，停火8min保温再转中低火7min，冷却后将玻片浸泡PBS缓冲液洗涤3次，共15min；切片放入3％双氧水溶液，室温避光孵育25min，同上述PBS洗涤15min，阻断内源性过氧化物酶；
在组化圈内滴加5％BSA均匀覆盖组织，室温封闭30min；1:50配制Col2a1(abcam)一抗稀释液(Proteintech公司)，4℃孵育过夜；玻片PBS洗涤稍甩干后，孵育相应种属的二抗(HRP标记)1h；
DAB显色，显微镜下控制显色时间，阳性为棕黄色，蒸馏水冲洗切片终止显色；苏木素复染细胞核3min左右，蒸馏水洗涤，苏木素分化液分化数秒，再次蒸馏水洗涤，苏木素返蓝液返蓝，流水冲洗；
脱水封片：将切片依次放入75％酒精5min→85％酒精5min→无水乙醇Ⅰ5min→无水乙醇Ⅱ5min→正丁醇5min→二甲苯Ⅰ5min中脱水透明，将切片从二甲苯拿出来稍晾干，中性树胶封片；最后经显微镜镜检，图像采集分析，实验结果如图5中B。
六、实验四：采用动物实验验证外泌体hsa_circ_0001236能够抑制关节软骨退变
S1：设置分组Normal组，DMM-OA组，OA-Exo-Control组及OA+circ-0001236-Exo组；
Normal组：即为假手术组，仅切开小鼠膝关节皮肤切口后关闭切口，不做关节内处理。
DMM-OA组：采用DMM(内侧半月板切除)制造骨关节炎模型；
OA-Exo-Control组：构建上述DMM骨关节炎模型小鼠后8周起，以实验三S1所获取空白载体的BMSCs外泌体进行关节腔内注射，每周一次，共四次；
OA+circ-0001236-Exo组：构建上述DMM骨关节炎模型小鼠后8周起，以实验三S1所获取过表达hsa_circ_0001236的BMSCs外泌体进行关节腔内注射，每周一次，共四次；
截取以上四组的小鼠关节做切片并番红固绿染色：将软骨小球置于10％甲醛室温下固定3d，无水乙醇脱水，二甲苯冲洗后石蜡包埋切片，片厚5μm，番红O染色，镜下观察软骨形成及软骨基质情况，实验结果如图6所示，可见关节腔内注射过表达hsa_circ_0001236的BMSCs外泌体后，关节标本关节炎程度低于OA-Exo-Control对照组，说明过表达hsa_circ_0001236的BMSCs外泌体能够抑制软骨退变并促进软骨基质的合成。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。
序列表
<110> 中山大学附属第一医院
<120> hsa_circ_0001236及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 262
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ccagagccct gcatgcccaa cactgccttg ctcatcaaga accccttggc tgccacccac 60
gagttcaagc aggcctgcca gctctgctac cccaagacag gcccccgggc tggcgactac 120
acctaccgtg agggccttga gcacaagtgc aagcgggaca tcctgctcgg ccggctccgg 180
agctcggagg accagacctg gaagcggatc cggccccggc ccactaagac cagcttcgtg 240
ggctcctact acctgtgcaa ag 262

Claims (2)

1.检测hsa_circ_0001236表达水平的试剂在制备骨关节炎诊断产品的应用，其特征在于，产品为引物、探针或试剂盒；产品检测组织为关节软骨；hsa_circ_0001236序列为SEQID NO:1。
2. hsa_circ_0001236在制备骨关节炎治疗产品的应用，其特征在于，产品为药品或骨髓间充质干细胞诱导分化培养的外泌体；hsa_circ_0001236序列为SEQ ID NO:1。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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WO2019210033A1 (en) * 2018-04-25 2019-10-31 Stc Unm Circular rnas for the diagnosis and treatment of brain disorders
CN110564865A (zh) * 2019-09-30 2019-12-13 中国医科大学附属第一医院 一种脂肪干细胞成骨分化相关的circRNA及其应用

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111500578A (zh) * 2020-04-22 2020-08-07 辽宁省肿瘤医院 调控ADSCs成骨分化及组织再生Circ RNA-FTO及其应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
张厚建 ; 张维新 ; 童培建.间充质干细胞来源外泌体治疗骨关节炎和软骨损伤的研究进展.中医正骨.2020,第32卷(第006期),第49-58页. *
杨叶青 ; 陈明 ; 吴补领 ; .环状非编码RNA在间充质干细胞成骨向分化中作用的研究进展.国际口腔医学杂志.2020,(第03期),第257-262页. *

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