CN113667725A - Mstn重组蛋白在斜带石斑鱼筛选中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种mstn重组蛋白在斜带石斑鱼筛选中的应用，包括以下步骤：S1斜带石斑鱼Mstn亚细胞定位分析；Mstn重组蛋白对mstn信号通路下游及相关基因的影响分析；Mstn重组蛋白对肌肉细胞增殖的影响分析。

Description

Mstn重组蛋白在斜带石斑鱼筛选中的应用
技术领域
本发明涉及基因工程领域，尤其涉及一种Mstn重组蛋白在斜带石斑鱼筛选中的应用。
背景技术
肌肉生长抑制素基因(myostatins,mstn)是一种抑制肌肉细胞增殖生长的负调控基因，属于TGF-β家族成员，故又称为gdf-8。研究表明，该基因表达的抑制或突变失活，能阻断Mstn对肌细胞增殖生长的抑制作用，引起广泛的肌肉增殖并显著降低体表脂肪的沉积，产生以肌纤维数量显著增加、体重显著增大为特征的肌肥大现象，即所谓的“双肌性状”。
制备mstn基因工程疫苗并用该疫苗进行免疫，然后利用自身的免疫系统长期生产抗Mstn的抗体，该抗体完全具有专门结合和抑制Mstn的能力，从而能够解除Mstn对肌细胞生长的抑制作用。目前，关于利用mstn进行主动免疫的方法主要集中在畜牧业，如牛、羊、猪等，在水产领域中，尤其是斜带石斑鱼的养殖中很少有关于mstn的报道。
发明内容
本发明克服了现有技术的不足，提供Mstn重组蛋白在斜带石斑鱼筛选中的应用。
为达到上述目的，本发明采用的一种技术方案为：
一种mstn重组蛋白在斜带石斑鱼筛选中的应用，包括：
S1 斜带石斑鱼Mstn亚细胞定位分析；
S2 Mstn重组蛋白对mstn信号通路下游及相关基因的影响分析；
S3 Mstn重组蛋白对肌肉细胞增殖的影响分析
其中：S1包括以下步骤：
S101 鱼体组织样品采集；
S102 将提取后的RNA保存在低温冰箱中备用；
S103 按照设计的反转录体系，合成的cDNA于-80℃保存备用；
S104 设计目的基因扩增引物，进行反应后，再将目的基因分离、回收、纯化后获得目的基因；
S105 对目的片段和载体进行双酶切，然后进行片段回收；
S106 通过T4 DNA连接酶连接将载体片段和目的基因片段进行连接，然后进行转化和测序；
S107 使用试剂盒对去内毒素质粒进行提取，获得质粒，并且对质粒进行电泳检测；
S108 将细胞计数后传入24孔板中，细胞浓度为1×106/mL，置于28℃培养箱中培养18h，待细胞铺满单层的70-80％后即可开始转染，按照每孔800ng质粒，2μL转染试剂的标准进行转染；
S109 亚细胞定位；
S2 包括以下步骤：
S201 培养肌肉原代细胞；
S202 用Mstn重组蛋白孵育肌肉原代细胞；
S203 肌肉原代细胞RNA提取；
S204 cDNA合成；
S205 实时荧光定量PCR；
S3 包括以下步骤：
S301 培养肌肉原代细胞；
S302 用Mstn重组蛋白孵育肌肉原代细胞；
S303 用CCK-8法检测细胞增殖状态；
S304 用流式细胞仪检测细胞周期。
在本发明的一个较佳实施例中，进一步包括，S1中，通过构建含mstn的目的质粒，将目的质粒与空载转染到GS细胞中发现，绿色荧光在细胞质中呈点状分布。
在本发明的一个较佳实施例中，进一步包括，S2中，用Mstn重组蛋白对斜带石斑鱼的肌肉原代细胞进行刺激后，通过实时荧光定量检测仪检测Mstn重组蛋白对mstn信号通路及下游相关基因具有影响。
在本发明的一个较佳实施例中，进一步包括，mstn信号通路包括p21、smad3、mrf4、myod、myog。
在本发明的一个较佳实施例中，进一步包括，S303中用浓度为1000nM的Mstn重组蛋白分别刺激肌肉原代细胞5d，通过酶标仪测定肌肉原代细胞每天的OD值来研究Mstn对肌肉细胞增殖的影响。
在本发明的一个较佳实施例中，进一步包括，在培养的五天内，用Mstn重组蛋白处理的实验组细胞生长明显减缓，对照组和实验组细胞的活性差异在第一天就达到了显著性水平，并且随着处理时间的增加，细胞活性差异进一步扩大。
在本发明的一个较佳实施例中，进一步包括，S304中通过流式细胞仪检测细胞周期，结果发现用Mstn重组蛋白处理过后的细胞在S期受阻，细胞周期受阻，Mstn重组蛋白抑制斜带石斑鱼肌肉细胞的增殖。
本发明解决了背景技术中存在的缺陷，本发明具备以下有益效果：
(1)通过构建含mstn的目的质粒，将目的质粒与空载转染到GS细胞中发现，绿色荧光在细胞质中呈点状分布，这表明在GS细胞中，Mstn分布在细胞质中，Mstn蛋白在细胞质中表达。
(2)用Mstn重组蛋白对斜带石斑鱼的肌肉原代细胞进行刺激后，通过实时荧光定量检测仪检测Mstn重组蛋白对p21、smad3、mrf4、myod和myog等mstn信号通路及下游相关基因的影响。随着处理浓度的升高，p21、smad3和mrf4 mRNA的表达量也逐渐而上升，当处理浓度为100nM和1000nM时，p21存在显著性差异，而smad3II和mrf4的表达量虽然随着处理浓度的升高而上升，但不存在显著性差异；随着处理浓度的升高，myod和myog mRNA的表达量均而下降，但myod mRNA下降趋势并不显著，myog mRNA则有着明显的下降，当重组蛋白处理浓度为100nM和1000nM时存在显著性差异。
(3)用浓度为1000nM的Mstn重组蛋白分别刺激肌肉原代细胞5d，通过酶标仪测定肌肉原代细胞每天的OD值来研究Mstn对肌肉细胞增殖的影响。研究发现，在培养的五天内，用Mstn重组蛋白处理的实验组细胞生长明显减缓，对照组和实验组细胞的活性差异在第一天就达到了显著性水平，并且随着处理时间的增加，细胞活性差异进一步扩大；而通过流式细胞仪检测细胞周期，结果发现用Mstn重组蛋白处理过后的细胞在S期受阻，细胞周期受阻。说明Mstn重组蛋白抑制斜带石斑鱼肌肉细胞的增殖。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明进一步说明；
图1 mstn亚细胞定位图其中DAPI细胞核染色；EGFP荧光蛋白；Merge：合并。
图2 p21的表达量图；
图3 smad3的表达量图；
图4 mrf4的表达量图；
图5 myod的表达量图；
图6 myog的表达量图；
图7 细胞生长曲线图；
图8 PBS处理后的细胞周期图；
图9 Mstn重组蛋白处理的细胞周期图。
具体实施方式
现在结合实施例对本发明作进一步详细的说明。
实施例1：本实施例中公开了斜带石斑鱼Mstn亚细胞定位分析方法，具体步骤如下：
1.1鱼体组织样品采集
用丁香酚对斜带石斑鱼进行麻醉，解剖鱼体，采集肌肉组织样本放入装有1mLRNA保护液(Omega)的RNase-Free EP管中，于-80℃冰箱保存。
1.2总RNA提取
(1)所有剪刀、镊子用75％乙醇消毒后用锡箔纸包好，高压灭菌锅灭菌，所用RNA枪头用全新盒装枪头，高速离心机开4℃预冷。
(2)将样品从-80℃冰箱取出，置于冰上解冻，取RNase-Free EP管并加入600μL
Figure BDA0003236283340000051
reagent试剂(Invitrogen)，然后将样品放入其中，用研磨棒粉碎样品组织块，后加入400μL
Figure BDA0003236283340000052
reagent试剂(Invitrogen)补足至1mL，混匀后室温静置5min。
(3)加入200μL氯仿，震荡机上震荡混匀，室温静置15min。
(4)12000rpm、4℃的状态下离心15min，吸取上清至新的RNase-Free EP管中，注意不要吸到白色沉淀。
(5)加入500μL异丙醇，上下颠倒混匀，室温静置10min。
(6)12000rpm、4℃的状态下离心10min，弃上清，加入1mL用DEPC灭菌水配制的75％乙醇后混匀，冰上静置3-5min。
(7)12000rpm、4℃的状态下5min，弃上清溶液，将多余液体吸出，注意不吸到RNA沉淀，在超净台开盖，室温下干燥3-5min。
(8)根据RNase-Free EP管中RNA沉淀的量，用50μL左右的DEPC灭菌水溶解沉淀的RNA。
(9)测量溶解后的RNA浓度，若OD 260/280值大于1.8且小于2.0，证明提取的RNA质量合格，可以进行后续实验。
(10)凝胶电泳进一步检测提取的RNA质量，170V的电压下20min，结束后将核酸胶放入成像系统，若电泳图像为3条带，且28S条带最亮，18S条带稍暗，5S条带最暗，证明提取的RNA质量合格，可以进行后续实验；
(11)RNA保存在-80℃低温冰箱。
1.3 cDNA的合成
cDNA的合成使用逆转录
Figure BDA0003236283340000053
qPCR RT Kit(TOYOBO)试剂盒，按照说明书操作如下：
(1)取1μg RNA于PCR管中，65℃水浴变性5min，冰浴5min；
(2)按下表配制反转录体系：
表1 RNA反转录体系
反应成分 体积
RNA XμL(1μg)
5×RT Buffer 4.0μL
Enzyme Mix 1.0μL
Primer Mix 1.0μL
Nuclease-Free Water 14.0-XμL
Total Volume 20.0μL
(3)反应程序：37℃，25min；98℃，5min；4℃，无限；
(4)合成的cDNA于-80℃保存备用。
1.4目的基因获取
(1)目的基因的扩增：设计目的基因扩增引物，采用
Figure BDA0003236283340000061
(TAKARA)
如下表体系进行扩增：
表2 mstn扩增体系
反应成分 体积
cDNA 1μL
LATaq 0.25μL
10×LAPCR Buffer 2μL
dNTP Mix 2μL
Sense Primer 1μL
Anti-sense Primer 1μL
ddH2O 12.75μL
Total Volume 20μL
(2)反应程序：94℃3min；35cycles：94℃30s；55℃1min；72℃10min，4℃无限。
(3)目的基因的分离、回收和纯化：将(2)中全部反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，将琼脂糖凝胶放入凝胶成像仪中，若条带唯一并且大小与目的基因大小相符，则在紫外灯下将目的条带切下通过DNA凝胶回收试剂盒(TaKaRa)按如下步骤进行切胶回收：
①切下目的条带置于RNase-Free EP管中，根据胶块质量加入适量Buffer GM，室温下溶解；
②将Spin Column置于Collection Tube上，将上述液体转移至Spin Column中，12000rpm、室温的状态下离心1min，弃滤液；
③往Spin Column中加入700μL Buffer WB，12000rpm、室温的状态下离心1min，弃滤液(确认Buffer WB中已经加入确定体积的无水乙醇)；
④重复③；
⑤12000rpm、室温的状态下离心1min；
⑥将Spin Column置于新的RNase-Free EP管中，开盖静置3-5min；
⑦向Spin Column中加入20μL左右55℃预热的Elution buffer，常温静置10min后12000rpm、室温的状态下离心1min；
⑧洗脱的目的片段于-80℃保存备用。
1.5酶切与片段回收
(1)双酶切：采用TAKARAKpn I和Bamh I酶按如下体系在37℃分别对目的片段和载体进行双酶切：
表3 mstn和载体双酶切体系
反应成分 体积
Kpn 1.0μL
Bamh I 1.0μL
基因/质粒 ≤2.0μg
10×buffer 2μL
ddH<sub>2</sub>O up to 20.0μL
Total Volume 20.0μL
(2)片段回收使用DNA片段纯化试剂盒(TaKaRa)，按照说明书操作如下：
①向PCR反应液(或其它酶促反应液)中加入3V的Buffer DC(如果需加入的BufferDC量不足100μL时应加入100μL)，然后均匀混合；
②将试剂盒中的Spin Column安置于Collection Tube上；
③将上述操作①的溶液转移至Spin Column中，12000rpm、室温的状态下离心1min，弃滤液；
④将700μL的Buffer WB加入Spin Column中，12000rpm、室温的状态下离心30s，弃滤液；
⑤重复操作步骤④；
⑥将Spin Column安置于Collection Tube上，12000rpm、室温的状态下离心1min；
⑦取新的1.5mL的离心管并将Spin Column安置于上，在Spin Column膜的中央处加入30μL左右的Elution Buffer，室温静置1min(注：将Elution Buffer加热至60℃使用)；
⑧12000rpm、室温的状态下离心1min洗脱DNA。
1.6连接反应
通过T4 DNA连接酶连接将上述载体片段和目的基因片段，连接体系按照T4
DNA连接酶说明书进行，如下表配制反应体系并在16℃连接8h：
表4 mstn和载体连接反应体系
Figure BDA0003236283340000081
Figure BDA0003236283340000091
1.7转化
(1)将DH5α感受态细胞从-80℃超低温冰箱中取出，置于冰上溶解后将上述10μL连接产物全部加入，用移液枪吹打几次；
(2)冰上孵育45min左右，然后转移至42℃水浴锅热激90s后立即停止取出，冰上静置10min；
(3)加入不含抗性的LB液体培养基400μL，在37℃，200rpm的摇床振荡培养60min(进行此步时将超净台紫外打开，将含有抗性的平板在生化箱预热)；
(4)4000rpm，离心5min后取出，弃掉上层液体，留下100μL左右液体，用移液枪吹打均匀；
(5)将上述100μL液体均匀滴到含有抗性的平板上，用涂布棒将液体涂抹分散，涂布棒在使用前必须高温灭菌，并待温度低至室温方可使用，此过程全部在超净台中操作；
(6)将平板置于37℃生化培养箱，正面放置1h，然后倒置过夜；
(7)挑选平板上的单个白色菌落，加入装有含抗性的1mL LB液体培养基的EP管中，用移液枪吹打数次，在200rpm，37℃条件下震荡培养。
(8)3-4h后，取上述培养菌液进行PCR验证，反应体系如下：
表5 菌液验证反应体系
Figure BDA0003236283340000092
Figure BDA0003236283340000101
(9)反应程序：94℃3min；35cycles：94℃30s；55℃1min；72℃10min，4℃无限。
(10)将上述反应产物进行核酸凝胶电泳，挑选电泳结果为阳性的菌液送至广州擎科生物技术有限公司测序。
1.8去内毒素质粒的提取
去内毒素质粒提取使用
Figure BDA0003236283340000102
Endo-Free Plasmid Mini Kit II(Omega)试剂盒，按照说明书操作如下：
(1)转化后，将通过菌液验证与测序确认的阳性菌接种到50mL含有相应抗性的LB液体培养基中，于37℃，200rpm摇床过夜培养；
(2)将过夜培养的菌液4000g离心10min，弃上清；
(3)加入500μL SolutionⅠ，用枪头轻轻吹打重悬菌体；
(4)转移重悬菌液至2mL离心管中，加入500μL SolutionⅡ，缓慢颠倒充分混匀至菌液澄清，室温静置2min；
(5)加入250μL预冷的N3Buffer，缓慢地上下颠倒，直至完全形成白色絮状物，13000g离心10min，留上清；
(6)转移上清液至1.5mL离心管中，加入0.1V的ETR Solution，上下颠倒混匀，冰浴10min，期间每2min上下颠倒混匀一次；
(7)将上述混合物于42℃水浴5min，13000g离心3min，此时ETR Solution沉淀于底部；
(8)吸出转移上层液体至新的2mL离心管中，加入0.5V的无水乙醇，缓慢地上下颠倒混匀，室温静置1min；
(9)每700μL转移上述混合物至置于2mL Collection Tube的HiBind DNA MiniColumn中，13000g离心1min，直至将混合物全部转移；
(10)加入700μL DNAWash Buffer，13000g离心1min，弃滤液；
(11)重复步骤(10)，13000g空转3min；
(12)将HiBind DNA Mini Column置于新的1.5mL离心管中，加入80-100μL预热至65℃的Endotoxin-Free Elution Buffer，静置2min，13000g离心1min；
(13)取2μL质粒进行电泳检测，1μL用于测定质粒浓度，-80℃保存。
1.9细胞转染
将细胞计数后传入24孔板中(400μL/孔)，细胞浓度为1×10 6/mL，置于28℃培养箱中培养18h左右，待细胞铺满单层的70-80％后即可开始转染，按照每孔800ng质粒，2μL转染试剂LipofectamineTM 2000(Invitrogen)的标准进行转染，具体操作步骤如下：
(1)取两个无菌的1.5mL离心管，加入50μL Opti-MEM培养基，各加入2μLLipofectamine 2000试剂和800ng目的质粒，轻轻吹打混匀，室温静置5min；
(2)将上述两管溶液混合，轻轻吹打混匀，室温静置25min；
(3)吸去24孔板中的原培养基，每孔加入400μL无FBS的L15培养基；
(4)将(2)中混合液平均加入到培养板孔中，轻轻敲打四周混匀；
(5)转染6h后换成400μL含10％FBS的L15培养基继续培养。
1.10亚细胞定位
(1)在6孔板内放置6孔板圆形细胞爬片，将GS细胞传入6孔板内，置于28℃培养箱中培养18-24h；
(2)将空载质粒和重组质粒分别转染至GS细胞中；
(3)转染36h后，吸去孔中培养基，用4％多聚甲醛室温固定15min，PBS漂洗3次；
(4)加入终浓度为1μg/mL的DAPI避光染核5min，PBS漂洗3次；
(5)制片，用抗荧光淬灭封片剂(Beyotime)封片，置于荧光显微镜(Leica，Germany)下观察。
为了检测Mstn在细胞中的定位，将pEGFP-MSTN质粒转染至GS细胞中，转染pEGFP-C1质粒至GS细胞作为对照。利用荧光显微镜进行观察，发现pEGFP-MSTN过表达细胞的细胞质中都观察到了呈点状分布的绿色荧光(图1)。这表明Mstn在GS细胞中呈细胞质分布，Mstn蛋白在细胞质中表达。
实施例二Mstn重组蛋白对mstn信号通路下游及相关基因的影响研究
2.1肌肉细胞的原代培养
(1)剪刀、镊子、刀片等用75％酒精擦拭后全部高压灭菌，所有的实验用具紫外灭菌30min；
(2)用75％的酒精擦拭鱼体表，用刀片切出长方形，将皮肤撕掉，去掉上层肌肉；
(3)取肌肉置于培养皿，用加10％双抗的L15培养液清洗三次；
(4)第三次清洗时将组织剪成1mm 3左右的组织块，吸掉培养液，再次清洗一次；
(5)将组织块按照一定间距转入培养瓶内，共放20-30块；
(6)轻轻将培养瓶翻转过来，注意翻瓶时勿令组织小块流动，塞好瓶塞置28℃温箱培养7-8h左右，使小块微干涸；
(7)从微箱中取出培养瓶，往组织块上滴加含4％双抗和20％血清的培养液，大约共2mL；
(8)仔细观察，待细胞从组织块游出后，再补加培养液至5mL；
(9)将培养液吸到一个干净5mL离心管中，用1mL胰酶润洗，后用1mL胰酶将细胞及肌肉块全部消化下来，用干净枪头将肌肉块去掉，1mL消化液离心，去掉液体留细胞；
(10)用2.5mL 5mL离心管中的培养液将细胞吹匀，转至培养瓶中，补充含1％双抗和20％血清的培养液至5mL；
(11)定期在显微镜下观察细胞生长情况，待培养瓶中细胞铺满一层后，用胰酶消化，用含1％双抗和10％-20％血清的培养液进行半换液培养。
2.2Mstn重组蛋白孵育肌肉原代细胞
将Mstn重组蛋白用无菌PBS溶解，稀释成3个不同浓度用于原代细胞的刺激。
在该实验中，仅添加PBS为刺激物的原代细胞作为对照组，每组4个重复。
实验方案如下:
表6 刺激液浓度
编号 处理试剂
1 PBS
2 Mstn(10nM)
3 Mstn(100nM)
4 Mstn(1000nM)
2.3肌肉原代细胞RNA提取
肌肉原代细胞RNA的提取使用SV Total RNAIsolation System(Promega)试剂盒，按照说明书操作如下：
(1)吸掉培养液，用无菌PBS溶液洗涤细胞，然后加入正好能盖住单层细胞的胰酶溶液，轻轻晃动器皿使胰酶均匀分布在细胞层上，直到细胞松动；
(2)一旦细胞松动，尽快弃去胰酶溶液，加入PBS溶液，用移液枪吹下贴壁的细胞；
(3)将细胞连同PBS溶液一起收集到无核酸酶的EP管中，1500rpm、离心5min，弃上清，收集沉淀细胞；
(4)按起始用量加入RNA裂解液，用移液枪吸放打散沉淀、混匀；
(5)按样品量及RNA裂解液用量加入RNA稀释液，用移液枪混匀，70℃加热3min；
(6)12000rpm、室温状态下离心5min；
(7)加入V/2上清体积的无水乙醇，用移液枪吹打混匀；
(8)取出离心柱/收集管，将混合物转移至离心柱中，14000g、室温状态下离心1min，弃滤液；
(9)根据下表准备DNA酶I孵育液，以下是提取一管RNA需要的用量：
表7 DNA酶I孵育液
试剂 体积
10×DNA酶I缓冲液 5.0μL
DNA酶 5.0μL
无核酸酶水 40.0μL
Total Volume 50.0μL
(10)加入50μL DNA酶I孵育液到吸附膜中央，室温放置15min；
(11)加入600μL RNA洗液，14000g、室温状态下离心45s，弃滤液；
(12)重复(11)，然后14000g、室温状态下空转2min；
(13)将离心柱转移至洗脱管上，在离心柱膜中央加入50μL无核酸酶水，室温静置2min，14000g、室温状态下离心1min，将RNA保存在-80℃低温冰箱。
2.4 cDNA的合成
同实施例一中的cDNA的合成步骤。
2.5实时荧光定量PCR
(1)RT-qPCR使用
Figure BDA0003236283340000152
Green Realtime PCR Master Mix(TOYOBO)试剂盒，按照说明书操作如下表：
表8 荧光定量PCR体系
Figure BDA0003236283340000151
(2)反应程序：Applied Biosystems QuantStudio 5 Real-Time PCR System(ThermoFish，USA)，按照上表所示反应体系，向384孔板中避光加入各试剂后混匀，离心15-20s，接下来在Thermo Fisher QuanStudio 5实时荧光定量PCR仪器开始PCR反应，反应程序设置为第一步：95℃，10min；第二步：95℃，15s；第三步：55℃，15s；第四步：72℃，20s(第二步至第四步循环40次)。
为了检测mstn对肌肉原代细胞分化的影响，本实施例中设计了斜带石斑鱼myod、myog、smad3、mrf4、p21等增殖分化相关的定量引物，在用不同浓度的Mstn重组蛋白处理后，通过RT-qPCR来测定这些基因的表达。结果如图2-6所示，与对照组相比，p21mRNA的表达随着处理浓度的升高而上升，当处理浓度为100nM和1000nM时存在显著性差异；smad3 mRNA和mrf4 mRNA的表达均随着处理浓度的升高而上升，但趋势并不明显，始终不存在显著性差异；myod mRNA和myog mRNA的表达均随着处理浓度的升高而下降，但myod mRNA下降趋势并不显著，myog mRNA则有着明显的下降，在处理浓度为100nM和1000nM时存在显著性差异。
实施例三Mstn重组蛋白对肌肉细胞增殖的影响研究
3.1肌肉细胞的原代培养
同实施例二中的肌肉细胞原代培养方法。
3.2 Mstn重组蛋白孵育肌肉原代细胞
在五个96孔板中(100μL/孔)接种细胞悬液，24h后用1000nM Mstn蛋白处理，对照组用相同体积的PBS处理，空白组不做处理，每组8个重复；
在6孔板(1.6mL/孔)接种细胞悬液，24h后用1000nM Mstn蛋白处理，对照组用相同体积的PBS处理，每组3个重复。
3.3 CCK-8法检测细胞增殖
(1)Mstn重组蛋白处理1d、2d、3d、4d、5d后，将96孔板中的培养基换成新鲜培养基；
(2)每孔加入10μL CCK-8溶液，在细胞培养箱内继续孵育4h；
(3)在酶标仪上测定在450nm处的吸光值，记录并保存。
3.4流式细胞仪检测细胞周期
(1)细胞样品的准备：
①用胰酶(无EDTA)消化细胞，至细胞可以被轻轻用吹打下来时，加入前面收集的细胞培养液，吹打下所有的贴壁细胞，并轻轻吹散细胞；
②将细胞悬液收集到10mL的离心管内。800g左右离心5min，沉淀细胞。小心吸除上清，残留约50μL左右的培养液，以避免吸走细胞；
③加入1mL冰浴预冷的PBS，重悬细胞，800g左右离心5min，为减少细胞损失可用1.5mL离心；
④再次加入1mL冰浴预冷的PBS，重悬细胞，离心沉淀细胞，小心吸除上清，残留约20μL左右的PBS，以避免吸走细胞；
⑤轻轻弹击离心管底以适当分散细胞，避免细胞成团，用250μL预冷的PBS重悬细胞。
(2)细胞固定：缓慢加入750μL冰浴预冷无水乙醇，轻轻吹打混匀，4℃固定2h或-20℃固定1h，封口膜封口(此步可停止，-20℃保存样品，1周内样品检测不受影响)。
(3)染色：
①1000g左右离心3-5min，沉淀细胞。小心吸除上清，可以残留约50μL左右的70％乙醇，以避免吸走细胞；
③加入约1mL冰浴预冷的PBS，洗涤细胞一次。再次离心沉淀细胞，小心吸除上清；
④用200μL预冷的PBS重悬细胞；
⑤加入Rnase A溶液20μL，37℃水浴30min；
⑥每管细胞样品中加入PI染色液至浓度为50μL/mL，缓慢并充分混匀后4℃避光孵育30min，染色完成后在24h内完成流式检测。
为了检测mstn对肌肉细胞增殖的影响，本研究Mstn重组蛋白分别刺激肌肉原代细胞1d、2d、3d、4d、5d，通过用酶标仪测定肌肉原代细胞每天的OD值，再绘制细胞生长曲线。研究发现，用Mstn重组蛋白处理的实验组细胞生长明显减缓，第一天时，对照组和实验组细胞的活性差异就达到了显著性水平，并且随着处理时间的增加，细胞活性差异进一步扩大(图7)。同时，在用Mstn重组蛋白刺激肌肉原代细胞24h后，收集6孔板中的细胞制作细胞悬液，固定后染色，用流式细胞仪对处理后的样品进行检测。结果表明，与对照组相比(图8)，Mstn重组蛋白处理后的细胞在S期受阻，细胞周期受阻(图9)。
以上依据本发明的理想实施例为启示，通过上述的说明内容，相关人员完全可以在不偏离本项发明技术思想的范围内，进行多样的变更以及修改。本项发明的技术性范围并不局限于说明书上的内容，必须要根据权利要求范围来确定技术性范围。

Claims (7)

1.一种mstn重组蛋白在斜带石斑鱼筛选中的应用，其特征在于，包括：
S1斜带石斑鱼Mstn亚细胞定位分析；
S2 Mstn重组蛋白对mstn信号通路下游及相关基因的影响分析；
S3 Mstn重组蛋白对肌肉细胞增殖的影响分析；
其中：S1包括以下步骤：
S101鱼体组织样品采集；
S102将提取后的RNA保存在低温冰箱中备用；
S103按照设计的反转录体系，合成的cDNA于-80℃保存备用；
S104设计目的基因扩增引物，进行反应后，再将目的基因分离、回收、纯化后获得目的基因；
S105对目的片段和载体进行双酶切，然后进行片段回收；
S106通过T4 DNA连接酶连接将载体片段和目的基因片段进行连接，然后进行转化和测序；
S107使用试剂盒对去内毒素质粒进行提取，获得质粒，并且对质粒进行电泳检测；
S108将细胞计数后传入24孔板中，细胞浓度为1×106/mL，置于28℃培养箱中培养18h，待细胞铺满单层的70-80％后即可开始转染，按照每孔800ng质粒，2μL转染试剂的标准进行转染；
S109亚细胞定位；
S2包括以下步骤：
S201培养肌肉原代细胞；
S202用Mstn重组蛋白孵育肌肉原代细胞；
S203肌肉原代细胞RNA提取；
S204 cDNA合成；
S205实时荧光定量PCR；
S3包括以下步骤：
S301培养肌肉原代细胞；
S302用Mstn重组蛋白孵育肌肉原代细胞；
S303用CCK-8法检测细胞增殖状态；
S304用流式细胞仪检测细胞周期。
2.根据权利要求1中所述的mstn重组蛋白在斜带石斑鱼筛选中的应用，其特征在于，S1中，通过构建含mstn的目的质粒，将目的质粒与空载转染到GS细胞中发现，绿色荧光在细胞质中呈点状分布。
3.根据权利要求1中所述的mstn重组蛋白在斜带石斑鱼筛选中的应用，其特征在于，S2中，用Mstn重组蛋白对斜带石斑鱼的肌肉原代细胞进行刺激后，通过实时荧光定量检测仪检测Mstn重组蛋白对mstn信号通路及下游相关基因具有影响。
4.根据权利要求3中所述的mstn重组蛋白在斜带石斑鱼筛选中的应用，其特征在于，mstn信号通路包括p21、smad3、mrf4、myod、myog。
5.根据权利要求1中所述的mstn重组蛋白在斜带石斑鱼筛选中的应用，其特征在于，S303中用浓度为1000nM的Mstn重组蛋白分别刺激肌肉原代细胞5d，通过酶标仪测定肌肉原代细胞每天的OD值来研究Mstn对肌肉细胞增殖的影响。
6.根据权利要求5中所述的mstn重组蛋白在斜带石斑鱼筛选中的应用，其特征在于，在培养的五天内，用Mstn重组蛋白处理的实验组细胞生长明显减缓，对照组和实验组细胞的活性差异在第一天就达到了显著性水平，并且随着处理时间的增加，细胞活性差异进一步扩大。
7.根据权利要求1中所述的mstn重组蛋白在斜带石斑鱼筛选中的应用，其特征在于，S304中通过流式细胞仪检测细胞周期，结果发现用Mstn重组蛋白处理过后的细胞在S期受阻，细胞周期受阻，Mstn重组蛋白抑制斜带石斑鱼肌肉细胞的增殖。
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