CN117100774B

CN117100774B - 嗜酸乳杆菌jyla-16在制备治疗胆结石的产品中的应用

Info

Publication number: CN117100774B
Application number: CN202311387927.0A
Authority: CN
Inventors: 汤文利; 杨志昆; 宋祥彬; 王丽媛; 邓爱欣; 李万君; 于江
Original assignee: Shandong Feed Veterinary Drug Quality Inspection Center; Shandong Zhongke Jiayi Bio Engineering Co ltd
Current assignee: Shandong Feed Veterinary Drug Quality Inspection Center; Shandong Zhongke Jiayi Bio Engineering Co ltd
Priority date: 2023-10-25
Filing date: 2023-10-25
Publication date: 2024-02-13
Anticipated expiration: 2043-10-25
Also published as: CN117100774A

Abstract

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种嗜酸乳杆菌JYLA‑16在制备治疗胆结石的产品中的应用，嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）JYLA‑16于2020年3月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.19501，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号；治疗胆结石的产品包括嗜酸乳杆菌JYLA‑16的菌粉。实验证明，服用2周嗜酸乳杆菌JYLA‑16菌剂，有效减少了小鼠胆囊内胆固醇结晶数量、降低小鼠胆汁中胆固醇含量、增加胆汁酸分泌，有效调节肠道菌群平衡，显著改善小鼠体内与胆结石相关基因的表达水平，对于胆结石疾病有良好的治疗效果。

Description

嗜酸乳杆菌JYLA-16在制备治疗胆结石的产品中的应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种嗜酸乳杆菌JYLA-16在制备治疗胆结石的产品中的应用。

背景技术

胆结石（gallstones）是在胆囊内由胆汁化合物组成的结石，也指因胆囊内的结石所引起的疾病，按发病部位可分为胆囊结石和胆管结石。按化学成分可分为两大类，即胆固醇类结石和胆色素类结石。其中胆固醇类结石以胆固醇为主要成分，包括纯胆固醇结石（胆固醇含量>90%）和胆固醇混合性结石（胆固醇含量>60%）。目前去除胆固醇类结石的治疗方法包括西药治疗、手术治疗和中药治疗。西药治疗主要通过口服熊去氧胆酸胶囊药物去除胆囊胆固醇结石，但是要求必须是X射线能穿透的结石，同时胆囊收缩功能须正常，治疗效果较差，难以去除。手术治疗以胆囊切除术、体外冲击波碎石术为主，但是容易复发，还伴有很多并发症。

传统的中药可以调节啮齿类动物体内的胆固醇水平并减轻实验性胆结石的形成，例如专利CN112516213B公开了一种治疗胆结石的瑶药组合物，包括以下原料：钻地风、石板蕨、水浸风、九层风、金沙藤、金钱草、山栀根、车前草、白纸扇、石韦和枳壳。由其实施例可知，患者经过上述瑶药组合物治疗后，胆结石治疗有效率达69.40%，患者的胆囊情况和胆汁代谢均得到有效改善。但是中药成分较复杂，有一定的副作用。随着益生菌相关研究及应用越来越广泛，发现益生菌具有减少胆结石风险的潜力。首先，益生菌可以抑制胆道内一些有害菌的生长，防止胆道内的细菌感染，从而减少胆结石的几率。其次，益生菌可以促进肠道蠕动，减少胆酸在肠道中的吸收，降低胆固醇浓度。但是目前益生菌在预防或治疗胆结石方面的应用还没有得到深入的研究，筛选、开发对胆结石具有治疗效果的菌株具有巨大的应用价值。

发明内容

针对现有的胆结石治疗手段效果不佳或副作用大的技术问题，本发明提供一种嗜酸乳杆菌JYLA-16在制备治疗胆结石的产品中的应用，嗜酸乳杆菌JYLA-16对于胆结石具有较好的治疗效果，并且调节肠道微生物菌群平衡，加速胆结石患者的恢复，而且避免了使用西药或中药造成的负面影响。

具体技术方案如下：

一种嗜酸乳杆菌JYLA-16在制备治疗胆结石的产品中的应用，嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）JYLA-16于2020年3月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.19501，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号；治疗胆结石的产品包括嗜酸乳杆菌JYLA-16的菌粉。

进一步的，治疗胆结石的产品为降低胆汁中胆固醇含量、增加胆汁酸的产品。

进一步的，治疗胆结石的产品为调节肠道微生态、改善肝胆管侧壁细胞蛋白表达水平的产品。

进一步的，治疗胆结石的产品还包括葡萄糖。

进一步的，治疗胆结石的产品中嗜酸乳杆菌JYLA-16菌体数量为1.0×10⁸~2.0×10⁸CFU/g。

进一步的，嗜酸乳杆菌JYLA-16的菌粉的制备方法具体包括以下步骤：

（1）制备MRS液体培养基和MRS平板培养基；

（2）取保存的嗜酸乳杆菌JYLA-16在MRS平板培养基上活化，将活化后菌接种于MRS液体培养基中进行有氧培养，获得菌液；

（3）将菌液离心后，收集菌体，使用无菌生理盐水洗涤后，重悬于复原脱脂乳中，获得悬浊液；调整悬浊液浓度，获得菌悬液，将菌悬液冷冻干燥后，获得菌粉。

进一步的，步骤（1）中，制备MRS液体培养基的方法为：将蛋白胨10g、牛肉粉5g、三水醋酸钠5g、七水磷酸氢二钾2g、吐温80 1mL、四水硫酸锰0.05g、柠檬酸三铵2g、葡萄糖20g、七水硫酸镁0.2g、蒸馏水1000mL混合后，用HCl调pH至6.8，搅拌混匀后，在121℃、0.1MPa下灭菌20min。

进一步的，步骤（2）中，活化后菌接种于MRS液体培养基的接种量为1%~2%。

进一步的，步骤（2）中，培养温度为40~42℃，培养时间为48~60h。

进一步的，步骤（3）中，调整悬浊液浓度为1.0×10¹⁰~2.0×10¹⁰cfu/mL。

本发明的有益效果在于：

本发明提供的嗜酸乳杆菌JYLA-16在制备治疗胆结石的产品中的应用，嗜酸乳杆菌JYLA-16有助于减少小鼠胆囊内胆固醇结晶数量、降低小鼠胆汁中胆固醇含量、增加胆汁酸分泌，并能有效改善肠道菌群，减少胆结石小鼠肠道内变形菌门的数量，增加胆结石小鼠肠道内柔嫩梭菌属、毛螺菌属、罗氏菌属的数量，提高小鼠肠道菌群的丰富度和多样性，促进小鼠形成稳健的肠道微生态。经检测，服用嗜酸乳杆菌JYLA-16菌剂2周后，胆结石小鼠肝胆管侧壁细胞转运蛋白BSEP、NTCP、CYP7A1、CYP8B1的蛋白表达量显著增加，SHP、LRH-1的蛋白表达量显著减少，证明嗜酸乳杆菌JYLA-16可以有效改善胆结石小鼠体内与胆结石相关的基因的表达水平，对胆结石疾病有良好的治疗效果，在制备治疗胆结石的产品方面具有重要价值。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明中的技术方案，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

实施例1 菌种的分离鉴定

1、菌株筛选及纯化

（1）菌株来源：2019年6月于陕西省咸阳市采集当地居民自制泡菜，放入样品转运箱中带回实验室备用。

（2）制备样品：

①取灭菌后的生理盐水（0.85%）至于无菌三角瓶中，然后将步骤（1）采集的样品1g加入其中，振荡，待用；

②对步骤①的溶液稀释制成不同浓度梯度的样品，分别为10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7，标号分别为1#、2#、3#、4#、5#、6#、7#，待用。

（3）制备MRS平板培养基：

蛋白胨10g、牛肉粉 5g、三水醋酸钠5g、七水磷酸氢二钾2g、吐温80 1mL、四水硫酸锰0.05g、柠檬酸三铵2g、葡萄糖20g、七水硫酸镁0.2g、琼脂15g、蒸馏水1000mL；将上述原料混合后，自然pH，搅拌菌液后，在121℃、0.1MPa下灭菌20min，将灭菌后的培养基倒入平皿中，放凉后待用。

（4）培养菌株：将1#、2#、3#、4#、5#、6#、7#号溶液分别使用涂布器涂布在MRS平板培养基中，于37℃、厌氧条件下培养48h；

（5）按照以下菌落特征挑选菌落：

直径1~2mm，在培养基上菌落不透明，边缘不完整，乳黄色，有光泽，质地柔软。

（6）分离纯化

根据步骤（5）的菌落和生化特征挑取5个单菌落，采用划线法接种至MRS平板培养基上纯化，于42℃、厌氧条件下培养48h，挑取单菌落，置于甘油管中-70℃保藏。

2、鉴定

将分离纯化后得到的单菌落送去鉴定，鉴定单位：中国工业微生物菌种保藏管理中心，鉴定过程中，使用的引物如下：

引物序列：

27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'

1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'

鉴定过程中得到的菌株的基因序列为：

TGTTTGATCCTGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAGCGAGCTGAACCAACAGATTCACTTCGGTGATGACGTTGGGAACGCGAGCGGCGGATGGGTGAGTAACACGTGGGGAACCTGCCCCATAGTCTGGGATACCACTTGGAAACAGGTGCTAATACCGGATAAGAAAGCAGATCGCATGATCAGCTTATAAAAGGCGGCGTAAGCTGTCGCTATGGGATGGCCCCGCGGTGCATTAGCTAGTTGGTAGGGTAACGGCCTACCAAGGCAATGATGCATAGCCGAGTTGAGAGACTGATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGAAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTGGTGAAGAAGGATAGAGGTAGTAACTGGCCTTTATTTGACGGTAATCAACCAGAAAGTCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGAAGAATAAGTCTGATGTGAAAGCCCTCGGCTTAACCGAGGAACTGCATCGGAAACTGTTTTTCTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGGAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCTCTGGTCTGCAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCATGGGTAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTGGGAGGTTTCCGCCTCTCAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCTAGTGCAATCCGTAGAGATACGGAGTTCCCTTCGGGGACACTAAGACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCATTAGTTGCCAGCATTAAGTTGGGCACTCTAATGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGTACAACGAGGAGCAAGCCTGCGAAGGCAAGCGAATCTCTTAAAGCTGTTCTCAGTTCGGACTGCAGTCTGCAACTCGACTGCACGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCACGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTCTGCAATGCCCAAAGCCGGTGGCCTAACCTTCGGGAAGGAGCCGTCTAAGGCAGGGCAGATGACTGGGGTGAAGTCGTAACAAAGGTAACC

鉴定结果为：该菌株被鉴定为乳杆菌属（Lactobacillus），推测为嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）。

将鉴定后的菌株命名为嗜酸乳杆菌JYLA-16，送至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏信息如下；

分类命名：嗜酸乳杆菌Lactobacillus acidophilus，保藏日期：2020年3月20日，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，保藏编号：CGMCC No.19501。

实施例2 制备嗜酸乳杆菌JYLA-16菌剂

（1）制备MRS液体培养基和MRS平板培养基：将蛋白胨10g、牛肉粉5g、三水醋酸钠5g、七水磷酸氢二钾2g、吐温80 1mL、四水硫酸锰0.05g、柠檬酸三铵2g、葡萄糖20g、七水硫酸镁0.2g、蒸馏水1000mL混合后，调pH为6.8，在121℃、0.1MPa下灭菌20min，制得MRS液体培养基；在制得的MRS液体培养基中添加15g/L的琼脂，放凉后即得MRS平板培养基。

（2）取保藏的嗜酸乳杆菌JYLA-16在MRS平板培养基上活化，将活化后的菌按照1%的接种量接种于MRS液体培养基中，在42℃条件下有氧培养48h，获得菌液。

（3）将菌液离心后，收集菌体，使用无菌生理盐水洗涤后，重悬于15%（w/w）的复原脱脂乳中，获得悬浊液；调整悬浊液的浓度为2.0×10¹⁰cfu/mL，获得菌悬液，将菌悬液冷冻干燥后，获得嗜酸乳杆菌JYLA-16菌粉。

（4）将嗜酸乳杆菌JYLA-16菌粉与葡萄糖（购自保龄宝生物股份有限公司）混合，制成嗜酸乳杆菌JYLA-16菌剂，制备的菌剂中菌体数量为2.0×10⁸CFU/g。

实施例3 制备嗜酸乳杆菌JYLA-16菌剂

与实施例2的不同之处在于：

步骤（2）中，将活化后的菌按照2%的接种量接种于MRS液体培养基中，在40℃条件下有氧培养60h，获得菌液；

步骤（3）中，调整悬浊液的浓度为1.0×10¹⁰cfu/mL；

步骤（4）中，制备的菌剂中菌体数量为1.0×10⁸CFU/g；

其它处理同实施例2。

实施例4 嗜酸乳杆菌JYLA-16对胆结石小鼠胆汁中胆固醇结晶的影响

（1）实验动物：

100只健康8周龄左右SPF级C57BL/6雄性小鼠，体重为（18±2）g，购自长沙市天勤生物技术有限公司，动物许可证号：SCXKD（湘）2014-0011。饲养的SPF级实验室环境的湿度60%±10%，动物房里面的气温处于（25±2）℃之间，室内空气流通保持良好，卫生消毒条件均达标。

（2）实验方法：

将上述100只健康SPF级雄性小鼠先适应性喂养一周，随机均分为2组：对照组30只、模型组70只。适应性喂养一周后，对照组饲喂正常饲料；模型组给予致石饲料（包含15%脂肪、1.5%胆固醇、0.5%胆酸）喂养以建立C57BL/6小鼠胆结石模型，喂养八周。八周后，处死10只模型组小鼠，解剖摘出胆囊收集胆汁于玻璃试管中，观察颜色，抽取部分胆汁标本放玻璃片上作涂片，放在偏振光显微镜下观察，发现大量胆固醇晶体颗粒满布视野，表明造模成功。

将模型组剩余的60只小鼠重新分组，随机分为2组，每组30只，分别为胆结石模型组和试验组。胆结石模型组饲喂正常饲料；试验组在饲喂正常饲料的基础上，额外饲喂实施例2制备的嗜酸乳杆菌JYLA-16菌剂，每只小鼠饲喂量为600万cfu/天。按照上述处理喂养2周。对照组一直饲喂正常饲料。

收集粪便：饲喂2周结束的前一天，收集小鼠的新鲜粪便约10g置于无菌容器内，迅速置于-80℃冰箱中超低温保存，用于后续高通量测序分析。

收集胆汁和肝脏：饲喂2周结束后，将对照组、胆结石模型组和试验组的小鼠全部饥饿过夜。用乙醚麻醉小鼠后固定在解剖台上，用剃毛器剃去腹部皮毛，后用酒精棉球消毒，沿腹部正中线依次剪开皮肤、皮下筋膜、腹膜，使胆囊充分暴露，先肉眼观察胆囊的色泽、大小及胆囊结石形成情况。用镊子小心将胆囊从胆囊床上剥离，夹闭胆囊管并移除胆囊于PCR管中，用眼科剪剪开胆囊，溢出的胆汁收集于PCR管中，将收集到的胆汁置于-20℃保存并标记待测。然后取小鼠肝脏组织存放于-80℃冰箱，用于后续检测。

取每只小鼠的胆囊胆汁1滴，分别制成涂片。涂片的制作方法如下：将载玻片一端放置1滴胆汁，将一块边缘光滑的推片置于胆汁滴的前方，慢慢向后移动到移向胆汁接触胆汁液，使胆汁液均匀分散到推片与载片的接触处。然后将推片与载片的夹角保持30°~40°，向另一端平稳均匀的推动推片，载玻片上便留下一层薄胆汁膜。胆汁涂片推好后，迅速在空气中摇动，使其自然干燥，以免胆囊细胞变形。胆汁膜干燥后，用铅笔在胆汁膜的一侧写上编号，在偏振光显微镜下观察小鼠胆汁中胆固醇结晶状况。

结合肉眼观察和显微镜观察，采用6级判断标准对小鼠胆囊内成石情况进行判定。6级判断标准具体如下：

0级：胆囊中充满清澈的胆汁，无胆固醇结晶；

1级：存在1~10个结晶；

2级：存在11~20个结晶；

3级：存在21~50个结晶；

4级：结晶占一半以上；

5级：肉眼发现胆囊中有圆形的结石。

最终得到的各组小鼠的胆固醇结晶状况如表1所示。

表1 不同胆固醇结晶程度分布的小鼠数量（单位：只）

由表1可知，试验组小鼠的胆固醇结晶程度要远低于胆结石模型组小鼠，胆结石模型组小鼠的胆固醇结晶程度达到5级的有17只，而试验组小鼠胆固醇结晶程度均在2级及以下，由此可知，嗜酸乳杆菌JYLA-16能显著降低小鼠胆固醇结晶程度，对胆结石有一定治疗作用。

实施例5 嗜酸乳杆菌JYLA-16对小鼠胆汁中胆固醇、磷脂和胆汁酸水平的影响

取出-20℃保存的胆汁样本，进行打碎、解冻后，用于胆固醇、磷脂和总胆汁酸的测定。

胆固醇测定：使用酶法总胆固醇测定试剂盒（购自上海科艾博生物技术有限公司），根据其说明书进行操作，采用3000系列半自动生化分析仪测定胆汁胆固醇。

磷脂测定：使用酶显色法磷脂测定试剂盒（购自上海科艾博生物技术有限公司），根据其说明书进行操作，采用3000系列半自动生化分析仪测定胆汁磷脂。

总胆汁酸测定：使用总胆汁酸测定试剂盒（购自南京建成生物技术有限公司），根据其说明书进行操作，采用3000系列半自动生化分析仪测定胆汁总胆汁酸。

上述三项测定的结果见表2。

表2 小鼠胆囊胆汁中脂类组分含量比较

由表2可知，与胆结石模型组相比，服用2周嗜酸乳杆菌JYLA-16菌剂的试验组小鼠的胆囊胆汁的胆固醇含量和磷脂含量降低，胆汁酸有所增加，说明嗜酸乳杆菌JYLA-16能有效降低小鼠胆囊胆汁中胆固醇含量，有助于治疗胆结石。

实施例6 嗜酸乳杆菌JYLA-16对小鼠肠道菌群的影响

将保存的小鼠粪便取出，提取粪便中的DNA，送至上海美吉生物医药科技有限公司进行16S rDNA测序，以检测肠道菌群的结构和组分。根据其出具的检验报告，采用高通量测序技术在16S rRNA基因V1-V3区域PCR扩增后进行大规模测序，获取序列数据，鉴定细菌OTU，所有鉴定的细菌OTU可被归为11个细菌门类和120个细菌属类。其中，厚壁菌门、拟杆菌门、变形菌门是相对丰度较高的3个门类。而丰度较高的细菌属类有肠球菌属、拟杆菌属、柔嫩梭菌属、毛螺菌属。

数据采用SPSS 22.0进行统计分析处理，其中计量资料使用t检验，以均值±标准差表示，计数资料采用χ^２检验，以率（%）表示，以P<0.05为差异有统计学意义。数据分析结果见表3和表4。

表3 不同处理下小鼠肠道细菌组分比较（细菌门水平，单位%）

由表3可知，胆结石模型组小鼠肠道菌群的变形菌门含量显著高于对照组，而试验组小鼠肠道菌群的变形菌门含量与对照组接近，说明嗜酸乳杆菌JYLA-16能有效减少胆结石小鼠肠道内变形菌门的数量。

表4 不同处理下小鼠肠道细菌组分比较（细菌属水平，单位%）

注：*表示与对照组对比，P＜0.01。

由表4可知，与对照组相比，胆结石模型组小鼠肠道内柔嫩梭菌属、毛螺菌属、罗氏菌属的含量显著减少（P＜0.01），这三种细菌属能对肠道产生良性刺激，在促进抗炎、刺激肠道益生菌生长等方面有积极作用。与胆结石模型组相比，试验组小鼠肠道内的柔嫩梭菌属、毛螺菌属、罗氏菌属的含量显著增加，与对照组接近。由此可知，嗜酸乳杆菌JYLA-16能增加胆结石小鼠肠道内柔嫩梭菌属、毛螺菌属、罗氏菌属的数量，提高小鼠的肠道菌群的丰富度和多样性，促进小鼠形成稳健的肠道微生态。

实施例7 嗜酸乳杆菌JYLA-16对小鼠肝胆管侧壁细胞相关基因的mRNA转录水平及蛋白表达水平的影响

本实验主要是观察各组小鼠肝胆管侧膜细胞的胆固醇7α-羟化酶（cholesterol 7alpha hydroxylase，CYP7A1）、胆固醇12α-羟化酶（sterol 12α-hydroxylase，CYP8B1）、小分子异源二聚体伴侣（small heterodimer partner，SHP）、肝脏受体同系物-1（liverreceptor homolog 1，LRH-1）、胆汁酸盐输出泵基因（bile salt export pump，BSEP）、钠离子-牛磺胆酸共转运蛋白（sodium taurocholate cotransporting polypeptide，NTCP）的mRNA转录水平及其蛋白表达变化情况。

1.实验试剂

Trizol，购自美国Invitrogen公司，货号：15596-026；HiFiScriptT快速去除基因组cDNA第一条链合成试剂盒和荧光定量试剂盒，购自北京康为试剂公司，货号：CW2582M，CW0957H；RIPA裂解液，购自北京索来宝公司，货号：R0020；Anti-CYP7A1抗体和Anti-CYP8B1抗体，购自北京BIOSS公司，货号：bs-21429R，bs-14165R；Anti-NR5A2抗体、Anti SHP-1抗体和ECL发光试剂盒，购自美国Affiffiffinity公司，货号：DF8470，AF6244，KF001；Anti-BSEP抗体和Anti-NTCP抗体，购自美国Thermo Fisher公司，货号：PA5-78690，PA5-80001；β-actin抗体、山羊抗兔的二抗，购自北京中杉金桥生物技术有限公司，货号：TA-09，ZB2301，ZB2305；BCA试剂盒（购自南京森贝伽生物科技有限公司）

2.实验内容

（1）应用RT-PCR技术检测各组小鼠肝胆管侧膜细胞相关基因的mRNA转录水平

取保存的小鼠肝脏组织0.3cm×0.3cm×0.2cm，分离小鼠肝胆管侧膜细胞，利用Trizol提取小鼠肝胆管侧膜细胞中总RNA，用1%琼脂糖凝胶完成电泳，以检测RNA的完整性。检测后使用HiFiScriptT快速去除基因组cDNA第一条链合成试剂盒完成反转录，实验操作严格按照产品说明书进行。然后分别用内参基因引物和目的基因引物进行扩增。

反应体系总体积为20μL，程序如下：反应液在95℃下预变性15min，1个循环；95℃下变性10s，58℃退火30s，在72℃延伸30s，40个循环。同时在60~90℃进行溶解曲线分析。以对照组为对照样组，用荧光定量PCR仪，采用2–△△Ct法进行数据的相对定量分析，结果见表5。

表5 各组小鼠肝胆管侧膜细胞相关基因的mRNA转录水平

注：*表示与对照组相比，P＜0.01。

由表5可知，与对照组相比，胆结石模型组小鼠肝胆管侧膜细胞内BSEP、NTCP、CYP7A1、CYP8B1基因的mRNA转录水平显著降低，而SHP、LRH-1的mRNA转录水平显著升高，提示了这些基因mRNA转录水平的改变与胆结石相关。而与胆结石模型组相比，试验组小鼠BSEP、NTCP、CYP7A1、CYP8B1的mRNA水平显著增加；SHP、LRH-1的mRNA转录水平显著降低，趋向于对照组小鼠的相关基因mRNA转录水平，由此可知，嗜酸乳杆菌JYLA-16能改善胆结石小鼠肝胆管侧壁细胞内与胆结石相关基因的mRNA转录水平，有助于治疗胆结石。

（2）应用蛋白免疫印迹法测定各组小鼠肝胆管侧膜细胞相关基因的蛋白表达水平

用RIPA裂解液提取小鼠肝脏组织总蛋白；应用BCA试剂盒测定蛋白浓度；通过组织裂解液将各组蛋白进行配平，取同样体积的样品加到4×蛋白质上样缓冲液中，缓慢混合，沸水煮沸5min，室温平衡。将样品准确加入制好的凝胶孔中，电泳（80V，30min；120V，1h），转模（250mA，60min）；常温封闭2h；一抗孵育，4℃过夜；洗膜；孵育二抗，室温60min；洗膜；化学发光；采用ImageJ 软件对条带进行灰度值测定、分析。检测不同蛋白使用的抗体见“1.实验试剂”部分。分析结果见表6。

表6 各组小鼠肝胆管侧膜细胞相关基因的蛋白表达水平

注：*表示与对照组相比，P＜0.01。

由表6可知，与对照组相比，胆结石模型组小鼠肝胆管侧膜细胞内BSEP、NTCP、CYP7A1、CYP8B1基因的蛋白表达水平显著降低，而SHP、LRH-1的蛋白表达水平显著升高，提示了这些基因的蛋白表达水平的改变与胆结石相关。而与胆结石模型组相比，试验组小鼠BSEP、NTCP、CYP7A1、CYP8B1的蛋白表达水平显著增加；SHP、LRH-1的蛋白表达水平显著降低，趋向于对照组小鼠的相关基因的蛋白表达水平，由此可知，嗜酸乳杆菌JYLA-16能改善胆结石小鼠肝胆管侧壁细胞内与胆结石相关的蛋白表达水平，有助于治疗胆结石。

尽管通过优选实施例的方式对本发明进行了详细描述，但本发明并不限于此。在不脱离本发明的精神和实质的前提下，本领域普通技术人员可以对本发明的实施例进行各种等效的修改或替换，而这些修改或替换都应在本发明的涵盖范围内/任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims

1. 一种嗜酸乳杆菌JYLA-16在制备治疗胆结石的产品中的应用，其特征在于，嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）JYLA-16于2020年3月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.19501，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号；治疗胆结石的产品包括嗜酸乳杆菌JYLA-16的菌粉；治疗胆结石的产品为改善肝胆管侧膜细胞蛋白表达水平和增加胆汁酸的产品。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，治疗胆结石的产品还包括葡萄糖。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，治疗胆结石的产品中嗜酸乳杆菌JYLA-16菌体数量为1.0×10⁸~2.0×10⁸CFU/g。

4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，嗜酸乳杆菌JYLA-16的菌粉的制备方法具体包括以下步骤：

（1）制备MRS液体培养基和MRS平板培养基；

5. 如权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤（1）中，制备MRS液体培养基的方法为：将蛋白胨10g、牛肉粉5g、三水醋酸钠5g、七水磷酸氢二钾2g、吐温80 1mL、四水硫酸锰0.05g、柠檬酸三铵2g、葡萄糖20g、七水硫酸镁0.2g和蒸馏水1000mL混合后，用HCl调pH至6.8，搅拌混匀后，在121℃、0.1MPa下灭菌20min。

6.如权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤（2）中，活化后菌接种于MRS液体培养基的接种量为1%~2%。

7.如权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤（2）中，培养温度为40~42℃，培养时间为48~60h。

8.如权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤（3）中，调整悬浊液浓度为1.0×10¹⁰~2.0×10¹⁰cfu/mL。