CN113773983A

CN113773983A - 一种长双歧杆菌长亚种菌株及其应用

Info

Publication number: CN113773983A
Application number: CN202110946394.XA
Authority: CN
Inventors: 霍贵成; 关嘉琦; 李柏良; 董佳欢; 赵丽娜; 徐宝锋; 陈庆学
Original assignee: Northeast Agricultural University
Current assignee: Northeast Agricultural University
Priority date: 2021-08-18
Filing date: 2021-08-18
Publication date: 2021-12-10

Abstract

本发明属于微生物领域，涉及一种长双歧杆菌长亚种菌株及其应用，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山，其分类命名为Bifidobacterium longum subsp.longum，其保藏编号是CCTCC M 2021494，保藏日期：2021.5.6。本发明提供有益生潜力的双歧杆菌菌株，通过体外实验为在体内研究双歧杆菌对结肠上皮细胞的促增殖作用奠定了基础，能够用于开发具有促肠上皮增殖功能的婴儿功能性益生菌制剂。

Description

一种长双歧杆菌长亚种菌株及其应用

技术领域

本发明属于微生物领域，涉及一种长双歧杆菌长亚种菌株及其应用。

背景技术

双歧杆菌是母乳喂养婴儿肠道中最初定植的主要优势菌，与肠道发育密切相关。肠道是机体消化吸收营养物质的重要场所，肠道发育对于维持机体健康具有重要意义。产后早期是新生儿肠胃结构和功能发育的关键时期，然而婴儿出生时肠道发育尚未成熟，更容易出现感染、产后生长受限和坏死性小肠结肠炎等疾病。当肠道发育不良或受到外界损伤刺激后，可通过分子水平的相关机制对其实施积极调控，从而刺激肠道上皮细胞增殖及粘膜屏障成熟。已有研究表明双歧杆菌具有促肠细胞增殖的功能。因此，寻找具有促肠细胞增殖功能的双歧杆菌，并深入挖掘其促上皮细胞增殖及其粘膜屏障成熟的机制，进而开发出具有促肠道发育功能的双歧杆菌益生制剂，具有重要的理论研究意义和实用价值。

发明内容

针对现有技术中存在的问题，本发明提供一种促进肠道细胞增殖的长双歧杆菌长亚种菌株及其应用。

为了克服上述缺陷，本发明采用的技术方案包括：一种长双歧杆菌长亚种菌株，其特征在于，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山，其分类命名为Bifidobacterium longum subsp.longum，其保藏编号是CCTCC M 2021494，保藏日期：2021.5.6，其为长双歧杆菌长亚种菌株。

本发明的又一个目的是提供包含长双歧杆菌长亚种菌株的促进肠细胞增殖用试剂。

本发明的另一个目的是提供长双歧杆菌长亚种菌株作为肠道益生菌的用途，长双歧杆菌长亚种菌株在促进肠细胞增殖或制备促进肠细胞增殖的试剂中的用途，以及长双歧杆菌长亚种菌株在制备促进肠道发育或制备促进肠道发育的试剂中的用途。本发明还提供长双歧杆菌长亚种菌株在制备促进婴儿肠细胞增殖或促进婴儿肠道发育的试剂中的用途。

相对于现有技术，本发明的目的在于筛选出对人胎结肠上皮细胞CCD841 CON的增殖具有突出促进作用的婴儿源双歧杆菌，对优势菌株的基本生物学特性进行评价，对菌株对CCD841 CON细胞增殖的调控作用进行体外评价，并进一步研究其促增殖机制。

本发明的意义在于提供有益生潜力的双歧杆菌菌株，通过体外实验为在体内研究双歧杆菌对结肠上皮细胞的促增殖作用奠定了基础，能够用于开发具有促肠上皮增殖功能的婴儿功能性益生菌制剂。

附图说明

图1长双歧杆菌BL-10菌毛基因簇及其与短双歧杆菌UCC2003菌毛基因簇共线性分析；

图2长双歧杆菌BL-10对CCD841 CoN细胞增殖的影响；

图3长双歧杆菌BL-10对CCD841 CoN细胞增殖的形态学影响；

图4长双歧杆菌BL-10对CCD841 CoN细胞凋亡的形态学影响；

图5长双歧杆菌BL-10对CCD841 CoN细胞凋亡的影响；

图6长双歧杆菌BL-10对CCD841 CoN细胞中基因Axin2及GSK-3β(A)、β-Catenin、Cyclin D1和C-myc(B)表达量的影响；

图7长双歧杆菌BL-10对CCD841 CoN细胞中Axin2、GSK-3β蛋白表达量的影响；

图8长双歧杆菌BL-10对CCD841 CoN细胞中β-Catenin、Cyclin D1、C-myc蛋白表达量的影响；

图9长双歧杆菌BL-10对CCD841 CoN细胞中基因PI3K、Akt、mTOR表达量的影响；

图10长双歧杆菌BL-10对CCD841 CoN细胞中PI3K/Akt/mTOR通路相关蛋白表达量的影响；

图11长双歧杆菌BL-10对CCD841 CoN细胞中基因ZO-1、Claudin1、Occludin表达量的影响；

图12长双歧杆菌BL-10对CCD841 CoN细胞ZO-1、Claudin1、Occludin蛋白表达量的影响；

长双歧杆菌长亚种菌株，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山，其分类命名为Bifidobacterium longum subsp.longum，其保藏编号是CCTCC M 2021494，保藏日期：2021.5.6。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明的实施方式作更进一步的说明。

实验方法

1菌株的分离鉴定

采集哈尔滨地区6月龄内母乳喂养健康婴儿的粪便样品(采集时间：2019年6月；采集人：赵莉；联系方式：18603667208)。将粪便样品用稀释液10倍梯度稀释，在10^-6、10^-7稀释度下分别取100μL涂布于mMRS固体培养基中，37℃厌氧培养48-72h后，选取光滑、凸起、边缘水润的白色或乳白色菌落镜检。使用接种环挑取呈V、Y或两端钝圆的杆状形态菌落，重复划线纯化，直至获得镜检为纯菌株为止。挑取菌落(此菌落即CCTCC NO:M 2021494，也即B.longum BL-10，以下简称为BL-10)接种于mMRS液体培养基，37℃培养24h以活化。提取细菌基因组DNA，将扩增后的PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，若扩增产物长度为1500bp左右且无杂带，将其送至测序公司进行双向测序。将得到的16s测序结果在美国国立生物技术信息中心进行BLAST比对，确定目的基因的归属。最终鉴定为长双歧杆菌长亚种。

长双歧杆菌长亚种BL-10的生物学特性

菌株的全基因组分析：BL-10基因组由质粒及一条闭合环状的染色体组成。预测到的基因2212个，在基因组中共预测到2123个CDS。此外，基因组包含8个rRNA、79个tRNA及2个tmRNA。

菌株的菌毛基因簇及其共线性分析：BL-10菌毛基因簇及其与短双歧杆菌UCC2003菌毛基因簇共线性分析见图1(tadA、tadB、tadC分别为72.6％、56.3％、52.2％；tadE为85.3％、57.4％)。从整体上看，这两株双歧杆菌的菌毛基因簇具有较为保守的共线性。菌毛基因簇基因序列中没有大规模的缺失、插入及易位现象出现。BL-10菌毛基因簇包含tadA、tadB、tadC及tadE基因。

2双歧杆菌对CCD841 CoN细胞增殖与凋亡能力的测定

2.1细胞增殖活性的检测

调整CCD841 CoN细胞密度为10 ⁴个/mL，接种于96孔板，每孔100μL，培养24h贴壁待用。弃上清，试验分组见表1，即用终浓度为1μg/mL的LPS处理细胞，同时设空白对照组、EGF组、BL-10活菌组及灭活菌组。每孔体积100μL，设3个重复孔，孵育24h后弃培养液，PBS清洗3次，每孔加110μL混合液(100μL无双抗DMEM培养液+10μLCCK-8)，孵育1h后酶标仪测450nm处吸收度。增殖活性百分比的计算公式如下：

表1试验设计方案

2.2细胞蛋白含量及酶活性检测

CCD841 CoN细胞以1×10⁴个/mL密度接种于6cm培养皿，每孔3mL，培养24h后贴壁待用。按照表1分组给予不同处理。处理结束后，弃细胞培养基，每孔加入200μL含5g/LTriton的Tris-HCl溶液，裂解细胞，收集细胞裂解液，-20℃保存，用于细胞总蛋白含量、谷草转氨酶、谷丙转氨酶、Na⁺,K⁺-ATP酶及Ca²⁺,Mg²⁺-ATP酶活性的测定。细胞总蛋白含量、Na⁺,K⁺-ATP酶、Ca²⁺,Mg²⁺-ATP酶、谷草转氨酶和谷丙转氨酶活性的测定均按照试剂盒说明书进行。

2.3细胞形态学观察

将CCD841 CoN细胞以2×10⁵个/孔接种于6孔板中，按照表1分组培养细胞，37℃孵育24h后使用倒置显微镜观察细胞。

2.4细胞Hoechst染色

参照细胞凋亡-Hoechst染色试剂盒说明书。将CCD841 CoN细胞以2×10⁵个/孔接种于6孔板中，按照表1分组培养细胞，培养结束后吸净6孔板中液体，PBS洗2次，洗涤时充分晃动孔板并持续3min，加0.5mL Hoechst 33258染色，5min后PBS洗3min×2次，并弃PBS。观察前在孔板中滴入适量抗荧光猝灭液，最后使用荧光显微镜观察细胞。

2.5细胞凋亡检测

参照Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒说明书。将CCD841 CoN细胞接种于6孔板中，细胞浓度为2×10⁵个/孔，当细胞融合至80％后，按照表1分组给予不同处理。处理结束后，用预冷的PBS洗2次，将PBS分别转移至15mL无菌离心管中。加入0.25％胰酶消化细胞约2min，弃胰酶，加入培养基终止消化。收集细胞，2000rpm离心10min。用预冷的PBS重悬细胞，2000rpm离心10min，弃上清洗涤细胞。Annexin V-FITC结合液用于充分悬浮细胞，用量为195μL，然后加入5μL的AnnexinV-FITC，轻轻混匀，室温避光孵育15min。上机前10～20min加入5μL的碘化丙啶染色。上机检测细胞凋亡。

2.6细胞周期检测

将CCD841 CoN细胞以1×10⁴个/mL密度接种于6cm培养皿，每孔3mL，培养24h后贴壁待用。按照表1分组给予不同处理。处理结束后，用胰蛋白酶将细胞消化下来，1000r/min离心5min收集细胞，弃上清PBS洗涤1次，1000r/min离心5min，弃上清。加入1mL DNA碘化丙啶染色工作液和10μL破膜剂振荡混匀，室温避光静置30min，上流式细胞仪检测。

3细胞增殖相关基因的表达水平

3.1细胞总RNA提取

CCD841 CoN细胞以1×10⁴个/mL密度接种于6cm培养皿，每孔3mL，培养24h后贴壁待用。按照表1设置试验分组，各组与CCD841 CoN细胞共作24h后，弃去细胞培养基，加350μL裂解液RL。将细胞裂解液转移至过滤柱CS上，12000rpm室温离心2min，集滤液。加入70％乙醇600μL，混匀后全部转移至吸附柱CR3中，12000rpm室温离心1min，弃废液。加入去蛋白液RW1 350μL，12000rpm室温离心1min，弃废液。滴加的DNase I工作液80μL，室温放置15min。加入去蛋白液RW1 350μL，12000rpm室温离心1min，弃去废液。加入漂洗液RW 500μL，室温放置2min，12000rpm离心1min，弃废液。此步骤重复两次后，12000rpm离心2min，弃废液。吸附柱CR3室温放置10min后转入RNase-Free离心管，加入RNase-Free ddH2O 50μL，室温放置2min，12000rpm离心2min，得到RNA溶液。浓度及纯度符合A260/A280＝1.8～2.1的RNA于-80℃保存。

3.2逆转录反应

参照FastKing gDNA Dispelling RT SuperMix试剂盒说明书进行操作。在冰上混合反应体系：4μL5×FastKing-RT SuperMix、2μL总RNA、14μLRNase-Free ddH₂O。然后在PCR仪上进行反转录反应，反应条件为42℃15min、95℃3min。最后将得到的cDNA置于冰上，进行RT-PCR反应或-20℃保存。

3.3 RT-PCR分析

以cDNA为RT-PCR的反应模板，β-actin为内参基因，按照Promega

qPCRMaster Mix说明书进行操作。引物由上海生工设计并合成，所用RT-qPCR的引物见表2(SEQID NO：1-22)。

表2 RT-qPCR引物

表3实时荧光定量PCR反应体系

本实验采用2^-ΔΔCt法计算相对基因表达量，计算公式如下^[111]：

式中，ΔΔCt＝ΔCt_处理组-ΔCt_对照组，ΔCt＝Ct_N-Ct_{16S rRNA}(N为目的基因)。

3.4细胞增殖相关通路关键蛋白表达

3.4.1细胞处理与分组

CCD841 CoN细胞以1×10⁴个/mL密度接种于10cm培养皿，每孔7mL，培养24h后贴壁待用。设置试验分组同表1，各组与CCD841 CoN细胞共作24h后，弃去细胞培养基，用细胞刮板小心刮下细胞。加入50-100uL变性裂解液，孵育1-2min，14000-16000rpm离心2-5min，收集蛋白后立即置冰上，于-80℃分装保存。

3.4.2蛋白定量

按50:1体积比将BCA试剂A与B配成BCA工作液。配制0、2.5、5、10、20、30、40、50ug/uL蛋白标准溶液。稀释待测样品至合适浓度，取100uL样品稀释液，及100uL蛋白标准溶液，分别加入BCA工作液1000uL，充分混匀，37℃放置30min后，在562nm波长下比色，记录吸光值，并绘制标准曲线。根据标准曲线计算样品的试剂浓度。

3.4.3 SDS-PAGE电泳

配制10％分离胶及5％浓缩胶，加入l×Tris-Gly的电泳缓冲液。吸取适量样品上清加入样品孔中，在样品旁的孔中加入预染的蛋白Marker。初始电压60V，待蛋白样品进入分离胶后，提高电压至90V。待目的条带进入凝胶约2/3时，停止电泳。取出凝胶，切下含目的条带的分离胶，按“纤维垫-滤纸-凝胶-NC/PVDF膜-滤纸-纤维垫”层次形成转印夹层，放入灌满转膜液的转移槽中。稳流200mA，转印60-120min。

3.4.4免疫印迹

(1)封闭、抗原抗体反应：取NC/PVDF膜于平皿中，加含5％脱脂奶粉的封闭液，摇床振荡1.5-2h。TBST洗膜5min×3次。将膜放入含一抗(用western一抗稀释液按抗体说明书稀释)的平皿中，4℃摇床振荡孵育过夜。吸弃一抗，TBST洗5min×3次。用5％脱脂奶粉封闭液稀释二抗(1:8000)，室温摇床振荡1-2h。TBST洗膜5-10min×3次。

(2)显色：使用现配ECL化学发光试剂显影。使用美国Li-COR Odyssey双色红外激光成像系统进行显色成像，设置仪器直接成像拍照。

(3)图像分析：使用Gel-Pro Analyzer 4软件对结果进行灰度分析；使用GraphPadPrism 5软件对结果进行绘制柱形图。

4对人胎结肠上皮细胞增殖、凋亡及周期的调控

4.1对CCD841 CoN细胞增殖的影响

使用CCK8法检测BL-10对CCD841 CoN细胞的增殖活性百分比的影响结果如图2所示。相比于空白组，LPS组细胞增殖被显著抑制，细胞的增殖活性百分比分别降至92.02％。与LPS组相比，EGF组、BL-10活菌组及BL-10灭活菌组均有显著改善(P<0.05)，其中EGF组与空白对照组无显著差异(P>0.05)。BL-10活菌组及BL-10灭活菌组细胞增殖活性显著高于其他组(P<0.05)，细胞的增殖活性百分比分别可达到165.35％、110.59％。结果表明，LPS对CCD841 CoN细胞具有抑制增殖作用，EGF、BL-10活菌及灭活菌均可以扭转LPS对CCD841 CoN细胞的增殖抑制作用，表现出增殖促进作用。

4.2对CCD841 CoN细胞的总蛋白含量的影响

BL-10对CCD841 CON细胞的总蛋白含量的影响见表5。相比于空白组，LPS组CCD841CoN细胞总蛋白含量明显降低(P<0.05)。其中BL-10活菌组和灭活菌组的总蛋白含量显著高于LPS组(P<0.05)，BL-10活菌组和EGF组无显著差异(P>0.05)。综上，BL-10可提高CCD841CoN细胞的蛋白质合成，进一步证实4.1中提高B.longum CCD841 CoN细胞增殖活性的结果。

表5长双歧杆菌BL-10对CCD841 CoN细胞的总蛋白含量变化

注：同列肩标字母不同表示有显著性差异(P<0.05)。

4.3对CCD841 CoN细胞形态学的影响

使用荧光倒置显微镜10×视野下观察CCD841 CoN细胞的形态特征见图3。与空白对照组相比，LPS组细胞含量较少，说明LPS处理组肠道上皮细胞损伤建模成功，细胞增殖受到抑制。与LPS组相比，EGF组、BL-10活菌组与灭活菌组细胞较多，这与4.1中CCK8法测试细胞增殖活性百分比的结果一致。其中BL-10活菌组、灭活菌组比EGF组细胞更加密集。这种现象表明BL-10无论活菌或灭活菌均对CCD841 CoN细胞增殖起促进作用，可缓解LPS诱导的细胞增殖抑制。

使用Hoechst 33258染色在荧光显微镜20×视野下观察CCD841 CoN细胞的形态特征如图4所示。用Hoechst 33258染料染色的正常细胞为淡蓝色，而凋亡的则为亮蓝色。与对照细胞相比，用LPS处理的细胞的凋亡小体具有较强的蓝色荧光(如颜色较淡的箭头所示)，说明LPS处理组CCD841CoN细胞凋亡率较高，肠道上皮细胞损伤建模成功。与LPS组比，EGF组、BL-10组活菌组及其灭活菌组蓝色荧光显著减弱。上述结果表明BL-10可有效地维持CCD841 CoN细胞的形态特征，减少受损伤细胞凋亡。

注：颜色较淡的箭头所指为发生凋亡的细胞，颜色较深的箭头所指则为正常细胞。

4.4对CCD841 CoN细胞凋亡的影响

细胞凋亡指由基因控制的细胞自主的有序的死亡。为进一步定量评价BL-10对细胞凋亡的保护作用，采用流式细胞术检测BL-10作用受损伤CCD841 CoN细胞的细胞凋亡率，结果见图5和表6。其中Q1为坏死细胞，Q2为晚期凋亡细胞，Q3为活细胞，Q4为早期凋亡细胞。结果表明，添加LPS的模型组细胞凋亡率从2.10％升至2.77％，说明LPS诱导的细胞炎症模型建立成功，细胞受到损伤。与LPS组相比，BL-10活菌组的细胞凋亡率从2.77％降低到1.50％，BL-10灭活组细胞凋亡率也显著减少(P<0.05)。上述结果表明BL-10对CCD841 CoN细胞有抑制凋亡作用。

表6长双歧杆菌BL-10对CCD841 CoN细胞的细胞凋亡率

注：同列肩标字母不同表示有显著性差异(P<0.05)。

4.5对CCD841 CoN细胞周期的影响

细胞周期指细胞从一次有丝分裂结束到下一次有丝分裂完成的过程，分为：DNA合成前期(G1期)、DNA合成期(S期)和DNA合成后期(G2期)和有丝分裂期(M期)，长期停滞在G1期的细胞又称为G0期。通过流式细胞术检测BL-10对CCD841 CoN细胞周期的影响，结果见表7。图中第一个峰为G0/G1期，第二个峰代表G2/M期，两峰之间的斜线填充部分为S期。

与对照组相比，LPS组G0/G1期的细胞比例显著提高(P＜0.05)，S期和G2/M期的细胞比例均显著降低(P＜0.05)、EGF组则呈现出完全相反的趋势。结果表明，LPS可以抑制细胞进入S期和G2/M期，从而减少进行正常分裂的细胞比例，达到抑制细胞增殖的效果；反之，EGF可以促进细胞增殖。与LPS组相比，BL-10活菌组及灭活菌组的G0/G1期的细胞比例均在数值上显著降低(P＜0.05)，处于S期的细胞比例显著增加(P＜0.05)。

结果表明，BL-10的可通过提高CCD841 CoN细胞S期比例和降低G0/G1期比例，促进CCD841CoN细胞增殖。

表7长双歧杆菌BL-10作用CCD841 CoN细胞的细胞周期分布

注：同列肩标字母不同表示有显著性差异(P<0.05)。

4.6对CCD841 CoN细胞关键酶活性的影响

4.6.1谷草转氨酶和谷丙转氨酶的活性

对谷草转氨酶及谷丙转氨酶的影响见表8，与空白对照组相比，LPS组CCD841 CoN细胞的谷草转氨酶及谷丙转氨酶活性显著降低(P<0.05)。EGF组、BL-10活菌组及其灭活菌组细胞的谷草转氨酶及谷丙转氨酶活性与空白对照组差异不显著(P>0.05)。结果表明LPS能够诱导CCD841 CoN细胞发生损伤，使细胞谷丙转氨酶、谷草转氨酶活性显著降低(P<0.05)，BL-10活菌及灭活菌均可显著提高CCD841 CoN细胞谷丙转氨酶和谷草转氨酶的活性至正常水平(P<0.05)。

表8长双歧杆菌BL-10对CCD841 CoN细胞谷草转氨酶和谷丙转氨酶活性的影响

注：同列肩标字母不同表示有显著性差异(P<0.05)。

4.6.2 ATP酶的活性

ATP酶的活性的影响见表9。空白对照组、EGF组、BL-10活菌组及其灭活菌组之间Na⁺,K⁺-ATP酶活性差异不显著(P>0.05)，且均显著高于LPS组(P<0.05)。表明BL-10活菌及灭活菌均可提高CCD841 CoN细胞Na⁺,K⁺-ATP酶活性，抵消LPS对细胞的作用。

相比于空白组，LPS组细胞的Ca²⁺,Mg²⁺-ATP酶活性显著降低(P<0.05)。EGF组、BL-10活菌组细胞的Ca²⁺,Mg²⁺-ATP酶活性较LPS组显著提升(P<0.05)，BL-10灭活组细胞酶活性虽显著高于LPS组(P<0.05)，但低于EGF组、BL-10活菌组(P<0.05)。表明BL-10可提高CCD841CoN细胞Ca²⁺,Mg²⁺-ATP酶活性，且活菌较灭活菌效果显著。

表9长双歧杆菌BL-10对CCD841 CoN细胞ATP酶活性的影响

注：同列肩标字母不同表示有显著性差异(P<0.05)。

5长双歧杆菌对CCD841 CoN细胞Wnt/β-Catenin通路的影响

5.1 Wnt/β-Catenin通路相关因子基因表达变化

BL-10对CCD841 CoN细胞中基因Axin2及GSK-3β表达量的影响如图6(A)所示。与空白组相比，LPS组中基因Axin2及GSK-3β的表达量显著上调(P<0.05)。与LPS组相比，BL-10活菌组及灭活菌组基因Axin2及GSK-3β的表达量显著下调(P<0.05)。图6(A)中，空白、LPS、EGF、BL-10活、BL-10灭活的每个组中，左边立柱表示基因Axin2表达量，右边立柱表示基因GSK-3β的表达量。

BL-10对CCD841 CoN细胞中基因β-Catenin、Cyclin D1和C-myc表达量的影响如图6(B)所示。作为促CCD841 CoN细胞增殖正调控基因，β-Catenin、Cyclin D1和C-myc表达情况与图6(A)中负调控基因表达情况总体成相反的趋势。与空白组相比，LPS组β-Catenin、Cyclin D1和C-myc基因表达显著下调(P<0.05)。与LPS组相比，EGF组、BL-10活菌组及灭活菌组β-Catenin、Cyclin D1基因表达显著上调(P<0.05)。图6(B)中，空白、LPS、EGF、BL-10活、BL-10灭活的每个组中，左边立柱表示基因β-Catenin表达量，中间立柱表示基因CyclinD1表达量，右边立柱表示基因C-myc的表达量。

上述结果表明，BL-10可通过诱导CCD841 CoN细胞下调基因Axin2及GSK-3β表达，上调基因β-Catenin、Cyclin D1和C-myc表达，进而促进细胞增殖，缓解LPS诱导的结肠上皮细胞损伤。

5.2 Wnt/β-Catenin通路相关因子蛋白表达变化

BL-10对CCD841 CoN细胞Wnt/β-Catenin通路中关键负调控蛋白Axin2、GSK-3β表达量的影响如图7所示。LPS显著上调了Axin2、GSK-3β蛋白表达量(P<0.05)，与5.1中其mRNA表达量一致。EGF组、BL-10活菌组及灭活菌组的Axin2、GSK-3β蛋白表达量递增。结果表明，LPS刺激细胞后，BL-10可下调负调控蛋白Axin2、GSK-3β表达量，且活菌效果更显著。

BL-10对CCD841 CoN细胞Wnt/β-Catenin通路中关键正调控蛋白β-Catenin、Cyclin D1和C-myc表达量的影响如图8所示。结果显示，LPS显著下调了β-Catenin、CyclinD1和C-myc蛋白表达量(P<0.05)，与5.1中mRNA表达量一致。EGF组、BL-10活菌组及灭活菌组的Axin2、GSK-3β蛋白表达量递减。结果表明，LPS刺激细胞后，BL-10可上调调正调控蛋白β-Catenin、Cyclin D1和C-myc表达量，且活菌效果更显著。

6长双歧杆菌对CCD841 CoN细胞PI3K/Akt/mTOR通路的影响

6.1 PI3K/Akt/mTOR通路相关因子基因表达变化

BL-10对CCD841 CoN细胞中基因PI3K、Akt、mTOR表达量的影响见图9。LPS处理细胞后，基因PI3K、Akt、mTOR表达量显著下调(P<0.05)。与LPS组相比，BL-10活菌及灭活菌组细胞的PI3K、Akt、mTOR基因表达量普遍显著上调(P<0.05)。图9中，空白、LPS、EGF、BL-10活、BL-10灭活的每个组中，左边立柱表示PI3K表达量，中间立柱表示Akt表达量，右边立柱表示mTOR的表达量。

说明BL-10可上调CCD841 CoN细胞PI3K/Akt/mTOR信号通路中关键基因PI3K、Akt、mTOR的表达量。

6.2 PI3K/Akt/mTOR通路相关因子蛋白表达变化

BL-10对CCD841 CoN细胞PI3K/Akt/mTOR通路中关键调控蛋白mTOR、Akt和PI3K磷酸化水平的影响如图10所示。LPS显著降低了细胞中mTOR、Akt和PI3K的磷酸化水平(P<0.05)，这与6.1中它们相应的mRNA表达趋势一致。BL-10活菌及灭活菌组中的细胞蛋白的磷酸化水平显著高于LPS组(P<0.05)，且活菌效果显著于灭活菌组(P<0.05)。

结果说明，BL-10可促进mTOR、Akt、PI3K磷酸化水平升高，激活PI3K/Akt/mTOR信号途径。

7长双歧杆菌对CCD841 CoN细胞紧密连接蛋白的影响

7.1 CCD841 CoN细胞紧密连接基因表达变化

BL-10对CCD841 CoN细胞紧密连接蛋白ZO-1、Claudin1、Occludin的基因表达量的影响如图11所示。相比于空白组，LPS组3个基因表达明显下降(P<0.05)，BL-10活菌及其灭活菌组显著上调(P<0.05)，普遍与EGF组无显著差异(P>0.05)。图11中，空白、LPS、EGF、BL-10活、BL-10灭活的每个组中，左边立柱表示ZO-1表达量，中间立柱表示Claudin1表达量，右边立柱表示Occludin的表达量。

这说明LPS刺激细胞后，导致细胞紧密连接ZO-1、Claudin1及Occludin的基因表达水平降低，而BL-10能够抑制LPS的表达抑制作用，提高ZO-1、Claudin1及Occludin的mRNA水平。

7.2 CCD841 CoN细胞紧密连接蛋白表达变化

BL-10对CCD841 CoN细胞紧密连接蛋白ZO-1、Claudin1、Occludin的蛋白表达量的影响如图12所示。与空白组相比，LPS组ZO-1、Claudin1和Occludin蛋白表达显著下调(P<0.05)，与7.1中mRNA表达情况一致。与LPS组相比，BL-10活菌组及灭活菌组三种蛋白表达量均显著提高(P<0.05)，但仍显著低于EGF组(P<0.05)。BL-10活菌组的ZO-1、Claudin1蛋白表达量均显著高于灭活菌组(P<0.05)。

结果表明LPS抑制细胞紧密连接蛋白表达，而BL-10活菌及灭活菌均可减轻LPS的破坏作用，且BL-10活菌对细胞的保护作用较灭活菌更显著。

8.总结

长双歧长亚种BL-10对细胞增殖的影响

本研究同时将BL-10活菌及灭活菌作为研究对象，评价BL-10对CCD841 CoN细胞增殖等调控。

本研究结果显示BL-10活菌及灭活菌均可显著提高细胞增殖活性百分比及总蛋白含量(P<0.05)。LPS处理的细胞AST/GOT、ALT/GPT和ATPase活性均显著降低。然而BL-10活菌及灭活菌可以改变酶活性的降低，并有效地扭转这种趋势。

本研究使用Hoechst细胞核染色来分析长双歧杆菌对细胞凋亡的保护作用。染色结果表明，LPS处理的细胞表现出典型的凋亡特征，而BL-10活菌及灭活菌处理组与空白对照组和EGF组的细胞均显示出典型的圆形和完整核图像，这说明BL-10可一定程度抑制细胞凋亡。另外，由于磷脂酰丝氨酸会在细胞凋亡的早期转移到细胞表面，因此，本研究使用Annexin V-FITC法定量检测细胞凋亡。本研究证实BL-10活菌与灭活菌均可抑制LPS引起的CCD841 CON细胞凋亡，且活菌对细胞抑制效果优于灭活菌。

本研究中LPS作用于CCD841 CON细胞后，G1期细胞数量显著升高，S期细胞数量显著降低，PI极显著升高，表明LPS加快抑制细胞周期进程，抑制细胞的增殖活性。而BL-10活菌及灭活菌提高CCD841 CoN细胞S期比例和降低G0/G1期比例，促进CCD841 CoN细胞增殖。

综上，结合CCK-8的结果可知，BL-10通过加速细胞周期进程、减少细胞凋亡、提高细胞酶活性参与对CCD841 CON的促增殖作用。

长双歧长亚种BL-10对细胞增殖相关信号通路的调控

Wnt/β-Catenin信号通路是机体调控细胞增殖和分化的信号转导级联途径。在本实验中，RT-PCR和Western-Blot方法证实BL-10可以上调Wnt/β-Catenin信号传导中正调控基因β-Catenin、Cyclin D1、C-myc的表达。途径下调负调控基因Axin2、GSK-3β表达。此外，蛋白质表达与基因表达一致。结合细胞周期的结果可以说明，BL-10可以激活Wnt/β-Catenin信号通路，引起β-Catenin在胞浆积聚并入核，启动下游基因转录，从而促进细胞由G1期向S期推进，促进处于休眠状态的细胞进入分裂期。

在本研究中，BL-10活菌及灭活菌提高了PI3K、Akt、mTOR的磷酸化水平，激活PI3K/Akt/mTOR信号通路，进而参与并调控细胞增殖。

综上，结合上述研究结果，可知BL-10通过激活CCD841 CON细胞的Wnt/β-Catenin及PI3K/Akt/mTOR信号通路，实现对细胞周期、酶活性、凋亡的调控，进而促进细胞增殖。

长双歧长亚种BL-10对细胞紧密连接的调控

紧密连接(Tight Junction)肠黏膜上皮细胞间的紧密连接是肠道机械(物理)屏障的结构基础，主要由ZO-1、Claudins及Occludin等组成，是肠道上皮细胞间的主要连接方式，不仅构成了肠道上皮细胞动态的通透性屏障，而且在维持上皮细胞极性方面发挥着重要作用。

本研究结果表明，BL-10活菌及灭活菌均可以增加LPS处理的CCD841 CoN细胞中Occludin，Claudin1和ZO-1的转录水平及蛋白水平表达，且活菌效果优于灭活菌。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本行业的技术人员应该了解，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。

序列表

<110> 东北农业大学

<120> 一种长双歧杆菌长亚种菌株及其应用

<160> 22

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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ggctcttgtg cgtactgtcc ttc 23

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Claims

1.一种长双歧杆菌长亚种菌株，其特征在于，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山，其分类命名为Bifidobacterium longum subsp. longum，其保藏编号是CCTCC M 2021494，保藏日期：2021.5.6。

2.包含长双歧杆菌长亚种菌株的促进肠细胞增殖用试剂。

3.权利要求1所述的一种长双歧杆菌长亚种菌株作为肠道益生菌的用途。

4.权利要求1所述的一种长双歧杆菌长亚种菌株在促进肠细胞增殖或制备促进肠细胞增殖的试剂中的用途。

5.权利要求1所述的一种长双歧杆菌长亚种菌株在制备促进肠道发育或制备促进肠道发育的试剂中的用途。

6.权利要求1所述的一种长双歧杆菌长亚种菌株在制备促进婴儿肠细胞增殖或促进婴儿肠道发育的试剂中的用途。