CN112899182B - 一种能够预防和/或治疗子宫颈鳞癌的卷曲乳杆菌 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种能够预防和/或治疗子宫颈鳞癌的卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)Lc31和Lc83。所述的卷曲乳杆菌Lc31的保藏编号为CGMCC No.21348，所述的卷曲乳杆菌Lc83的保藏编号为CGMCC No.21349。本发明的卷曲乳杆菌在体外能够很好的粘附在子宫颈鳞癌SiHa细胞表面，其代谢产物可以抑制SiHa细胞的生长增殖和迁移侵袭，促进SiHa细胞的凋亡。可见，卷曲乳杆菌Lc31和Lc83在预防和/或治疗子宫颈鳞癌方面(不以疾病的诊断和治疗为目的)具有巨大的应用前景。

Description

一种能够预防和/或治疗子宫颈鳞癌的卷曲乳杆菌
技术领域
本发明涉及一种能够预防和/或治疗子宫颈鳞癌的卷曲乳杆菌（Lactobacilluscrispatus），属于微生物技术领域。
背景技术
子宫颈癌是女性生殖系统最常见的恶性肿瘤，严重威胁女性生命健康。子宫颈鳞癌是子宫颈癌的主要病理类型，约占全部子宫颈癌的70%。人乳头瘤病毒(Humanpapillomavirus，HPV)感染是子宫颈癌的主要病因。然而，近年来研究证实女性阴道微生态与 HPV 感染及子宫颈癌的发生发展也密切相关。
女性阴道是一个复杂的微生态系统，由鳞状上皮和阴道菌群共同组成。健康育龄女性阴道通常以乳杆菌为主导优势菌。虽然乳杆菌属的细菌已经超过 200 种，但在女性阴道中占据主导优势地位的通常只有四种，分别为：卷曲乳杆菌(L. crispatus)、加氏乳杆菌(L. gasseri)、惰性乳杆菌(L. iners)和詹氏乳杆菌(L. jensensii)。根据主导优势菌的种类，阴道微生态环境分为五种类型，其中 CST I、II、III 和 V 中优势菌分别为以上四种乳酸杆菌，CST IV 为非乳酸杆菌占优势的类型。
在亚洲女性阴道中，以卷曲乳杆菌和惰性乳杆菌为主的CST I和III较为常见，约占 29.5%和 21.4%；而CST II和V相对罕见，所占比例不足2%。虽然惰性乳杆菌的泛滥度高于卷曲乳杆菌，但在健康及患有生殖道感染性疾病(包括HPV感染)的女性中没有明显差异；并且惰性乳杆菌允许严格厌氧的病原菌与之共存，一旦这些厌氧菌占据优势，CST III即转换为CST IV。相比之下，卷曲乳杆菌很少与其它微生物共存，CST I较CST III更为稳定。此外，卷曲乳杆菌仅在健康女性中泛滥度和丰度较高，在患有生殖道感染性疾病(特别是HPV感染及子宫颈病变)的女性中泛滥度和丰度均显著降低，是潜在的阴道益生菌。此外，与惰性乳杆菌为主的CST III相比，以卷曲乳杆菌为主的CST I能够更快速地由HPV阳性状态转为阴性；在所有CST类型中，CST I感染HPV及 hrHPV 的风险最低，进展为子宫颈病变或子宫颈癌的风险也最低。由此可知，卷曲乳杆菌与 HPV 感染及子宫颈病变显著负相关，在子宫颈癌的发生发展过程中发挥潜在的保护作用，有望成为预防和治疗子宫颈癌新的技术手段。
发明内容
[技术问题]
本发明要解决的技术问题是提供一种能够预防和/或治疗子宫颈鳞癌的卷曲乳杆菌。
[技术方案]
为解决上述问题，本发明提供了两株卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)Lc31和Lc83，所述卷曲乳杆菌保藏于中国普通微生物菌种保藏中心，保藏编号为CGMCC No.21348和 CGMCC No. 21349，保藏日期为2020年12月10日。
本发明提供的卷曲乳杆菌Lc31和Lc83分别来源于安徽地区两名32周岁和22周岁健康女性的阴道分泌物，菌株经测序分析，其16S rDNA序列如SEQ ID NO.1和NO.2所示，将测序得到的序列在 GeneBank中进行核酸序列比对，结果显示其与卷曲乳杆菌的16S rDNA序列一致性大于99%，因此将菌株命名为卷曲乳杆菌Lc31和Lc83。
本发明提供的卷曲乳杆菌Lc31和Lc83在MRS固体培养基上菌落呈乳白色，圆形，不透明，大小形态稳定。
另一方面，本发明提供了一种卷曲乳杆菌代谢产物。所述代谢产物由卷曲乳杆菌Lc31和Lc83分别接种于MRS培养基中培养获得，所述代谢产物为培养液过滤后的无细胞上清液。
再一方面，本发明还提供了所述卷曲乳杆菌Lc31和Lc83在预防和/或治疗子宫颈鳞癌方面不以疾病的诊断和治疗为目的的应用。
具体地，本发明的卷曲乳杆菌Lc31和Lc83在体外能够很好的粘附在子宫颈鳞癌SiHa细胞表面；其代谢产物可以直接抑制SiHa细胞的生长增殖和迁移侵袭，促进SiHa细胞的凋亡；在预防和/或治疗子宫颈鳞癌方面（不以疾病的诊断和治疗为目的）具有巨大的应用前景。
[有益效果]
1、本发明获得了两株卷曲乳杆菌Lc31和Lc83，此卷曲乳杆菌和/或此卷曲乳杆菌代谢产物能够预防和/或治疗子宫颈鳞癌，具体体现在：此卷曲乳杆菌在体外能够很好的粘附在宫颈鳞癌SiHa细胞表面；其代谢产物可以直接抑制癌SiHa细胞的生长增殖和迁移侵袭，促进SiHa细胞的凋亡，此卷曲乳杆菌在预防和/或治疗子宫颈鳞癌方面（不以疾病的诊断和治疗为目的）具有巨大的应用前景。
2、本发明获得的卷曲乳杆菌Lc31和Lc83用于预防和/或治疗子宫颈鳞癌时，安全性较高。
[生物材料保藏]
两株卷曲乳杆菌Lc31和Lc83，分类学名Lactobacillus crispatus，已于2020年12月10日保藏于中国普通微生物菌种保藏中心，保藏编号分别为CGMCC No. 21348和 CGMCCNo. 21349。
参据的生物材料Lc31，保藏编号为CGMCC No. 21348，建议的分类命名为卷曲乳杆菌Lactobacillus crispatus，该生物材料于2020年12月10日由中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心收到，于2020年12月10日检测，结果是存活。
参据的生物材料Lc83，保藏编号为CGMCC No. 21349，建议的分类命名为卷曲乳杆菌Lactobacillus crispatus，该生物材料于2020年12月10日由中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心收到，于2020年12月10日检测，结果是存活。
附图说明
图1是本发明实施例提供的两株卷曲乳杆菌株的形态学鉴定结果图，其中A为卷曲乳杆菌Lc31菌落，B为卷曲乳杆菌Lc31菌落革兰染色结果，C为卷曲乳杆菌Lc83菌落，D为卷曲乳杆菌Lc83菌落革兰染色结果。
图2是本发明实施例提供的细胞黏附试验结果图，其中A为卷曲乳杆菌Lc31粘附在子宫颈鳞癌SiHa细胞表面，B为卷曲乳杆菌Lc83粘附在子宫颈鳞癌SiHa细胞表面。
图3是本发明实施例提供的CCK-8检测细胞增殖结果图。
图4是本发明实施例提供的7天平板克隆结果图，自上而下分别为PBS、MRS（pH3.5）、Lc31和Lc83无细胞上清液，每组4个复孔。
图5是本发明实施例提供的流式细胞术检测凋亡结果图。
图6是本发明实施例提供的Tunel法检测凋亡结果图。
图7是本发明实施例提供的流式术检测细胞周期结果图。
图8是本发明实施例提供的细胞划痕结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、卷曲乳杆菌Lc31和Lc83的分离与鉴定
MRS液体培养基成分如下：蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母粉5.0g，葡萄糖20.0g，柠檬酸氢二铵2.0g，乙酸钠（CH3OONa·3H2O）5.0g，磷酸氢二钾（K2HP4·3H2O）2.0g，硫酸镁（MgSO4·7H2O）0.58g，硫酸锰（MnSO4·H2O）0.25g，吐温-80 1.0mL，蒸馏水1L，调pH至6.2-6.6。
MRS固体培养基成分如下：蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母粉5.0g，葡萄糖20.0g，柠檬酸氢二铵2.0g，乙酸钠（CH3OONa·3H2O）5.0g，磷酸氢二钾（K2HP4·3H2O）2.0g，硫酸镁（MgSO4·7H2O）0.58g，硫酸锰（MnSO4·H2O）0.25g，吐温-80 1.0mL，蒸馏水1L，调pH至6.2-6.6；琼脂粉13g。
分离步骤如下：
（1）收集无阴道炎体征、阴道微生态检查正常的健康育龄女性的阴道分泌物样品，编号后分别接种于10 mL MRS液体培养基，37oC培养24hr。
（2）分别取一环MRS培养物，在MRS固体平板上三区划线，37oC培养48hr。
（3）从各平板上挑取形态一致的单菌落至10 mL MRS液体培养基，37oC培养24hr。
（4）分别收集各管中细菌菌体用于菌种保藏和DNA制备。将分离到的细菌分别进行菌种鉴定；进行产酸、产H2O2、菌体自絮凝、与子宫颈鳞癌SiHa细胞粘附作用的检测，筛选其中两株益生性状较好的菌，命名为Lc31和Lc83。
对上述分离筛选获得的菌株Lc31和Lc83进行以下鉴定：
（1）形态学鉴定：在MRS平板上，分离得到的菌株Lc31表现为：大小约1-2毫米、不透明、突起的乳白色菌落，且菌落边缘整齐，大小形态稳定，见图 1A；革兰染色阳性，杆状，可连成链状，见图1B。分离得到的菌株Lc83表现为：大小约2-4毫米、不透明、突起的乳白色菌落，且菌落边缘整齐，大小形态稳定，见图 1C；革兰染色阳性，杆状，可连成链状，见图1D。
（2）16s rDNA序列同源性分析：使用MRS液体培养基37oC培养常规培养上述分离得到的菌株Lc31和Lc83，离心获得菌体，提取基因组DNA作为基因扩增模板，采用通用引物27F(SEQ ID NO.3)和1492R(SEQ ID NO.4)扩增细菌16S rDNA基因保守区。 扩增体系(20mL)为：1×PCR反应缓冲液，200mmol/L dNTPs，上游及下游引物各0.2mmol/L，1U FastPfu DNA聚合酶，1mL模板DNA。反应条件：95oC预变性2min；95oC变性20s，55oC退火20s，72oC延伸60s，共30个循环；72oC终延伸5min。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，阳性结果用通用引物27F和1492R进行双向测序。序列拼接及相似性分析使用DNAMAN软件完成，序列比对通过美国国家生物技术信息中心NCBI数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)在线完成，结果显示Lc31和Lc83均与卷曲乳杆菌的16S rDNA序列一致性大于99%，确定为卷曲乳杆菌。菌株Lc31的16s rDNA序列见SEQ ID NO.1，菌株Lc83的16s rDNA序列见SEQ ID NO.2。
经过上述鉴定，菌株Lc31和Lc83于2020年12月10日，保藏于中国普通微生物菌种保藏中心，保藏编号为CGMCC No. 21348和 CGMCC No. 21349，分类命名为卷曲乳杆菌（Lactobacillus crispatus）。
实施例2：卷曲乳杆菌Lc31和Lc83的益生作用
卷曲乳杆菌无细胞上清液制备方法如下：将卷曲乳杆菌菌体以占MRS液体培养基总体积2%的接种量接种至MRS液体培养基中，于37oC培养48hr，得到培养液；将培养液6000g离心5min后以0.22mm的无菌滤膜过滤，得到卷曲乳杆菌无细胞上清液。
（1）卷曲乳杆菌Lc31和Lc83的产酸能力
使用pH计检测上述无细胞上清液pH值，卷曲乳杆菌Lc31和Lc83的无细胞上清液pH值均稳定在在3.0-3.5之间，表明这两株卷曲乳杆菌产酸能力均较强，对维持下生殖道酸性环境有重要作用。
（2）卷曲乳杆菌Lc31和Lc83的产H2O2能力
使用南京建成过氧化氢检测试剂盒检测上述无细胞上清液中H2O2含量，结果显示Lc31和Lc83均能产生 H2O2，含量分别为109±5mg/L和102±4 mg/L，表明这两株卷曲乳杆菌均有较强的产H2O2能力，对抑制下生殖道病原菌、维持微生态环境有重要作用。
（3）卷曲乳杆菌Lc31和Lc83的自絮凝能力
将卷曲乳杆菌菌体以占MRS液体培养基总体积2%的接种量接种至MRS液体培养基中，于37oC培养48hr，得到培养液；将培养液6000g离心5min后收集沉淀菌体，以PBS缓冲液洗涤三次，然后重悬于PBS缓冲液中；使用分光光度计检测重悬液OD600值，用PBS缓冲液调整使得最终OD600值在1.0（OD0）左右；室温静置4hr后再测OD600值（OD4），计算自絮凝率，公式如下：
自絮凝率%=[(OD0- OD4)/ OD0] ×100%
计算结果显示卷曲乳杆菌Lc31和Lc83的自絮凝率分别为89%和84%，表明表明这两株卷曲乳杆菌自絮凝能力均较强，对抑制下生殖道病原菌、维持微生态环境有重要作用。
（4）卷曲乳杆菌Lc31和Lc83粘附子宫颈鳞癌SiHa细胞的能力
在6孔板各孔中分别放入无菌盖玻片，每孔接种5×105个子宫颈鳞癌SiHa细胞，使用高糖DMEM培养基（含10%胎牛血清和1%双抗）置于CO2培养箱中37 oC培养过夜；换液后继续培养24hr，吸净培养基，PBS洗涤三遍；每孔加入1mL卷曲乳杆菌Lc31或Lc83悬液（预先使用MRS培养48hr，用PBS洗涤三遍后重悬，并用调整菌体浓度为5×107个细菌/mL），CO2培养箱中继续放置30min；吸净菌液，PBS洗涤三遍，4%多聚甲醛固定10min，革兰染色，油镜观察。如图2A和2B所示，卷曲乳杆菌Lc31和Lc83均可大量粘附到子宫颈鳞癌SiHa细胞表面。
实施例3：卷曲乳杆菌菌株Lc31和Lc83直接抑制子宫颈鳞癌SiHa细胞的作用
使用卷曲乳杆菌菌株Lc31和Lc83无细胞上清液分别刺激子宫颈鳞癌SiHa细胞，以PBS作为空白对照，使用无菌PBS作为空白对照，以MRS液体培养基（HCl调pH至3.5）为阴性对照。
子宫颈鳞癌SiHa细胞常规培养条件：高糖DMEM培养基（含10%胎牛血清和1%双抗）；置于5%CO2培养箱中37 oC培养。以下未做特别说明时均使用此常规条件培养。
（1）CCK8法检测子宫颈鳞癌SiHa细胞的增殖
将对数生长期细胞用胰蛋白酶消化，配制成浓度为1×105个/mL的细胞悬液，按10000细胞／孔接种于96孔板，每孔加100mL，置于CO2（5％）培养箱中37℃下培养24hr以贴壁；继续培养24h分别更换为100mL细胞悬液（预混有10mL对照或无细胞上清液），对照组更换为含溶剂的培养基。每组设五个重复。所有孔中加入10mL CCK-8溶液，培养箱中孵育1-4小时；使用酶标仪测定450nm光吸收值，以溶剂处理的细胞为对照组，不含细胞的培养基为空白组，按公式计算各组成分对细胞的存活率，计算公式如下：
细胞存活率%＝（实验组-空白组）/（对照组-空白组）×100%
如图3所示，Lc31无细胞上清液组细胞存活率83%，Lc83无细胞上清液组细胞存活率73%，空白和对照组分别为100%和99%。表明上述无细胞上清液对子宫颈鳞癌SiHa细胞的增殖具有一定的抑制作用。
（2）平板克隆形成实验检测子宫颈鳞癌SiHa细胞的增殖
向24孔板每孔分别接种500mL SiHa细胞悬液（含1000个细胞/孔），分别加入10mLPBS、MRS（pH3.5）、Lc31和Lc83无细胞上清液，每组设四个复孔；24hr换液后每组继续加入对应液体；96hr换液后每组继续加入对应液体；培养第7天时吸尽孔内液体，PBS洗涤三遍，结晶紫染色观察。如图4所示，MRS（pH3.5）对SiHa细胞增殖有所抑制，但与之相比，Lc31和Lc83无细胞上清液对SiHa细胞增殖的抑制作用更为显著。
（3）流式细胞术检测子宫颈鳞癌SiHa细胞的凋亡
向6孔板每孔分别接种1mL SiHa细胞悬液（含5×105个细胞/孔），分别加入100mLPBS、MRS（pH3.5）、Lc31和Lc83无细胞上清液，每组设三个复孔；培养24hr后吸去每孔的上清液，重新加入1mL培养基及100mL相应的各组样品，继续刺激细胞；48hr用PBS洗涤一次，加入0.5mL 0.25%胰酶消化细胞，待细胞变圆且有部分细胞脱落，即加入培养基终止消化；用移液枪轻轻吹打细胞，使细胞悬浮；收集于预处理后的流式管中，300g离心5min，弃上清；加入1mL PBS重新悬浮细胞，300g离心5min，弃上清；沉淀用300mL的Binding Buffer重悬；加入5mL Annexin V-FITC，混匀后避光孵育10min；加入5mL PE，混匀后避光孵育5min；1h内上机检测。如图5所示， PBS和MRS（pH3.5）组细胞凋亡率为4.4%和4.3%，Lc31和Lc83无细胞上清液组分别为为15.8%和24.7%；Lc31和Lc83无细胞上清液显著促进子宫颈鳞癌SiHa细胞发生凋亡。
（4）Tunel法检测子宫颈鳞癌SiHa细胞的凋亡
向6孔板每孔分别放入无菌盖玻片，分别接种1mL SiHa细胞悬液（含5×105个细胞/孔），分别加入100mL PBS、MRS（pH3.5）、Lc31和Lc83无细胞上清液，每组设三个复孔；培养24hr后吸去每孔的上清液，重新加入1mL培养基及100mL相应的各组样品，继续刺激细胞；48hr用PBS洗涤三次，4%多聚甲醛固定30min，PBS洗3次；爬片稍干后用组化笔在盖玻片中间细胞分布均匀的位置画圈（防止抗体流走），加50-100mL破膜工作液，室温孵育10min，PBS洗3次；圈内滴加3%过氧化氢溶液，室温避光孵育20 min，将玻片置于PBS（pH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次；取tunel试剂盒内适量试剂1 (TdT)和试剂2(dUTP)按1:9混合，加到爬片上覆盖住细胞，盖上孔板的盖子，用锡纸包住平放于水浴锅内，37℃水浴锅孵育60min；爬片稍甩干后，每孔内加适量试剂3(converter-POD）覆盖细胞，切片平放于湿盒内，37℃孵育30min；将玻片置于PBS（pH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次；爬片稍干后在圈内滴加适量DAPI染液到爬片上，室温避光孵育5min；PBS漂洗爬片3次，从6孔板内取出爬片，将有细胞的一面封到滴加有抗荧光淬灭封片剂的载玻片上，荧光显微镜下观察并拍照；如图6所示，PBS和MRS（pH3.5）组细胞凋亡率为6%和5.8%，Lc31和Lc83无细胞上清液组分别为为14.9%和26.6%；Lc31和Lc83无细胞上清液显著促进子宫颈鳞癌SiHa细胞发生凋亡。
（5）流式细胞术检测子宫颈鳞癌SiHa细胞的周期变化
向6孔板每孔分别接种1mL SiHa细胞悬液（含5×105个细胞/孔），分别加入100mLPBS、MRS（pH3.5）、Lc31和Lc83无细胞上清液，每组设三个复孔；培养24hr后吸去每孔的上清液，重新加入1mL培养基及100mL相应的各组样品，继续刺激细胞；48hr用PBS洗涤一次，加入1mL 0.25%胰酶消化细胞，待细胞变圆且有部分细胞悬浮，即加入PBS终止消化；用移液枪轻轻吹打细胞，使细胞悬浮；细胞悬液转入离心管中，300g离心5min收集细胞；沉淀用3mL PBS重悬，300g离心5min收集细胞；沉淀中缓慢加入预冷的90%乙醇，重悬细胞，4℃孵育20min，300g离心5min收集细胞；3mL PBS重悬细胞，300g离心5min；加入500uL 试剂盒里的RNase/PI重悬细胞，避光染色20min；上机检测，选择相应通道观察；如图7所示，与PBS和MRS（pH3.5）组相比，Lc31和Lc83无细胞上清液组细胞周期受到明显阻滞。
（6）细胞划痕实验检测子宫颈鳞癌SiHa细胞的迁移能力
在6孔板背后均匀画平行的直线，约0.5-1cm一道，横穿过孔，每孔5条；每孔分别接种2mL SiHa细胞悬液（含5×105个细胞/孔），待细胞铺满孔底后用枪头垂直于横线划掉细胞；PBS轻轻漂洗掉划下的细胞，加入1 mL培养基；分别加入100mL PBS、MRS（pH3.5）、Lc31和Lc83无细胞上清液，每组设三个复孔；培养24hr后吸去每孔的上清液，重新加入1mL培养基及100mL相应的各组样品，继续刺激细胞；48hr取出孔板拍照、测量距离并计算伤口愈合；如图8所示，PBS和MRS（pH3.5）组伤口愈合率为72.4%和71.9%，Lc31和Lc83无细胞上清液组分别为为32.89%和22.69%；Lc31和Lc83无细胞上清液明显抑制了子宫颈鳞癌SiHa细胞的迁移能力。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 安徽省肿瘤医院
<120> 一种能够预防和/或治疗子宫颈鳞癌的卷曲乳杆菌
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1528
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
agagtttgat cctggctcag gacgaacgct ggcggcgtgc ctaatacatg caagtcgagc 60
gagcggaact aacagattta cttcggtaat gacgttagga aagcgagcgg cggatgggtg 120
agtaacacgt ggggaacctg ccccatagtc tgggatacca cttggaaaca ggtgctaata 180
ccggataaga aagcagatcg catgatcagc ttttaaaagg cggcgtaagc tgtcgctatg 240
ggatggcccc gcggtgcatt agctagttgg taaggtaaag gcttaccaag gcgatgatgc 300
atagccgagt tgagagactg atcggccaca ttgggactga gacacggccc aaactcctac 360
gggaggcagc agtagggaat cttccacaat ggacgcaagt ctgatggagc aacgccgcgt 420
gagtgaagaa ggttttcgga tcgtaaagct ctgttgttgg tgaagaagga tagaggtagt 480
aactggcctt tatttgacgg taatcaacca gaaagtcacg gctaactacg tgccagcagc 540
cgcggtaata cgtaggtggc aagcgttgtc cggatttatt gggcgtaaag cgagcgcagg 600
cggaagaata agtctgatgt gaaagccctc ggcttaaccg aggaactgca tcggaaactg 660
tttttcttga gtgcagaaga ggagagtgga actccatgtg tagcggtgga atgcgtagat 720
atatggaaga acaccagtgg cgaaggcggc tctctggtct gcaactgacg ctgaggctcg 780
aaagcatggg tagcgaacag gattagatac cctggtagtc catgccgtaa acgatgagtg 840
ctaagtgttg ggaggtttcc gcctctcagt gctgcagcta acgcattaag cactccgcct 900
ggggagtacg accgcaaggt tgaaactcaa aggaattgac gggggcccgc acaagcggtg 960
gagcatgtgg tttaattcga agcaacgcga agaaccttac caggtcttga catctagtgc 1020
catttgtaga gatacaaagt tcccttcggg gacgctaaga caggtggtgc atggctgtcg 1080
tcagctcgtg tcgtgagatg ttgggttaag tcccgcaacg agcgcaaccc ttgttattag 1140
ttgccagcat taagttgggc actctaatga gactgccggt gacaaaccgg aggaaggtgg 1200
ggatgacgtc aagtcatcat gccccttatg acctgggcta cacacgtgct acaatgggca 1260
gtacaacgag aagcgagcct gcgaaggcaa gcgaatctct gaaagctgtt ctcagttcgg 1320
actgcagtct gcaactcgac tgcacgaagc tggaatcgct agtaatcgcg gatcagcacg 1380
ccgcggtgaa tacgttcccg ggccttgtac acaccgcccg tcacaccatg ggagtctgca 1440
atgcccaaag ccggtggcct aaccttcggg aaggagccgt ctaaggcagg gcagatgact 1500
ggggtgaagt cgtaacaagg tagccgta 1528
<210> 2
<211> 1528
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
agagtttgat cctggctcag gacgaacgct ggcggcgtgc ctaatacatg caagtcgagc 60
gagcggaact aacagattta cttcggtaat gacgttagga aagcgagcgg cggatgggtg 120
agtaacacgt ggggaacctg ccccatagtc tgggatacca cttggaaaca ggtgctaata 180
cctgataaga aagcagatcg catgatcagc ttttaaaagg cggcgtaagc tgtcgctatg 240
ggatggcccc gcggtgcatt agctagttgg taaggtaaag gcttaccaag gcgatgatgc 300
atagccgagt tgagagactg atcggccaca ttgggactga gacacggccc aaactcctac 360
gggaggcagc agtagggaat cttccacaat ggacgcaagt ctgatggagc aacgccgcgt 420
gagtgaagaa ggttttcgga tcgtaaagct ctgttgttgg tgaagaagga tagaggtagt 480
aactggcctt tatttgacgg taatcaacca gaaagtcacg gctaactacg tgccagcagc 540
cgcggtaata cgtaggtggc aagcgttgtc cggatttatt gggcgtaaag cgagcgcagg 600
cggaagaata agtctgatgt gaaagccctc ggcttaaccg aggaactgca tcggaaactg 660
tttttcttga gtgcagaaga ggagagtgga actccatgtg tagcggtgga atgcgtagat 720
atatggaaga acaccagtgg cgaaggcggc tctctggtct gcaactgacg ctgaggctcg 780
aaagcatggg tagcgaacag gattagatac cctggtagtc catgccgtaa acgatgagtg 840
ctaagtgttg ggaggtttcc gcctctcagt gctgcagcta acgcattaag cactccgcct 900
ggggagtacg accgcaaggt tgaaactcaa aggaattgac gggggcccgc acaagcggtg 960
gagcatgtgg tttaattcga agcaacgcga agaaccttac caggtcttga catctagtgc 1020
catttgtaga gatacaaagt tcccttcggg gacgctaaga caggtggtgc atggctgtcg 1080
tcagctcgtg tcgtgagatg ttgggttaag tcccgcaacg agcgcaaccc ttgttattag 1140
ttgccagcat taagttgggc actctaatga gactgccggt gacaaaccgg aggaaggtgg 1200
ggatgacgtc aagtcatcat gccccttatg acctgggcta cacacgtgct acaatgggca 1260
gtacaacgag aagcgagcct gcgaaggcaa gcgaatctct gaaagctgtt ctcagttcgg 1320
actgcagtct gcaactcgac tgcacgaagc tggaatcgct agtaatcgcg gatcagcacg 1380
ccgcggtgaa tacgttcccg ggccttgtac acaccgcccg tcacaccatg ggagtctgca 1440
atgcccaaag ccggtggcct aaccttcggg aaggagccgt ctaaggcagg gcagatgact 1500
ggggtgaagt cgtaacaagg tagccgta 1528
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
agagtttgat cctggctcag 20
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ggttaccttg ttacgactt 19

Claims (7)

1.一株卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus )Lc31，其特征在于，所述卷曲乳杆菌保藏于中国普通微生物菌种保藏中心，保藏编号为CGMCC No.21348，保藏日期为2020年12月10日。
2.一株卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus )Lc38，其特征在于，所述卷曲乳杆菌保藏于中国普通微生物菌种保藏中心，保藏编号为CGMCC No.21349，保藏日期为2020年12月10日。
3.权利要求1或2所述卷曲乳杆菌和/或所述卷曲乳杆菌的上清液在制备治疗子宫颈鳞癌的产品中的应用。
4.一种治疗子宫颈鳞癌的产品，其特征在于，所述产品含有权利要求1或2所述的卷曲乳杆菌和/或权利要求1或2所述的卷曲乳杆菌的上清液。
5.如权利要求4所述的产品，其特征在于，所述产品包括药品、卫生用品。
6.如权利要求5所述的产品，其特征在于，所述药品的成分包含权利要求1或2所述卷曲乳杆菌以及药学上可接受的载体；或者，所述药品的成分包含权利要求1或2所述卷曲乳杆菌的上清液以及药学上可接受的载体；或者，所述药品的成分包含权利要求1或2所述卷曲乳杆菌、权利要求1或2所述卷曲乳杆菌的上清液以及药学上可接受的载体。
7.如权利要求5所述的产品，其特征在于，所述卫生用品包括消毒纸巾、卫生护垫和卫生棉条。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112899182B (zh) * 2021-01-08 2023-03-24 安徽省肿瘤医院 一种能够预防和/或治疗子宫颈鳞癌的卷曲乳杆菌
CN113980831B (zh) * 2021-07-23 2024-04-26 大连医科大学 两种阴道乳酸杆菌及其应用
CN115806901B (zh) * 2022-09-01 2023-08-04 昆明医科大学 一株短乳杆菌及其抗宫颈癌应用
CN115607578B (zh) * 2022-10-25 2023-04-21 哈尔滨美华生物技术股份有限公司 一株卷曲乳杆菌在制备治疗宫腔粘连药物中的应用
CN116286484A (zh) * 2023-02-08 2023-06-23 南昌大学 卷曲乳杆菌及其用途

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022148138A1 (zh) * 2021-01-08 2022-07-14 安徽省肿瘤医院 一种能够预防和/或治疗子宫颈鳞癌的卷曲乳杆菌

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6890419B2 (ja) * 2013-11-08 2021-06-18 スーヂョウ オーセル バイオ−ファーム カンパニー、リミテッド ラクトバチルス・クリスパタスおよびその応用
KR101720145B1 (ko) * 2016-07-08 2017-04-07 (주)정가진면역연구소 여성 질염 예방 및 개선 기능성 조성물
CN107937324B (zh) * 2018-01-10 2020-01-21 中国科学院微生物研究所 一株卷曲乳杆菌及其应用
CN111088178B (zh) * 2018-10-23 2022-11-22 上海上药信谊药厂有限公司 一种产乳酸和h2o2的乳杆菌及其应用
CN111518714B (zh) * 2019-12-19 2022-02-01 江南大学 一株能够预防和/或治疗念珠菌阴道炎的卷曲乳杆菌
CN111893057B (zh) * 2020-06-29 2021-04-23 哈尔滨美华生物技术股份有限公司 一株用于防治妇女泌尿生殖道感染的卷曲乳杆菌及其应用

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022148138A1 (zh) * 2021-01-08 2022-07-14 安徽省肿瘤医院 一种能够预防和/或治疗子宫颈鳞癌的卷曲乳杆菌

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