CN114128891A - 一种促进婴儿肠道发育的菌株及其应用 - Google Patents

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吕临征
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Abstract

本发明公开了一种促进婴儿肠道发育的菌株，所述菌株为副干酪乳杆菌ML‑446，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2021年6月24日，保藏编号为CCTCCNO：M2021771，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，所述菌株的分类学命名为LactobacillusparacaseiML‑446。将该菌株其应用于功能性食品中，可维持肠道内环境稳态、促进肠道发育。

Description

一种促进婴儿肠道发育的菌株及其应用
技术领域
本发明涉及食品健康技术领域，更具体地说是涉及一种促进婴儿肠道发育的菌株及其应用。
背景技术
母乳作为婴儿首先摄入的食物，对婴儿的健康产生重要影响。婴儿时期肠道菌群未建立完善，母乳能提供婴儿肠道菌群建立所需的微生物，有研究表明，母乳中微生物数量达103-104CFU/mL。一个婴儿每天要摄入约800mL的乳汁，消化大约1×105～1×107cfu的微生物。母乳能帮助婴儿逐渐建立稳固的肠道菌群。临床研究表明，早产儿及低体重儿，胃肠道过早脱离宫内环境，缺乏生长发育所需的营养物质、激素及生长因子，胃肠道功能发育不完全，对婴幼儿健康产生极大地威胁。对于正常新生儿，肠胀气、腹泻及便秘等肠道功能问题同样存在，其与肠道发育不完全有着密切的关系。
目前临床多采用少食多餐，热敷，添加复合益生菌来缓解症状。对于早产儿及低体重患儿，采取抗生素治疗。然而对于新生婴儿，药物具有严重的副作用以及不能为所有人所耐受的缺点。
近年来的研究发现肠道菌群与肠道发育有很大关联。首先，肠道益生菌可抑制细胞凋亡，促进细胞增殖，维持肠道环境的稳态。试验表明，鼠李糖乳杆菌分泌的两种蛋白p40和p75可通过激活表皮生长因子受体及其下游的Akt，有效缓解细胞因子诱导的肠上皮细胞凋亡。Akt的激活会导致包括caspase-3，caspase-9在内的促调亡蛋白失活，进而提高了细胞的存活能力。另有研究表明，益生菌可以通过增加R-spondins的表达从而激活Wnt/β-catenin途径刺激了肠上皮细胞的增殖，并可以修复受损肠粘膜。其次，在调节肠上皮紧密连接功能方面，益生菌同样具有积极的效果。而且，益生菌可通过调节细胞骨架和紧密连接蛋白的磷酸化水平，增强肠道的屏障功能，维持内环境稳态。
因此，如何提供一种可以维持肠道内环境稳态、促进肠道发育的菌株并将其应用于功能性食品中是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种副干酪乳杆菌ML-446，该菌株可以促进婴儿肠道发育，调节肠道内环境稳态。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种促进婴儿肠道发育的菌株，所述菌株为副干酪乳杆菌ML-446，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2021年6月24日，保藏编号为CCTCC NO：M 2021771，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，所述菌株的分类学命名为LactobacillusparacaseiML-446。
上述所述的婴儿肠道发育的菌株在制备促进婴儿肠道发育、维持肠道内环境稳态的功能性食品中的应用。
作为上述技术方案优选的技术方案，所述菌株能促进肠道绒毛的生长，并促进肠道上皮细胞的增殖。
一种功能性食品，包括上述所述的副干酪乳杆菌ML-446。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种副干酪乳杆菌ML-446，该菌株可以促进婴儿肠道发育，调节肠道内环境稳态，显著促进肠道绒毛的生长，同时促进肠道上皮细胞的增殖，其促进可能与上调Wnt信号通路，抑制notch通路，促进杯状细胞及潘氏细胞增殖有关。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1附图为实施例4提供的大鼠幼崽肠组织HE染色图；
图2附图为实施例4提供的大鼠幼崽Ki67肠组织免疫结果图；
图3附图为实施例4提供的大鼠幼崽肠组织免疫组化分析图；
图4附图为实施例4提供的大鼠幼崽肠组织免疫组化分析图；
图5附图为实施例4提供的大鼠幼崽肠组织PAS分析图；
图6附图为实施例4提供的大鼠幼崽肠组织PAS分析图；
图7附图为实施例4提供的大鼠幼崽Western Blot WNT通路表达结果图；
图8附图为实施例4提供的大鼠幼崽Western Blot WNT通路表达结果图；
图9附图为实施例4提供的大鼠幼崽Western Blot notch通路表达结果图；
图10附图为实施例4提供的大鼠幼崽Western Blot notch通路表达结果图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1筛选副干酪乳杆菌ML-446菌株
本菌株从母乳中分离获得。具体方法如下，采用涂布方法进行菌种分离，母乳样本稀释10倍，100μL涂布到半选择性培养基平板上，培养基采用MRS-cys，添加X-gal，37℃培养48h后，于空气中静置4h，挑取蓝色菌落，纯化后进行16S rRNA鉴定。用试剂盒提取法提取细菌的基因组DNA，然后以基因组DNA为模板，通用引物为扩增引物进行PCR以扩增16S rDNA。反应完毕，经过琼脂糖凝胶电泳确认目的片段后，将PCR扩增产物送上海生工进行测序。将序列提交GenBank数据库，通过BLAST进行同源搜索，寻找与目的序列同源性最高的已知分类地位菌种的16S rDNA，确定细菌为副干酪乳杆菌ML-446菌株，将其保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2021年6月24日，保藏编号为CCTCC NO：M 2021771，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，所述菌株的分类学命名为LactobacillusparacaseiML-446。
实施例2益生菌菌悬液的制备
将实施例1筛选得到的副干酪乳杆菌ML-446以2％(v/v)接种量分别接种于10mlMRS液体培养基，37℃恒温培养24h。将培养后的菌株发酵液在4℃条件下以8000r/min离心5min，弃去上清，菌体重悬于无菌PBS洗涤两次，最后在生理盐水中混匀，使用平板计数法调整菌体浓度约为108CFU/ml。
实施例3建立大鼠幼崽子宫内发育不全模型
宫内发育不全仔鼠：采用母鼠孕期限制饮食法建立仔鼠IUGR模型。Spr ague-Dawley怀孕大鼠由Charles River Laboratory Animal Technology Co.Lt d，中国北京提供。将怀孕的大鼠单独饲养。将妊娠大鼠随机分为两组：正常饮食组和食物限制组。允许正常饮食组中的大鼠无限制地食用食物和水。从怀孕第一天到分娩日，向控制饮食组中的大鼠提供正常饮食组给予的食物量的50％。两个小组在分娩当天都获得了充足的食物和水。与正常新生大鼠相比，IUGR新生大鼠是限制饮食组中体重低于两个标准差即造模成功。
实施例4验证ML-446菌株对肠道发育的促进作用
将造模成功大鼠幼崽分为阴性对照组(灌胃PBS 100μL/10g)及实验组(灌胃实施例2中的ML-446菌株悬液108cfu/mL)。期间，自由摄食母乳。灌胃至10d处死大鼠幼崽。收集肠组织置于-80℃冰箱及组织保存液待用。
大鼠幼崽肠组织HE染色分析
将幼崽空肠，回肠及结肠梯度酒精脱水，并常规进行石蜡包埋，从石蜡块上各切下一片厚度约为4μm的肠组织切片，进行HE染色，并在倒置显微镜下观察拍照；结果见图1；由图1可知，添加ML-446对幼鼠肠道绒毛发育有一定的促进作用。
大鼠幼崽肠组织免疫组化分析
将幼崽空肠，回肠及结肠梯度酒精脱水，并常规进行石蜡包埋，从石蜡块上各切下一片厚度约为4μm的肠组织切片，进行一抗孵育(Ki67,lysozyme),加入按比例稀释好的一抗均匀覆盖组织，4℃过夜。二抗孵育(HRP-山羊抗兔IgG),从冰箱拿出切片复温30min，PBS洗5min3次。加入按比例稀释好的二抗室温孵育50min。PBS洗5min 3次。DAB显色及苏木素复染，并在倒置显微镜下观察拍照；结果见图2、图3、图4；由图2可知，ML-446干预的组别，Ki67的平均光密度明显高于空白对照组；由图3和图4可知，ML-446干预的组别，空肠及回肠Lysozyme的平均光密度高于空白对照组。
大鼠幼崽肠组织PAS分析
将幼崽空肠，回肠及结肠梯度酒精脱水，并常规进行石蜡包埋，从石蜡块上各切下一片厚度约为4μm的肠组织切片，进行染色，高碘酸溶液浸染15min，schiff试剂(提前恢复至室温)中加盖避光浸染30min，流水冲洗5min，切片进入苏木素核染染色1min，自来水洗。然后切片经苏木素分化液(1％的盐酸酒精)分化3s，自来水洗，流水冲洗反蓝。并在倒置显微镜下观察拍照；结果见图5和图6；由图5和图6可知，ML-446干预的组别，空肠，回肠及结肠杯状细胞数高于空白对照组。
WesternBlot检测蛋白表达量
相应体积的裂解样本，然后继续置于冰上静置5min。开启低温冷冻离心机，12000rpm，4℃，离心10min，分离上清为所得的蛋白质抽提物。提取蛋白后，进行蛋白质定量分析，通过转膜，封闭，一抗二抗孵育，最后通过凝胶图像处理系统进行目标条带的分析；结果见图7、图8、图9和图10；可知，ML-446干预的组别，空肠，回肠及结肠β-catenin蛋白的表达高于对照组；由图6可知，ML-446干预的组别，空肠，回肠activated-notch蛋白的表达高于对照组，结肠activated-notch蛋白的表达低于对照组。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (4)

1.一种促进婴儿肠道发育的菌株，其特征在于，所述菌株为副干酪乳杆菌ML-446，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2021年6月24日，保藏编号为CCTCCNO：M2021771，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。
2.根据权利要求1所述的一种促进婴儿肠道发育的菌株在制备促进婴儿肠道发育、维持肠道内环境稳态的功能性食品中的应用。
3.根据权利要求2所述的一种促进婴儿肠道发育的菌株在制备促进婴儿肠道发育、维持肠道内环境稳态的功能性食品中的应用，其特征在于，所述菌株能促进肠道绒毛的生长，并促进肠道上皮细胞的增殖。
4.一种功能性食品，其特征在于，包括权利要求1所述的菌株。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN114805474A (zh) * 2022-04-02 2022-07-29 中国海洋大学 一株干酪乳杆菌fn345及其在制备预防辅食期婴儿腹泻菌剂中的应用

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