CN115607578B - 一株卷曲乳杆菌在制备治疗宫腔粘连药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一株卷曲乳杆菌在制备用于宫腔粘连预防和/或治疗和/或预后的药物中的应用，属于生物医药领域，所述的卷曲乳杆菌保藏号为CGMCCNo.15938。本发明的卷曲乳杆菌对宫腔粘连有较好的治疗效果，特别是针对中重度宫腔粘连，能够降低患者IUA分级评分，改善患者子宫内膜厚度，且相比于雌激素治疗的宫腔粘连复发率低。

Description

一株卷曲乳杆菌在制备治疗宫腔粘连药物中的应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及一株卷曲乳杆菌在制备治疗宫腔粘连中的应用。

背景技术

宫腔粘连(intrauterine adhesions，IUA)是多种原因导致的子宫内膜基底层损伤，引起子宫肌壁的相互粘连，其修复过程包括炎症期、组织形成期、组织重建期3个短暂重叠的时期；由于子宫内膜的修复多为不完全再生，其功能受损，最终形成瘢痕以致宫颈管、子宫腔部分或全部闭塞。IUA患者的临床表现与粘连的部位及程度有关。单纯的宫颈管粘连，可引起闭经、不孕、周期性腹痛等较严重的症状，但其宫腔形态相对正常，内膜良好；而宫腔部分或完全闭塞者，临床表现与粘连的严重程度一致，可出现月经量减少、闭经、不孕、反复流产等症状，而且宫腔变形甚至完全消失，预后较差。文献报道，多次人工流产、刮宫所致的 IUA发生率高达25％-30％，已经成为月经量减少、继发不孕的主要原因，是妇科常见、对生育功能严重危害并且治疗效果较差的宫腔疾病，严重影响女性生殖生理及身心健康。随着宫腔镜技术的开展，宫腔粘连的诊断取得了划时代的进展，宫腔镜检查成为诊断宫腔粘连的金标准。与此同时，宫腔镜宫腔粘连分离术 (transcervical resection ofadhesions，TCRA)实现了微创的宫腔整复性手术，可有效分离粘连组织，恢复宫腔解剖学形态。遗憾的是，大量文献报道，TCRA术后再粘连率在轻、中度IUA为30％，重度则高达62.5％，即使术后能够恢复子宫腔的解剖学形态，术后子宫内膜仍不能完全再生修复。因此，提高宫腔黏连术后子宫内膜再生，有效恢复月经和生育功能，是临床领域中迫切需要解决的问题。

目前越来越多的证据表明，微生物在人类发育、生理、免疫和营养方面发挥着重要作用。作为最重要的人类微生物栖息地之一，阴道微生态系统是人体生态系统中较为复杂的系统，也是目前成为研究热点的一个系统，它在人类的繁衍和疾病防御机制方面起着重要作用。阴道腔内菌群与宿主之间、菌群与菌群之间、菌群与环境之间始终保持着动态平衡，这种协调的动态平衡对抵制病原微生物入侵起着决定性作用。在正常情况下，女性阴道内有大量的微生物存在，既包括白假丝酵母菌、加德纳菌、大肠埃希菌、肠球菌、消化链球菌、表皮葡萄球菌等条件致病菌，也包括双歧杆菌、乳酸杆菌等益生菌，且致病菌与益生菌二者处于一个良性的动态平衡状态。在生理状态下，益生菌构成防止外来细菌侵入的生物屏障，参与阴道局部物质代谢、营养转化，刺激宿主产生抗体，增强免疫力，促进宫颈上皮细胞修复和闭合，竞争性抑制病原体，对维持阴道内环境的稳定起着重要作用。当菌群平衡破坏，菌群紊乱不仅导致局部的炎症，且致病菌还可向宫腔蔓延，增加宫腔感染风险。目前，阴道益生菌的筛选及其在各种阴道疾病中的应用属研究热点。我国目前临床上常用的阴道益生菌药品为定君生，在治疗细菌性阴道病中取得了一定的效果，但是该药品仅含德氏乳酸杆菌，不属于我国妇女阴道优势乳酸杆菌，且定植能力差，也不能维持稳定的活菌含量。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了卷曲乳杆菌在治疗和改善IUA中的应用，为降低宫腔镜术后宫腔黏连发生后提供新思路。

卷曲乳酸杆菌是革兰氏阳性细菌，为阴道常见益生菌之一，在阴道内可以通过产生酸性物质、过氧化氢、抑菌素等维持阴道微生态健康，对阴道炎常见病原菌比如白假丝酵母菌、乙型溶血性链球菌等具有良好的抑制效果。此外，该菌具有良好的抗氧化性，且可大量粘附于宫颈Hela细胞，并可有效阻止机会致病菌对Hela细胞的定植。上述特性使得卷曲乳酸杆菌具有治疗和改善IUA预后效果的潜力。

一方面，本发明提供了一株卷曲乳杆菌在制备用于宫腔粘连预防和/或治疗和/或预后的药物中的应用。

所述的卷曲乳杆菌保藏号为CGMCC No.15938。

优选地，所述的药物经阴道给药。

所述的药物的剂型可以是：栓剂、灌洗剂、凝胶剂、泡腾剂、喷雾剂、胶囊剂。

优选地，所述的卷曲乳杆菌单次给药量为不低于1×10⁸CFU；

进一步优选地，所述的卷曲乳杆菌单次给药量为不低于2×10⁸CFU、 3×10⁸CFU、4×10⁸CFU、5×10⁸CFU、6×10⁸CFU、7×10⁸CFU。

优选地，所述的卷曲乳杆菌总给药量不低于3×10⁸CFU；

进一步优选地，所述的卷曲乳杆菌总给药量不低于3×10⁸CFU、4×10⁸CFU、5×10⁸CFU、6×10⁸CFU、7×10⁸CFU、8×10⁸CFU、9×10⁸CFU。

更进一步地，所述的卷曲乳杆菌的总给药量为7×10⁸CFU。

所述的药物中还可以包括其他药学上可接受的载体和辅料。

优选地，所述的药物中还可以包括5％脱脂乳和3％海藻糖。

优选地，所述的宫腔粘连为中重度宫腔粘连。

优选地，所述的卷曲乳杆菌用于宫腔镜手术后。

另一方面，本发明提供了一株卷曲乳杆菌在制备降低子宫内膜厚度的药物或保健用品中的应用。

所述的卷曲乳杆菌保藏号为CGMCC No.15938。

优选地，所述的药物经阴道给药。

优选地，所述的卷曲乳杆菌单次给药量为不低于1×10⁸CFU；

进一步优选地，所述的卷曲乳杆菌单次给药量为不低于2×10⁸CFU、 3×10⁸CFU、4×10⁸CFU、5×10⁸CFU、6×10⁸CFU、7×10⁸CFU。

优选地，所述的卷曲乳杆菌总给药量不低于3×10⁸CFU；

进一步优选地，所述的卷曲乳杆菌总给药量不低于3×10⁸CFU、4×10⁸CFU、 5×10⁸CFU、6×10⁸CFU、7×10⁸CFU、8×10⁸CFU、9×10⁸CFU。

更进一步地，所述的卷曲乳杆菌的总给药量为7×10⁸CFU。

所述的药物中还可以包括其他药学上可接受的载体和辅料。

优选地，所述的药物中还可以包括5％脱脂乳和3％海藻糖。

所述的保健用品可以是日用品，如卫生巾、卫生棉条、月经杯、护垫等。

再一方面，本发明提供了用于宫腔粘连预防和/或治疗和/或预后的药物。

所述的药物中包括卷曲乳杆菌CGMCC No.15938、5％脱脂乳和3％海藻糖。

所述的药物可以为分开施用的药物。

本发明的有益效果：

本发明的卷曲乳杆菌CGMCC No.15938对宫腔粘连有较好的治疗效果，特别是针对中重度宫腔粘连，能够降低患者IUA分级评分，改善患者子宫内膜厚度，且相比于雌激素治疗的宫腔粘连复发率低。

保藏说明

菌株名称：卷曲乳杆菌Lcr-MH175；

拉丁文分类命名：Lactobacillus crispatus；

保藏中心名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；

保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；

保藏时间：2018年06月11日；

存活状态：存活。

附图说明

图1为实施例1各组小鼠的子宫实体、HE染色和MASSON染色结果。

图2为实施例1中检测小鼠子宫组织中各指标的表达结果，其中：A为TNF-α蛋白的表达水平，B为IL-1β蛋白的表达水平，C为TNF-αmRNA的表达水平， D为IL-1βmRNA的表达水平。

图3中的A为β-actin、TLR-4、NF-κB、p-NF-κB的Western-blot结果图，B、 C为根据Western-blot结果计算的灰度值。

图4为实施例1中Western-blot法检测小鼠子宫组织中TGF-β1/Smad信号通路中相关蛋白的表达结果，其中：A为各蛋白的Western-blot结果图，B-F为根据Western-blot结果计算的灰度值。

图5为实施例1中高通量测序法检测各组小鼠的阴道菌群的结果，其中：A 为小鼠的阴道菌群PCoA结果，B为门水平菌群相对丰度，C为属水平菌群相对丰度，D-F为优势菌种的相对丰度。

图6为实施例2中各组患者阴道细菌物种的Shannon指数和Simpson指数。

图7为实施例2中各组患者阴道菌群前20位在属水平上的平均丰度组成的热图。

图8为实施例2中PCoA主成分通过降维、去噪后分析各组阴道细菌物种组成成分结果。

图9为实施例2中各组患者阴道菌群高通量测序结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本发明实施例中，受试者均已签署知情同意书，且所有实验均已获得伦理委员会书面批准。

本发明中，“HE染色”即苏木精-伊红染色法，石蜡切片技术里常用的染色法之一。苏木精染液为碱性，主要使细胞核内的染色质与胞质内的核酸着紫蓝色；伊红为酸性染料，主要使细胞质和细胞外基质中的成分着红色。HE染色法是组织学、胚胎学、病理学教学与科研中最基本、使用最广泛的技术方法。

本发明中，“MASSON染色”是指用两种或三种阴离子染料混合，胶原纤维呈蓝色，肌纤维呈红色。用来显示组织中纤维以及炎性因子的染色方法之一。

本发明中，“Western-blot法”、“western blotting”均指免疫印迹法(immunoblotting test，IBT)，是在蛋白质电泳分离和抗原抗体检测的基础上发展起来一项检测蛋白质的技术。免疫印迹法具有分析容量大、敏感度高、特异性强等优点，是检测蛋白质特性、表达与分布的一种最常用的方法，如组织抗原的定性定量检测、多肽分子的质量测定及病毒的抗体或抗原检测等。免疫印迹法亦称酶联免疫电转移印斑法(enzyme linkedimmunoelectrotransfer blot，EITB)。

本发明中，“Q-PCR”指定量实时聚合酶链锁反应(Quantitative real timepolymerase chain reaction)，又称实时聚合酶链锁反应(Real-time polymerase chainreaction，简称为Real-time PCR)。Q-PCR是根据PCR扩增原理将DNA放大的同时并达到实时定量的结果，广泛应用于DNA定量。

本发明中，所述的“PCoA”即principal co-ordinates analysis，是一种研究数据相似性或差异性的可视化方法，通过一系列的特征值和特征向量进行排序后，选择主要排在前几位的特征值，PCoA可以找到距离矩阵中最主要的坐标，结果是数据矩阵的一个旋转，它没有改变样品点之间的相互位置关系，只是改变了坐标系统。通过PCoA可以观察个体或群体间的差异。

本发明中，所述的“Shannon指数”即香农多样性指数(Shannon's DiversityIndex)，是一种基于信息理论的测量指数，用于衡量种群多样性。

本发明中，所述的“Simpson指数”也称辛普森指数，指在同一个样本中随机的抽取2个个体，这两个个体来自同一个类的概率，在物种多样性评价中，兼顾丰富度和均匀度。

实施例1卷曲乳杆菌对小鼠模型的影响

1.1.实验材料：

1.1.1实验动物及饲养条件

购买60只6-8周龄SPF级BALB/c雌性实验小鼠作为实验对象，实验动物随机入组，模型组采用经腹机械损伤法建立宫腔粘连模型。各组小鼠分笼饲养，在实验期间大鼠自由进水和进食。动物饲养每天给予标准颗粒饲料。实验观察室为开放式，温度、照明、噪音、换气等条件控制在规定范围内，每日定时清洁。

1.1.2实验器械：

手术器材：

显微手术器械：显微镊2把(直头)、显微持针器1把(直头)、显微弹簧剪刀l把；

普通手术器械：蚊式钳4把、普通持针钳1把、眼科剪刀1把、纱布、棉签、 5-0丝线若干，医用无损伤缝合针，0、2-0丝线；自制不同直径微型刮勺。

1.2.实验方法

1.2.1动物分组

将实验小鼠按以下分组随机分为3组，每组12只，分别为做好标记：

1)空白对照组(为同期选择的动情期小鼠，不予任何处理)，记为control 组(C)；

2)IUA模型组(机械损伤法构建小鼠IUA模型)，记为model组(M)：

3)实验治疗组，IUA小鼠造模后，术后每晚阴道给予卷曲乳酸杆菌 1×10⁸CFU/mL，持续使用一周，记为L组。

以上各分组小鼠实验前以标准饲料喂养，自由饮水，室温24℃左右，湿度 55％左右，适应饲养一周，每日称重做好记录。一周后，空白对照组小鼠不做任何处理，其余各组小鼠均进行造模。

1.2.2动物模型制备

采用1％戊巴比妥钠(40mg/kg体重小鼠)腹腔注射麻醉后，腹卧位，腹部备皮，于腹正中处行纵行切口，用直镊分别夹起子宫输卵管端并拖出切口，充分暴露两侧子宫角。分别于子宫近输卵管端0.5cm处用眼科剪一横向切口，切口长度约为子宫直径的1/2。利用自制不同直径微型刮勺依次探入宫腔内，反复骚刮内膜，损伤子宫长度约1.0-1.5cm，操作轻柔避免穿透子宫壁，可见明显子宫内膜组织刮出则停止造模。以零号线缝合子宫切口、关腹和缝皮。

术后：置于白炽灯下予以复温15分钟。L组实验小鼠术后每晚阴道给予卷曲乳酸杆菌1×10⁸CFU/mL，连续用药1周。并予以止痛剂止痛。术后禁饮食24 小时，术后24小时后开始不限制进水，并予以流食，术后3天后饲以普通固体饲料。注意保持大鼠生活和饲养环境清洁，室内环境温度保持在22℃左右。每日观察大鼠的精神、活动情况、饮食情况、腹部情况等，死亡大鼠尽早解剖以明确原因。

1.3.标本采集及指标检测

1.3.1标本采集

空白对照组、IUA模型组及卷曲乳杆菌各治疗组标本采集：

A、阴道分泌物的采集：处死小鼠前，各组小鼠分别用移液枪小号枪头吸取 50％灭菌甘油，置于小鼠阴道口，轻轻冲洗小鼠阴道，收集阴道冲洗液，迅速将标本保存在-80℃超低温冰箱供后续实验。

B、小鼠尾静脉血：真空采集针采取2mL小鼠尾静脉血，放入无菌试管内。按1:9加入抗凝剂(EDTA、草酸钠、肝素、枸橼酸钠)，将采集血液用离心机 4℃，2500rpm离心5min，将离心好的匀浆留上清，弃下面沉淀。取上清，分装冻存备用，供后续实验。

C、子宫内膜组织的采集：各组小鼠处死后，分别于腹正中处行纵行切口，迅速分离子宫，剖开并刮取子宫内膜组织，迅速将标本置于50％灭菌甘油中，并保存在-80℃超低温冰箱供后续实验。

1.3.2指标检测

1.3.2.1血清

1)ELISA法检测各组小鼠血清中炎症因子

检测促炎因子IL-1β、TNF-α指标的变化情况。

1.3.2.2子宫内膜

1)HE染色和Masson染色观察各模型组及对照组小鼠内膜组织炎症纤维化的程度。

2)ELISA法检测各组小鼠子宫中TNF-α和IL-1β的表达水平，Q-PCR法检测各组小鼠子宫内膜组织中促炎因子IL-1β、TNF-α，的mRNA的表达。

3)Western-blot法检测纤维化相关蛋白TGF-β1、p-Smad2、Smad2、p-Smad3、Smad3、MMP-9、α-SMA及炎症相关蛋白β-actin、TLR-4、NF-κB、p-NF-κB等的表达。

4)高通量测序检测小鼠阴道分泌物及子宫内膜组织中微生物菌群的数量、种类。

1.4.实验结果及分析

1)子宫内膜HE染色和MASSON染色

通过机械损伤的方式构建宫腔粘连小鼠模型(M组)，之后通过阴道给药方式补充卷曲乳酸杆菌(L组)。通过小鼠子宫实体标本、HE染色和Masson 染色(图1)，可以观察到宫腔粘连小鼠子宫官腔变窄，色白，韧度小，子宫内膜腺体结构小而稀疏，伴有炎性细胞浸润。使用卷曲乳酸杆菌干预后的L组小鼠子宫内膜表面有完整连续的单层柱状细胞，子宫内膜腺体数量增加，炎性细胞和胶原纤维浸润减少，从而减少对子宫内膜的机械损伤。

2)为了探讨IUA的发生是否与炎症有关，我们在蛋白(ELISA)和基因 (Q-PCR)水平上测定各组小鼠子宫组织中肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白细胞介素1β(IL-1β)。结果见图2中的A-D，结果表明，宫腔操作会提升促炎因子 TNF-α(1.00-1.42，P<0.01)和IL-1β(1.00-1.52，P<0.01)合成和转录水平，而使用卷曲乳酸杆菌处理则显著降低了促炎因子合成和转录水平。

3)由于炎症因子的释放需要激活信号通路，我们使用western blotting进一步研究了典型的炎症TLR4/NF-κB信号通路。结果见图3中的A-C，结果显示，宫腔操作会提高了TLR4和p-NF-κB的表达水平。而宫腔粘连小鼠经卷曲乳酸杆菌治疗后TLR4和p-NF-κB表达相反趋势。

4)既往研究表明宫腔粘连的形成与TGF-β1/Smad信号通路密切相关。因此，通过western blotting来评估其在粘附部位的表达水平。结果见图4，结果显示：宫腔粘连组TGF-β1、p-Smad2、p-Smad3明显升高，而经益生菌处理后，L组的TGF-β1、P-smad2、P-smad3表达水平分别下调。因此，我们进一步研究了各组α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和基质金属蛋白酶-9(Matrix metalloproteinase-9， MMP-9)的表达，发现宫内手术确实上调了α-SMA，经益生菌治疗后明显改善，而MMP-9则相反。

5)在之前的研究中，我们发现IUA患者的阴道菌群与正常女性相比存在显著差异，因此本研究采用高通量测序的方法来探讨各组小鼠的阴道菌群是否存在差异。根据PCoA结果显示：相对正常组小鼠，宫腔粘连小鼠阴道菌群失衡，使用卷曲乳酸杆菌则可改善这种阴道菌群失衡情况(图5中的A)。具体来说，在门水平，宫腔粘连小鼠的阴道菌群的厚壁菌门下降，蓝藻菌门上升，在属水平，颤螺菌属和卷曲乳酸杆菌均有下降趋势；而经阴道补充卷曲乳酸杆菌的L组小鼠则可以逆转这一趋势，从而恢复阴道菌群(图5中的B-G)。

实施例2临床实验

2.1.整体的研究设计和计划

本实施例为一项单盲、随机、对照研究。

2.2.研究人群

以2020年1月1日至2021年6月30日九江妇幼保健医院的100例宫腔镜术后的病人为研究对象，其中宫腔镜手术+口服雌激素组50例，宫腔镜手术+阴道给予益生菌组50例；另外选择50例健康志愿者作为对照。

2.2.1入选标准

1)九江妇幼保健医院进行宫腔镜检查期间新诊断为宫腔粘连，并根据中国 IUA诊断分级评分标准进行宫腔粘连程度的分类，且宫腔镜检查不存在其它子宫异常情况；

2)患者在前7天内未使用阴道药物，未接受阴道治疗或进行冲洗，并且在前2天内未进行过性活动；

3)患者一般情况良好，年龄20-50岁，未合并有严重的心、肺、肾、肝功能障碍及代谢性疾病；

4)排除标准无手术禁忌和雌激素使用禁忌。

2.2.2排除标准

1)绝经期(FSH>40mIU/mL，17β-雌二醇<20pg/mL)，妊娠、哺乳期女性；

2)有试验药物或同类药物过敏史、过敏体质或现患过敏疾病者；

3)术前1月使用过抗生素；

4)雌激素使用禁忌者，如乳腺癌、子宫内膜癌、血栓性疾病高危人群；

5)入组前30天内参加其它阴道菌群临床试验；

6)患者合并有严重的心、肺、肾、肝功能障碍及代谢性疾病；

7)研究者认为不宜入选本研究的患者。

2.2.3中途退出标准和病例脱落

中途退出标准：凡入选后发现不符合入选标准的病例，需及时予以剔除，研究者应在数据整理填写剔除原因。

病例脱落：所有经筛选合格，进入试验的患者，由于多种原因未能完成临床试验的全程观察，均视为脱落病例。

病例脱落常见的原因有：

1)发生严重不良事件；

2)受试者未能按规定剂量、次数、疗程上药，不配合治疗，以致疗效不明者；

3)患者自动退出；

4)其它。

对脱落病例，研究者必须在数据填写中标明脱落原因，并在总结中加以说明。对发生严重不良事件，经随访最后判定与试验药物有关者。脱落病例比例，控制在20％以内。

2.3.实验分组及处理

2.3.1实验分组

拟入组患者：150例。

正常组：共50例以上，无治疗前后之分，取1次标本即可；

宫腔镜手术+口服雌激素组：入组患者，共50例以上；

宫腔镜手术+阴道给予益生菌组：入组患者，共50例以上。

2.3.2给药方法、剂量、疗程：

药物：阴道益生菌(每粒含益生菌活菌数不低于1×10⁸CFU，辅料为5％脱脂乳+3％海藻糖，辅料均为食品级)。

给药方法及疗程：

将第一次宫腔镜检查确诊为宫腔中重度粘连同时行宫腔粘连分离术的患者，随机分为以下各组：宫腔镜手术+口服雌激素组、宫腔镜手术+阴道给予益生菌组。术中及术后常规使用抗生素(头孢西丁+甲硝唑)24小时预防感染。宫腔镜手术+口服雌激素组术后口服戊酸雌二醇片(补佳乐，1mg/片；拜耳医药保健公司；药品批号：国药准字J20171038)剂量2mg，3次/日，连续服用28天，后半周期加用地屈孕酮片10mg，2次/日，连续使用14天；宫腔镜手术+阴道给予益生菌组手术结束后即阴道给予益生菌(1×10⁸CFU/粒/天)，每日一次，连续使用7天(如果患者依从性差可采取每隔一天给一次药，给药次数必须在3次或者 3次以上)。

2.4.研究步骤及相关检查

1)治疗前(宫腔镜手术前)

A.阴道超声评价：内膜厚度，(超声评价时间：术前月经第10-15天行经阴道超声了解子宫内膜厚度，闭经者时间不受限制，有周期性下腹痛患者在腹痛起始日的第10-15天检查内膜厚度)。

B.内膜活检明确内膜CD38(+)、CD138(+)的表达情况。

C.阴道分泌物：窥阴器打开阴道，无菌棉签尽量多的蘸取阴道分泌物置于内置无菌甘油的标本管中，使甘油完全浸泡棉签头端，尽快放入零下20度冰箱内保存。

D月经情况：包括月经周期、行经天数、伴随症状及量、色、质、有无血块。

2)治疗中(不同实验干预结束后7天后)

阴道分泌物标本：窥阴器打开阴道，无菌棉签尽量多的蘸取阴道分泌物置于内置无菌甘油的标本管中，使甘油完全浸泡棉签头端，尽快放入零下20度冰箱内保存。

3)治疗完成(术后三个月，即第三个月经周期的第10-15天)

A.阴道超声评价：内膜厚度。

B.抽血检测病人的分子水平标志物CD38(+)、CD138(+)。

C.月经情况：包括月经周期、行经天数、伴随症状及量、色、质、有无血块。

2.5.终点指标

1)主要终点指标：术后疗效(宫腔粘连复发情况)，

2)有效性评估：月经恢复情况，宫腔粘连改善(术后月经干净3天复查妇科彩超情况)情况，结合患者阴道及宫颈处菌群检测。

2.6.合并用药和治疗

避免与其他益生菌制剂，或其他能让菌粉失效或减弱的药物混合使用。

2.7.不良事件观察

定义：

不良事件：病人或临床试验受试者接受一种药品后出现的不良医学事件，但并不一定与治疗有因果关系。

严重不良事件：临床试验过程中发生需住院治疗、延长住院时间、伤残、影响工作能力、危及生命或死亡、导致先天畸形等事件。

程度：

轻度：受试者可忍受，不影响治疗，不需要特别处理，对受试者康复无影响。

中度：受试者难以忍受、需要特殊处理，对受试者康复有直接影响。

重度：危及受试者生命，致死或致残，需立即做紧急处理。

不良事件的记录及报告途径：

受试者治疗过程中可能发生临床不良事件，一旦发生不良事件(包括严重不良事件)，应在病例报告表上详细记录不良事件的发生时间、临床表现、处理经过和持续时间、转归以及与药物的关系；出现实验室检查异常者，须随访患者至检查结果恢复正常，或至用药前水平，或确定与试验药物无关。发生严重不良事件应填写严重不良事件表，并在24小时内报告申办者、伦理委员会、CFDA安监司和卫生行政部门。

2.8.统计分析

2.8.1样本含量估计

根据前期预实验，确定临床样本量每组分别为50例。

2.8.2研究数据的统计与分析

计量资料采用单因素方差分析，计数资料采用非参数检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2.9.实验结果

1)根据中国IUA分级评分标准来评估宫腔粘连的严重程度：轻度0-8分；中度9-18分；重度19-28分。参与本研究的宫腔粘连患者根据术后治疗方式不同分为：接受雌激素治疗物(E group，E)及阴道使用益生菌治疗(L group，L)，雌激素治疗的剂量根据宫腔粘连临床诊疗中国专家共识指南进行选择。阴道使用益生菌治疗的患者，相比于雌激素治疗组术后宫腔粘连复发率低，两组治疗前后子宫内膜厚度也有一定的改善。IUA术后E组与L组疗效对比如下：

^a均数±标准差，t检验。

^b数量(百分比)，X²检验。

2)根据高通量结果，使用了Shannon指数和Simpson指数来评价雌激素治疗和阴道使用益生菌治疗宫腔粘连前(I组)后与正常女性(C组)的阴道细菌物种的丰富度和多样性(图6)。结果显示，与正常女性相比宫腔粘连患者经雌激素(E组)及益生菌(L组)治疗后，患者阴道内的细菌丰富度和多样性略微有改善，益生菌改善宫腔粘连患者阴道菌群向健康人群改善效果更加明显。另外根据阴道菌群前20位在属水平上的平均丰度组成的热图(图7)所示：有益菌 Lactobacillus的相对丰度在C组中最高，在I组中最低。在I组中，下列菌的含量较高，如Prevotella、Anaercoccus、Megasphaera等。E组Gardnerella和Finegoldia 的相对丰度较高。但L组中Pseudomonas、Methylobacterium、Enterococcus、Devosia 等菌的相对含量较高。

3)利用PCoA主成分通过降维、去噪后，分析各组阴道细菌物种组成成分，结果见图8，发现宫腔粘连患者相对正常女性有很大改变，雌激素治疗和益生菌治疗后可以有效减小宫腔粘连患者与健康女性阴道菌群差异，而益生菌改善的情况更加明显。

4)高通量结果在门水平上显示，相对健康女性，宫腔粘连患者厚壁菌门相对丰度降低(p<0.05)，经过雌激素及益生菌治疗之后，厚壁菌门相对丰度上升，益生菌治疗上升幅度更大；而拟杆菌门相对丰度上升，经过雌激素及益生菌治疗之后，拟杆菌门相对丰度下降，益生菌治疗下降幅度更大。在属水平上显示，相对健康女性，宫腔粘连患者有益菌乳酸杆菌相对丰度降低，经过雌激素及益生菌治疗之后，乳酸杆菌相对丰度上升，益生菌治疗上升幅度更大；而对于宫腔粘连患者加德纳菌相对丰度上升，经过雌激素治疗之后上升幅度更大，益生菌治疗后加德纳菌相对丰度下降。具体结果见图9。因此，我们认为卷曲乳酸杆菌比雌激素干预宫腔粘连患者术后具有更大潜力。

Claims (6)

1.一株卷曲乳杆菌在制备用于宫腔粘连预防和/或治疗和/或预后的药物中的应用，其特征在于，所述的卷曲乳杆菌保藏号为CGMCC No.15938。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的药物经阴道给药。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的药物中还包括其他药学上可接受的载体和辅料。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的药物中还包括5％脱脂乳和3％海藻糖。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的宫腔粘连为中重度宫腔粘连。

6.用于宫腔粘连预防和/或治疗和/或预后的药物，其特征在于，包括卷曲乳杆菌CGMCCNo.15938、5％脱脂乳和3％海藻糖。

Images