CN112501051B - 一种益生菌复合制剂及其在阴道菌群调节以及抗hpv中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种由嗜酸乳杆菌、双歧杆菌和卷曲乳杆菌组成的益生菌复合制剂。以上乳酸菌有较强的耐酸性，对阴道上皮细胞有较好的粘附作用，能够定植于阴道中，且该益生菌复合制剂对阴道条件致病菌和HPV有抑制作用，能够调节阴道菌群结构，起到治疗和预防阴道炎和宫颈癌的作用。
Description
技术领域
本发明属于微生物领域，具体一种益生菌复合制剂在阴道菌群调节以及抗HPV中的应用
背景技术
女性阴道微环境是由多种菌群组成的独特而复杂的动态体系。健康女性阴道内以乳杆菌、双歧杆菌和优杆菌等益生菌为主要菌种，同时也存在导致妇科疾病的白假丝酵母菌、加德纳菌、大肠埃希菌、肠球菌、消化链球菌、表皮葡萄球菌等条件致病菌。在正常情况下，致病菌与益生菌二者处于动态平衡状态，益生菌能有效地抑制致病菌的增殖，实现维持阴道菌群动态平衡的调控作用。但一些环境因素可导致阴道菌群失调，引起局部异常的炎症反应及免疫应答，造成多种妇科疾病的发生，最终危害女性生殖健康。目前，抗生素仍然是治疗阴道妇科疾病的主要手段，而长时间使用可导致宿主对抗生素的耐药性，且抗生素可改变阴道的正常微生态环境造成菌群失调，从而导致治疗效果不好、复发率高等问题。
人乳头瘤病毒(HPV)是一种球形DNA病毒，其DNA与皮肤黏膜鳞状上皮细胞DNA整合后，可使皮肤黏膜发生增生紊乱，诱发癌症，故HPV感染参与宫颈病变发生发展过程，HPV具有高度的嗜上皮特性，主要感染胃肠道、生殖道、泌尿道等的上皮细胞，目前发现HPV约有近200种，有十多种与宫颈病变和宫颈癌以及外生殖器癌的发生发展密切相关，称为高危型人类乳头瘤病毒(HR-HPV)。尽管对于HPV的研究已经有30多年的时间，但目前仍暂无对其疗效确切的治疗方法。对于HR-HPV感染的治疗，目前的治疗策略仍是“治病不治毒”，即通过破坏或切除含有HR-HPV的转化细胞以及相连的病变组织进行治疗，而不是针对HR-HPV感染本身进行治疗，不能完全消除HR-HPV的感染。
发明内容
本发明旨在提供一种由嗜酸乳杆菌、双歧杆菌和卷曲乳杆菌组成的益生菌复合制剂，对治疗阴道炎和抗HPV具有显著疗效，为未来新型微生态制剂的开发与应用奠定基础。
根据本发明的一个方面，提供了一种益生菌复合制剂，按菌落总数计，包括嗜酸乳杆菌2份，双歧杆菌1份，卷曲乳杆菌2份。
本发明还提供了一种益生菌复合制剂在调节阴道菌群结构的产品中的应用。
本发明还提供了一种益生菌复合制剂在治疗HPV感染的产品中的应用。
本发明还提供了一种治疗HPV感染的产品，上述的益生菌复合制剂。
一种治疗HPV感染的产品，还包括干扰素。
本发明还提供了一种预防和治疗阴道炎的产品，上述的益生菌复合制剂。
本发明还提供了一种益生菌复合制剂在预防和治疗阴道炎的产品中的应用。
本发明还提供了一种预防和治疗宫颈癌的产品，包括上述的益生菌复合制剂。
本发明还提供了一种益生菌复合制剂在预防和治疗宫颈癌的产品中的应用。
本发明针对现有技术所存在的不足，提供一种由嗜酸乳杆菌、双歧杆菌和卷曲乳杆菌组成的益生菌复合制剂，以上乳酸菌有较强的耐酸性，对阴道上皮细胞有较好的粘附作用，能够定植于阴道中，且该益生菌复合制剂对阴道条件致病菌和HPV有抑制作用，能够调节阴道菌群结构，起到治疗和预防阴道炎和宫颈癌的作用。
附图说明
图1为嗜酸乳杆菌对阴道上皮细胞的粘附作用；
图2为双歧杆菌对阴道上皮细胞的粘附作用；
图3为卷曲乳杆菌对阴道上皮细胞的粘附作用；
图4为大鼠阴道菌群稀疏曲线；
图5为大鼠阴道菌群香农曲线；
图6为门水平上大鼠阴道菌群结构；
图7为属水平上大鼠阴道菌群结构。
具体实施方式
下面结合附图对本发明作进一步详细的说明。
实施例1菌株培养
嗜酸乳杆菌、双歧杆菌和卷曲乳杆菌是分离自酸马奶、人体阴道中的乳酸菌，研究发现以上菌株对阴道上皮细胞有较强的粘附作用，可以抑制条件致病菌和HPV的生长，为开发能够治疗阴道炎和宫颈癌的乳酸菌活菌制剂提供依据。
嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)于2010年12月14日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC No.4472，保藏地址：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏结果：存活。
动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)于2010年12月14日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC No.4473，保藏地址：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏结果：存活。
卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)于2020年09月01日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC No.20585，保藏地址：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏结果：存活。
将嗜酸乳杆菌和卷曲乳杆菌接种到MRS液体培养基中37℃培养24h，双歧杆菌接种到TPY液体培养基中37℃厌氧培养24h。以上菌株统称乳酸菌。
实施例2乳酸菌耐酸性能
取已培养24h的乳酸菌菌株发酵上清液，经4000r/min离心10min，弃去上清液，分别用pH为3、4、5的PBS缓冲液重悬，处理0、1、2、3h后进行活菌计数，嗜酸乳杆菌、双歧杆菌和卷曲乳杆菌耐酸试验活菌数结果分别如表1至3所示。健康女性阴道内pH＝3.8-4.4，阴道菌群耐酸是检测阴道乳酸菌益生特性的重要指标。从表1至3可以看出嗜酸乳杆菌、双歧杆菌和卷曲乳杆菌在pH＝3的条件下处理3个小时，活菌数下降1个数量级，在pH＝4和5的条件下处理3个小时，活菌数几乎没有变化，表明乳酸菌具有较强的耐酸性，可以在阴道中存活。
表1嗜酸乳杆菌耐酸试验活菌数结果
表2双歧杆菌耐酸试验活菌数结果
表3卷曲乳杆菌耐酸试验活菌数结果
实施例3乳酸菌的抑菌作用
指示菌的培养：将白色念珠菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、乙型溶血性链球菌、绿脓假单胞菌和痢疾志贺菌活化于LB培养基中，37℃培养24h。詹氏乳杆菌、加氏乳杆菌和格氏乳杆菌活化于MRS培养基中，37℃培养24h。
取指示菌菌液100μL分别均匀涂布于相应的固体培养基上，用牛津杯打孔(孔径6mm)，菌株发酵上清液加样量50μL/孔，4℃扩散2h，放入37℃培养箱过夜培养后，测定抑菌圈直径大小，结果如表4所示。乳酸菌可以产生过氧化氢、酸性物质(甲酸、乙酸、丙酸)以及细菌素等对阴道条件致病菌有较好的抑制作用，而对阴道中的益生菌詹氏乳杆菌、加氏乳杆菌和格氏乳杆菌无抑制作用。
表4抑菌作用测定结果
实施例4乳酸菌对阴道上皮细胞的粘附作用
乳酸菌制备：将培养好的菌液离心弃上清液，用PBS将菌液洗涤干净，用McIlvaine缓冲液(pH＝4.4)调整菌液浓度为108CFU/mL，置于4℃备用。
阴道上皮细胞的制备：将阴道上皮细胞悬浮于30ml McIlvaine缓冲液(pH＝4.4)中，旋涡混合器震荡洗涤细胞，去除内源性细菌，调整细胞浓度为105个/mL。
菌株对阴道上皮细胞的粘附作用：分别取1mL的菌悬液和阴道上皮细胞悬浮液混匀后，37℃摇床培养1h，1 000r/min离心5min，PBS缓冲液洗涤，弃去未粘附于细胞上的细菌，将沉淀物涂片，干燥，革兰氏染色，在油镜下观察菌株粘附情况，结果如图1至图3所示。阴道上皮细胞粘附细菌数均大于200，说明嗜酸乳杆菌、双歧杆菌和卷曲乳杆菌对阴道上皮细胞有较好的粘附作用，可以定植于阴道中。
实施例5大鼠阴道细菌感染模型建立
选取40只正常雌性大鼠，随机分为正常组、模型组、自然恢复组和益生菌复合制剂组，每组10只。除正常组外，其它各组用医用吸收性明胶海棉吸取50μL浓度为10mg/mL阿莫西林钠溶液塞进大鼠阴道及宫腔，每天1次，连续5d，之后用医用吸收性明胶海棉吸取50μL混合细菌溶液(乙型溶血性链球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌以1：1：2的比例配制成浓度为3.0×109CFU/mL)塞至大鼠阴道及宫腔内，每天1次，连续6d，造成大鼠阴道感染模型。正常组用医用吸收性明胶海棉吸取相同体积的生理盐水塞进大鼠阴道及宫腔，每天1次，连续11d。
实施例6大鼠阴道细菌感染模型治疗
将益生菌复合菌液浓度调整为109CFU/mL，其中嗜酸乳杆菌、双歧杆菌和卷曲乳杆菌的数量比为2:1:2。用医用吸收性明胶海棉吸取50μL菌液塞进大鼠阴道，连续6d，每天1次。自然恢复组继续给相同体积的生理盐水，连续6d，每天1次。模型组和正常组不再做任何干预。
实施例7大鼠阴道菌群测定
治疗恢复7d后，用已灭菌的医用吸收性明胶海棉浸润在无菌PBS溶液中，塞进大鼠阴道，2至5min后取出置于装有无菌PBS离心管中，分别进行乙型溶血性链球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和乳杆菌活菌计数以及高通量测序技术分析治疗并恢复后大鼠阴道菌群结构变化，计数结果如表5所示，大鼠阴道菌群结构变化如图4至7所示。
从表5可以看出，益生菌复合制剂组的乙型溶血性链球菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的数量明显少于其他组，而乳杆菌的数量明显高于其他组。
从图4和图5中可以看出，在当前测序量下可以反映出大鼠阴道中微生物信息。从图4可以看出随着测序量的增加，稀疏曲线中新增OUT的数量逐渐变缓但仍没有达到平衡状态，说明增加测序量大鼠阴道中可能有新的细菌物种被发现。但从图5香农曲线中可以看出随着测序量的增加曲线已趋于平衡，继续增加测序量也无明显变化，说明当前测序量已达到饱和状态，可以反映出大鼠阴道细菌菌群结构。
从图6可以看出，在门水平上，大鼠阴道菌群主要以变形菌门、拟杆菌门、梭杆菌门和厚壁菌门为主。经过混合菌液处理后大鼠阴道中各菌门的含量都发生了变化，说明大鼠阴道菌群结构发生了改变，大鼠细菌性阴道感染模型成功构建。
从图7可以看出，在属水平上，各组中均以凝聚杆菌属、拟杆菌属、链杆菌属、梭菌属和乳杆菌属构成主要菌群，与正常组、模型组和自然恢复组相比较，益生菌复合制剂组中乳杆菌属、梭菌属和链杆菌属数量有了明显增加，埃希氏菌属、卟啉单胞菌属、拟杆菌属和凝聚杆菌属数量有了明显的下降，说明益生菌复合制剂组可以调节大鼠阴道菌群结构。
从图6和图7也可以看出，每个实验组的大鼠阴道菌群结构都存在差异，说明大鼠细菌性阴道感染模型成功构建，通过益生菌复合制剂可以有效调节大鼠阴道菌群结构。
表5大鼠阴道菌群计数结果
实施例8益生菌复合制剂对感染HPV患者的治疗
本研究共纳入58名感染HPV患者为研究对象，年龄均在25-55岁之间，月经周期规律，经期正常，非妊娠期、哺乳期的有正常规律性生活女性，其中联合治疗组31例，干扰素组27例。
联合治疗组用重组人干扰素2α栓(奥平栓)及本公司生产的益生菌复合制剂均隔日阴道放药，以用药7天为1个疗程，治疗3个疗程，月经期停药。
干扰素组用重组人干扰素2α栓，阴道放药，隔日1次，以用药10次为1个疗程，治疗3个疗程。
所有患者于治疗后第6个月月经干净后复查HPV。根据患者HPV转阴情况，把检测患者治疗效果分为转阴、有效和无效三个等级。转阴：复诊后检查结果显示所有HPV亚型均转为阴性；有效：部分阳性HPV亚型转阴，≥1种HPV亚型仍为阳性；无效：所有HPV仍为阳性。从表6可以看出，联合治疗组的有效率和转阴率分别为90.3％和61.3％，干扰素组的有效率和转阴率分别为77.7％和40.7％，两组的有效率和转阴率具有显著差异，说明益生菌复合制剂对于治疗HPV感染具有明显作用。结果表明联合治疗组对于感染HPV患者的治疗效果较单纯使用干扰素效果更好，说明益生菌复合制剂对HPV有明显抑制作用。
表6两种治疗方法效果比较
有效率χ2＝0.290，P＝0.591；转阴率χ2＝4.453，P＝0.034。
由本发明提供的益生菌复合制剂具有较强的抑菌作用，对于阴道中大部分条件致病菌均有抑制作用，但对阴道中的益生菌乳杆菌无抑制作用。
由本发明提供的益生菌复合制剂对HPV有抑制作用，与干扰素配合治疗感染HPV的患者具有明显作用。
由本发明提供的益生菌复合制剂对酸性环境有较强的耐受性，对阴道上皮细胞有较高的粘附能力，因此该菌可定植于阴道中调节阴道菌群，起到治疗和预防阴道炎和宫颈癌的作用。
以上所述的仅是本发明的一些实施方式。对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
Claims (7)
1.一种益生菌复合制剂，其特征在于，按菌落总数计，由嗜酸乳杆菌2份，动物双歧杆菌1份，卷曲乳杆菌2份组成，所述嗜酸乳杆菌的保藏号为CGMCC No.4472，所述动物双歧杆菌的保藏号为CGMCC No.4473，所述卷曲乳杆菌的保藏号为CGMCC No.20585。
2.如权利要求1所述的一种益生菌复合制剂在制备调节阴道菌群结构的产品中的应用。
3.如权利要求1所述的一种益生菌复合制剂在制备治疗HPV感染的产品中的应用。
4.一种治疗HPV感染的产品，包括权利要求1所述的益生菌复合制剂。
5.如权利要求4所述的一种治疗HPV感染的产品，还包括干扰素。
6.一种预防和治疗阴道炎的产品，包括权利要求1所述的益生菌复合制剂。
7.如权利要求1所述的一种益生菌复合制剂在制备预防和治疗阴道炎的产品中的应用。
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