CN117568242B - 改善女性乳腺炎的乳酸片球菌jypa-30及其菌剂、应用 - Google Patents

改善女性乳腺炎的乳酸片球菌jypa-30及其菌剂、应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及微生物应用技术领域，具体涉及一种改善女性乳腺炎的乳酸片球菌JYPA‑30及其菌剂、应用。乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）JYPA‑30于2023年11月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.28847。乳酸片球菌JYPA‑30可用于制备治疗人或哺乳动物乳腺炎的产品。经试验验证，该乳酸片球菌JYPA‑30能够有效减轻乳腺炎导致的体重减轻、体温升高，缓解乳腺炎小鼠血液中炎症细胞增多和乳腺组织中的炎症因子增加，有助于平衡乳汁菌群、恢复乳汁质量。

Description

改善女性乳腺炎的乳酸片球菌JYPA-30及其菌剂、应用
技术领域
本发明涉及微生物应用技术领域，具体涉及一种改善女性乳腺炎的乳酸片球菌JYPA-30及其菌剂、应用。
背景技术
乳腺炎是女性常见的疾病，根据病因的不同可以分为急性化脓性乳腺炎、乳晕旁瘘管、浆细胞性乳腺炎等，最常见的是急性化脓性乳腺炎。急性化脓性乳腺炎常发生于哺乳期，特别是初产妇产后1~2个月内，故又叫急性哺乳期或产褥期化脓性乳腺炎，中医称为“乳痈”。初产妇急性乳腺炎的发病率高达2%~4%，比经产妇乳腺炎多1倍。乳汁淤积伴发细菌感染而发病，呈急性炎症表现，红肿热痛，寒战高热，早期可以手法排乳、中药治疗，化脓以后则需要切开引流。发病后不仅产妇本人痛苦异常，而且不能继续哺乳，影响婴儿的健康。
传统治疗乳腺炎的方法多采用抗生素做消炎治疗，最常用的抗生素为青霉素、红霉素、头孢类等，抗生素虽然药效快、作用明显，但是治标不治本，导致病情反反复复，而且采用抗生素后，势必对喂养造成一定的影响。因此，很多患者选择中药治疗法对乳腺炎进行治疗，中药法安全、治疗彻底，但是治疗乳腺炎的中药组合物成分复杂，容易出现药方不匹配；而且中药法治疗疗程较长、见效慢，不适用于哺乳期的乳腺炎患者。
发明内容
针对现有乳腺炎治疗方法中，抗生素治疗导致病情易反复而中药治疗疗程长、见效慢的问题，本发明提供一种改善女性乳腺炎的乳酸片球菌JYPA-30及其菌剂、应用。
第一方面，本发明提供一种改善女性乳腺炎的乳酸片球菌JYPA-30，乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）JYPA-30于2023年11月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.28847，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
第二方面，本发明提供一种乳酸片球菌JYPA-30菌剂，包括上述乳酸片球菌JYPA-30的菌粉和葡萄糖，乳酸片球菌JYPA-30菌剂中菌体数量为100~200亿/g。
进一步的，菌粉的制备方法包括以下步骤：
（1）制备MRS液体培养基和MRS平板培养基；
（2）取保存的乳酸片球菌JYPA-30在MRS平板培养基上活化，将活化后的菌接种于MRS液体培养基中，在37℃条件下有氧培养36~48h，获得菌液；
（3）将菌液离心后，收集菌体，使用无菌生理盐水洗涤后，重悬于复原脱脂乳中，获得悬浊液，调整悬浊液浓度，经冷冻干燥获得菌粉。
进一步的，步骤（1）中，MRS液体培养基的制备方法为：将蛋白胨10g、牛肉粉5g、三水醋酸钠5g、七水磷酸氢二钾2g、吐温80 1mL、四水硫酸锰0.05g、柠檬酸三铵2g、葡萄糖20g、七水硫酸镁0.2g、蒸馏水1000mL混合后，调pH为6.8，在121℃、0.1MPa下灭菌20min，制得MRS液体培养基；MRS平板培养基的制备方法为：在制得的MRS液体培养基中添加15g/L的琼脂，倒入培养皿中，放凉后即得MRS平板培养基。
进一步的，步骤（2）中，活化后的菌的接种量为1%~2%。
进一步的，步骤（3）中，调整悬浊液的浓度为1.0×1010~2.0×1010cfu/mL。
第三方面，本发明还提供一种上述乳酸片球菌JYPA-30在制备治疗人或哺乳动物乳腺炎的产品中的应用。
进一步的，治疗人或哺乳动物乳腺炎的产品为平衡乳汁微生物菌群、降低乳腺组织炎症因子水平的产品。
本发明的有益效果在于：
经试验验证，本发明提供的改善女性乳腺炎的乳酸片球菌JYPA-30能够有效减轻乳腺炎导致的体重减轻、体温升高，缓解乳腺炎小鼠血液中炎症细胞增多和乳腺组织中的炎症因子增加，有助于平衡乳汁菌群、恢复乳汁质量。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明中的技术方案，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
实施例1 菌种的分离鉴定
1、菌株筛选及纯化
（1）取样：2018年5月取山东省聊城市东昌府区腌蒜，备用；
（2）制备样品：
①取灭菌后的生理盐水（0.85%）至于无菌三角瓶中，然后将步骤（1）采集的样品1g加入其中，振荡，待用；
②对步骤①的溶液稀释制成不同浓度梯度的样品，分别为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7，标号分别为1#、2#、3#、4#、5#、6#、7#，待用。
（3）制备MRS平板培养基：
蛋白胨10g、牛肉粉 5g、三水醋酸钠5g、七水磷酸氢二钾2g、吐温80 1mL、四水硫酸锰0.05g、柠檬酸三铵2g、葡萄糖20g、七水硫酸镁0.2g、琼脂15g、蒸馏水1000mL；将上述原料混合后，自然pH，搅拌菌液后，在121℃、0.1MPa下灭菌20min，将灭菌后的培养基倒入平皿中，放凉后待用。
（4）培养菌株：将1#、2#、3#、4#、5#、6#、7#号溶液分别使用涂布器涂布在MRS平板培养基中，于37℃、厌氧条件下培养48h；
（5）按照以下菌落特征挑选菌落：
菌落直径0.5~1.5mm，菌落呈乳白色，圆形隆起，边缘整齐、有光泽。
（6）分离纯化
根据步骤（5）的菌落和生化特征挑取5个单菌落，采用划线法接种至MRS平板培养基上纯化，于37℃、厌氧条件下培养48h，挑取单菌落，置于甘油管中-70℃保藏。
2、鉴定
将分离纯化后得到的单菌落送去鉴定，鉴定单位：济南天一生物科技有限公司，鉴定过程中，使用的引物如下：
引物序列：
27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'
1492R：5'-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3'；
得到的菌株JYPA-30的基因序列为：
TGCAGTCGAACGAACTTCCGTTAATTGATTATGACGTGCTTGCACTGAATGAGATTTTAACACGAAGTGAGTGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCAGAAGCAGGGGATAACACCTGGAAACAGATGCTAATACCGTATAACAGAGAAAACCGCCTGGTTTTCTTTTAAAAGATGGCTCTGCTATCACTTCTGGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGATGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTAATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGCAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAGCTCTGTTGTTAAAGAAGAACGTGGGTGAGAGTAACTGTTCACCCAGTGACGGTATTTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTCTTTTAAGTCTAATGTGAAAGCCTTCGGCTCAACCGAAGAAGTGCATTGGAAACTGGGAGACTTGAGTGCAGAAGAGGACAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTGTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCATGGGTAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGATGATTACTAAGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGTAATCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAAGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCTACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCTTCTGCCAACCTAAGAGATTAGGCGTTCCCTTCGGGGACAGAATGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATTACTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAGTGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGATGGTACAACGAGTTGCGAAACCGCGAGGTTTAGCTAATCTCTTAAAACCATTCTCAGTTCGGACTGTAGGCTGCAACTCGCCTACACGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGAGAGTTTGTAACACCCAAAGCCGGTGGGGTAACCTTT
鉴定结果为：该菌株被鉴定为乳酸片球菌Pediococcus acidilactici。
将鉴定后的菌株命名为乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）JYPA-30，送至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏信息如下；
分类命名：乳酸片球菌Pediococcus acidilactici，保藏日期：2023年11月2日，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，保藏编号：CGMCC No.28847。
实施例2 制备乳酸片球菌JYPA-30菌剂
（1）制备MRS液体培养基和MRS平板培养基：将蛋白胨10g、牛肉粉5g、三水醋酸钠5g、七水磷酸氢二钾2g、吐温80 1mL、四水硫酸锰0.05g、柠檬酸三铵2g、葡萄糖20g、七水硫酸镁0.2g、蒸馏水1000mL混合后，调pH为6.8，在121℃、0.1MPa下灭菌20min，制得MRS液体培养基；在制得的MRS液体培养基中添加15g/L的琼脂，放凉后即得MRS平板培养基。
（2）取保存的乳酸片球菌JYPA-30在MRS平板培养基上活化，将活化后的菌按照1%的接种量接种于MRS液体培养基中，在37℃条件下有氧培养48h，获得菌液。
（3）将菌液离心后，收集菌体，使用无菌生理盐水洗涤后，重悬于15%（w/w）的复原脱脂乳中，获得悬浊液；调整悬浊液的浓度为1.0×1010cfu/mL，获得菌悬液，将菌悬液冷冻干燥后，获得菌粉。
（4）将菌粉与葡萄糖（购自山东西王糖业有限公司）混合，制成乳酸片球菌JYPA-30菌剂，该乳酸片球菌JYPA-30菌剂中菌体数量为100亿/g。
实施例3 制备乳酸片球菌JYPA-30菌剂
（1）制备MRS液体培养基和MRS平板培养基：将蛋白胨10g、牛肉粉5g、三水醋酸钠5g、七水磷酸氢二钾2g、吐温80 1mL、四水硫酸锰0.05g、柠檬酸三铵2g、葡萄糖20g、七水硫酸镁0.2g、蒸馏水1000mL混合后，调pH为6.8，在121℃、0.1MPa下灭菌20min，制得MRS液体培养基；在制得的MRS液体培养基中添加15g/L的琼脂，倒入培养皿中，放凉后即得MRS平板培养基。
（2）取保存的乳酸片球菌JYPA-30在MRS平板培养基上活化，将活化后的菌按照2%的接种量接种于MRS液体培养基中，在37℃条件下有氧培养48h，获得菌液。
（3）将菌液离心后，收集菌体，使用无菌生理盐水洗涤后，重悬于15%（w/w）的复原脱脂乳中，获得悬浊液；调整悬浊液的浓度为2.0×1010cfu/mL，获得菌悬液，将菌悬液冷冻干燥后，获得菌粉。
（4）将菌粉与葡萄糖（购自山东西王糖业有限公司）混合，制成乳酸片球菌JYPA-30菌剂，该乳酸片球菌JYPA-30菌剂中菌体数量为200亿/g。
实施例4 乳酸片球菌JYPA-30对乳腺炎小鼠的影响
1、试验处理
选取90只8周龄的ICR小鼠（购自扬州大学）分娩后泌乳7~9天，正常给与饲养和饮水，饲养室内温度控制在20~26℃，每日光照12h。
适应性喂养一周后，将小鼠随机分为3组，分别为对照组、模型组和试验组，每组30只，每组处理如下：
对照组：将50μL无菌生理盐水缓慢注入到乳导管中；
模型组：注射器吸取50μL的脂多糖（LPS）缓慢注入到乳导管中；
试验组：注射器吸取50μL的脂多糖（LPS）缓慢注入到乳导管中，同时灌胃给予实施例2制备的乳酸片球菌JYPA-30菌剂，每只小鼠的干预剂量为2×108CFU/d，直至第25天试验结束。
2、指标检测
（1）体重检测
于试验进行的第1天、第10天、第20天和第25天分别称量每组小鼠的体重，结果如表1所示：
表1 小鼠体重变化
注：#表示与对照组对比，P＜0.01。
结论：随着周龄增长，试验组小鼠和对照组小鼠都稳步增长，而模型组小鼠体重不增长。由此可知，乳酸片球菌JYPA-30能够有效减轻乳腺炎对小鼠身体发育方面的影响。
（2）肛温检测
用电子体温计分别于第1天、第10天、第15天、第20天和第25天测量5个时间点的小鼠直肠的温度，每个时间点测量3次肛温取平均值。
表2 小鼠肛温变化
结论：第1天三组小鼠体温无明显差异；第10天模型组小鼠体温明显高于对照组和试验组，之后一直持续高温；试验组小鼠在第15天体温达到最大值（37.2±0.06℃），之后体温开始降低，第25天体温和对照组无明显差异。由此说明，乳酸片球菌JYPA-30能够有效缓解乳腺炎小鼠体温升高。
（3）血液指标的检测
在试验25天，采集小鼠的新鲜血液立即送往医院进行血液指标的检测，检测项目包括白细胞、中性粒细胞和C反应蛋白，检测结果如表3所示。
表3血液指标检测结果
注：#表示与对照组对比，P＜0.01。
结论：模型组小鼠的血液中白细胞、中性粒细胞和C反应蛋白水平均比对照组高，而试验组小鼠的白细胞、中性粒细胞和C反应蛋白水平与对照组小鼠无显著差异，说明乳酸片球菌JYPA-30能有效缓解乳腺炎小鼠血液中炎症细胞增多的情况。
（4）乳汁成分及微生物菌群的变化
围绕小鼠患侧乳房进行基本的消毒处理，在无菌状况下进行操作，将乳房溢液标本取出。在清洁乳头与乳房时，先使用浓度为75%的酒精处理，然后使用无菌水进行处理。等待 3 分钟后，首先去掉先取得的可能存在污染的几滴乳汁，之后获取中段位置的乳汁，对于各个乳样都应当获取2个10μL样本，保藏到存在缓存液的相关灭菌冻存管内，在这之后的1小时内放入到-80℃环境下存储待用。将每只小鼠一个10μL乳汁样本发往第三方检测公司SGS通标标准技术服务（青岛）有限公司进行金黄色葡萄球菌活菌数、双歧杆菌活菌数的检测，结果见表4；另一个10μL乳汁样本送往医院进行乳汁成分的检测，结果见表5。
表4 小鼠乳汁微生物菌群检测结果
注：#表示与对照组对比，P＜0.01。
结论：与对照组小鼠相比，模型组小鼠乳汁中的金黄色葡萄球菌显著增多、双歧杆菌数量显著减少，而试验组小鼠乳汁中的金黄色葡萄球菌和双歧杆菌数量与对照组无显著差异，说明乳酸片球菌JYPA-30能使乳腺炎小鼠乳汁中的有益菌增多、有害菌减少，有效避免乳腺炎小鼠的菌群失衡。
表5 小鼠乳汁成分检测结果
注：#表示与对照组对比，P＜0.01。
结论：相比于对照组小鼠，模型组小鼠的乳汁中蛋白质含量降低，免疫球蛋白含量减少，脂肪含量增多，水分含量增多，而试验组小鼠免疫球蛋白含量趋近对照组，其他成分含量也与对照组小鼠差异不大，说明乳酸片球菌JYPA-30能有效提高乳腺炎小鼠中免疫球蛋白的含量，使乳汁质量趋近于正常小鼠。
（5）乳腺组织中炎症因子的变化
试验进行第25天，取完血液样本和乳汁样本后，将小鼠颈椎脱臼处死，迅速取出乳腺组织，称重后放入组织匀浆器中，加入6倍无菌生理盐水，低温研磨，匀浆在4℃中3000r/min离心30min，取上清液用于炎症因子ELISA的检测。乳腺炎症因子IL-Iβ、IL-6、TNF-α含量与炎症反应及免疫水平密切相关，使用ELISA试剂盒（购自Biolegend公司）检测上清液中IL-Iβ、IL-6、TNF-α含量，用Tecan酶标仪（D=450nm）测定各炎症因子的变化情况。
表6 小鼠乳腺组织中的炎症因子水平
注：#表示与对照组对比，P＜0.01。
结论：模型组小鼠乳腺组织中的IL-Iβ、IL-6、TNF-α水平均明显高于对照组，而试验组小鼠IL-Iβ、IL-6、TNF-α含量与对照组小鼠无显著差异，说明乳酸片球菌JYPA-30能明显降低乳腺炎小鼠的乳腺组织的IL-Iβ、IL-6、TNF-α含量，缓解炎症。
尽管通过优选实施例的方式对本发明进行了详细描述，但本发明并不限于此。在不脱离本发明的精神和实质的前提下，本领域普通技术人员可以对本发明的实施例进行各种等效的修改或替换，而这些修改或替换都应在本发明的涵盖范围内/任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1. 一种改善女性乳腺炎的乳酸片球菌JYPA-30，其特征在于，乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）JYPA-30于2023年11月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.28847，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
2.一种乳酸片球菌JYPA-30菌剂，其特征在于，包括如权利要求1所述的乳酸片球菌JYPA-30的菌粉和葡萄糖，乳酸片球菌JYPA-30菌剂中菌体数量为100~200亿/g。
3.如权利要求2所述的一种乳酸片球菌JYPA-30菌剂，其特征在于，菌粉的制备方法包括以下步骤：
（1）制备MRS液体培养基和MRS平板培养基；
（2）取保存的乳酸片球菌JYPA-30在MRS平板培养基上活化，将活化后的菌接种于MRS液体培养基中，在37℃条件下有氧培养36~48h，获得菌液；
（3）将菌液离心后，收集菌体，使用无菌生理盐水洗涤后，重悬于复原脱脂乳中，获得悬浊液，调整悬浊液浓度，经冷冻干燥获得菌粉。
4. 如权利要求3所述的一种乳酸片球菌JYPA-30菌剂，其特征在于，步骤（1）中，MRS液体培养基的制备方法为：将蛋白胨10g、牛肉粉5g、三水醋酸钠5g、七水磷酸氢二钾2g、吐温80 1mL、四水硫酸锰0.05g、柠檬酸三铵2g、葡萄糖20g、七水硫酸镁0.2g、蒸馏水1000mL混合后，调pH为6.8，在121℃、0.1MPa下灭菌20min，制得MRS液体培养基；MRS平板培养基的制备方法为：在制得的MRS液体培养基中添加15g/L的琼脂，倒入培养皿中，放凉后即得MRS平板培养基。
5.如权利要求3所述的一种乳酸片球菌JYPA-30菌剂，其特征在于，步骤（2）中，活化后的菌的接种量为1%~2%。
6.如权利要求3所述的一种乳酸片球菌JYPA-30菌剂，其特征在于，步骤（3）中，调整悬浊液的浓度为1.0×1010~2.0×1010cfu/mL。
7.一种如权利要求1所述乳酸片球菌JYPA-30在制备治疗哺乳动物乳腺炎的产品中的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，治疗哺乳动物乳腺炎的产品为平衡乳汁微生物菌群、降低乳腺组织炎症因子水平的产品。
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