CN113583964A - 利用miR-212及其靶基因调控卵巢颗粒细胞的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种利用miR‑212及其靶基因调控卵巢颗粒细胞的方法，属于细胞工程和生物工程的技术领域，本发明以miR‑212为研究对象，首次实现利用miR‑212在猪卵巢颗粒细胞增值方面的方法，该方法包括步骤：将miR‑212转染入卵巢颗粒细胞中。本发明提供了一种显著的调控卵巢颗粒细胞的增值，本发明方法简单、易于实施推广。本发明的研究表明，通过对猪卵巢颗粒细胞进行分离、培养，转染miR‑212后显著促进颗粒细胞的增殖能力，为后续卵泡发育相关研究提供理论基础。

Description

利用miR-212及其靶基因调控卵巢颗粒细胞的方法

技术领域

本发明属于细胞工程以及基因工程技术领域，具体涉及一种利用 miR-212及其靶基因调控卵巢颗粒细胞的方法。

背景技术

卵泡颗粒细胞是卵泡发育和维持正常功能的重要条件，对维持卵 巢繁殖功能发挥着极其重要的作用。有研究者发现，卵泡闭锁退化的 过程是由卵泡中颗粒细胞的凋亡触发的，颗粒细胞的凋亡最终会导致 卵泡的闭锁。在卵泡颗粒细胞中可以分泌类固醇激素、促卵泡素和促 黄体素等激素，还可以产生一些细胞因子(孕酮、干细胞生长因子和 表皮生长因子等)，调控着卵泡和卵母细胞的生长发育。

在生猪生产中仔猪的出生率与生产的经济效益显著正相关，如何 提高产子数在现代猪遗传育种工作中都扮演至关重要的角色。目前对 于提高母猪产子数主要依赖遗传辅助标记选择，对于标志基因纯合或 杂合个体的筛选以及与产子性能较好的猪种如太湖猪等杂交育种，除 此之外暂无极为显著的提高方法。然而，母猪的产子数还与卵泡的发 育相关，卵巢颗粒细胞直接影响卵泡的发育，因此探究影响卵巢颗粒 细胞增殖的条件在生产实践中对于促进卵泡发育、排卵具有重要意义。

miRNA是一类长度22nt左右的小分子绝大多数不具备编码能力 的小分子RNA，主要依赖于2-8位的种子序列与编码基因的3’端非 翻译区相结合，从而沉默复合靶基因发挥生物学功能。大量研究表明miRNA在调控卵泡发育、闭锁等生物过程中扮演重要角色，并且在 卵巢癌症等相关领域也有大量报道。然而，如何利用miRNA调控卵 巢颗粒细胞的增值，目前仍待研究。

发明内容

针对现有技术的缺点和需求，本发明的目的在于提供一种利用 miR-212及其靶基因调控卵巢颗粒细胞的方法。

为了实现上述目的，本发明提供的方案如下：

将miR-212转染入卵巢颗粒细胞中。

作为本发明的优选技术方案，在进行所述转染前，还包括分离、 接种、传代培养和收样操作。

作为本发明的一个实施方案，所述巢颗粒细胞为猪卵巢颗粒细胞。

作为本发明的一个实施方案，进行所述分离操作时，按照如下方 法进行：

1)于母猪屠宰后取出卵巢，置于PBS中清洗后，将卵巢保存在 38摄氏度的生理盐水中于1小时内分离卵巢颗粒细胞；

2)将卵巢放到预热好的37度生理盐水中清洗干净后，用手术刀 将卵巢表面每间隔1毫米均匀轻轻划破，收集卵泡液，将吸取后的卵 泡液放入15ml离心管，1000rpm离心8分钟，弃上清，用预热的PBS 轻轻吹打均匀清洗离心重复两次；

3)配制的卵巢颗粒细胞培养液为20％FBS加DMEM以及1％的 抗生素。

作为本发明的一个实施方案，在进行接种前，待卵巢颗粒细胞增 殖到85％后，弃掉原培养基，用PBS清洗两次后用巴氏吸管加入1ml 胰酶，放入37度细胞培养箱，放置2min后加入新鲜培养基终止消化， 将细胞吹打下来，将悬液吸入15ml离心管；最终将细胞用培养液冲 匀接种到12孔板中进行培养。

作为本发明的一个实施方案，在细胞转染前一天，将处于细胞接 种至12孔培养板中，当增殖细胞密度达到35～45％时，进行转染，48 小时候后收样。

作为本发明的优选实施方案，在进行转染时，按照 lipofectamine3000试剂盒的说明书进行。

作为本发明的优选实施方案，所述抗生素为青霉素、链霉素和两 性霉素。

作为本发明的优选实施方案，进行所述收样时，将RNAisoPlus 加入每个孔，裂解一分钟后反复吹打吸出，并将样品于-80℃下保存。

作为本发明的优选实施方案，在步骤(2)中，细胞密度培养到 40％。

本发明的有益效果：

本发明提供了一种显著的调控卵巢颗粒细胞的增值，本发明方法 简单、易于实施推广。本发明的研究表明，通过对猪卵巢颗粒细胞进 行分离、培养，转染miR-212后显著促进颗粒细胞的增殖能力，为后 续卵泡发育相关研究提供理论基础。

附图说明

图1为miR-212二级结构

图2为本发明转染效率实验结果图；

图3为对卵巢颗粒细胞转染mimics inhibitor mimics NC，inhibitor NC 加入CCK试剂检测细胞增殖情况实验结果图；

图4为对卵巢颗粒细胞转染mimics inhibitor mimics NC，inhibitor NC 检测CyclinD基因表达量实验结果图；

图5对卵巢颗粒细胞转染mimics inhibitor mimics NC，inhibitor NC 检测CyclinE基因表达量实验结果图；

图6为使用双荧光素酶报告系统检测miR-212与FGF16的靶标关系 图；

图7为对卵巢颗粒细胞转染FGF16 siRNA干扰其表达后检测CyclinD 基因表达量实验结果图；

图8为对卵巢颗粒细胞转染FGF16 siRNA干扰其表达后检测P53蛋 白表达量实验结果图。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明进行具体描述，有必要在此指出的是以 下实施例只是用于对本发明进行进一步的说明，不能理解为对本发明 保护范围的限制，该领域的技术熟练人员根据上述发明内容所做出的 一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

实施例1

一、实验方案

1.猪卵巢颗粒细胞分离及培养

于母猪屠宰后取出卵巢，置于PBS中清洗后，将卵巢保存在38 摄氏度的生理盐水中于1小时内带回实验室分离卵巢颗粒细胞。

将卵巢放到预热好的37度生理盐水中清洗干净后，用手术刀将 卵巢表面每间隔1毫米均匀轻轻划破，收集卵泡液，将吸取后的卵泡 液放入15ml离心管，1000rpm离心8分钟，弃上清，用预热的PBS 轻轻吹打均匀清洗离心重复两次。

配制的卵巢颗粒细胞培养液为20％FBS加DMEM以及1％三抗 (青霉素、链霉素和两性霉素)

2.细胞接种、传代、转染、收样

待卵巢颗粒细胞增殖到85％弃掉原培养基，用PBS清洗两次后 用巴氏吸管加入1ml胰酶，放入37度细胞培养箱，2min后，加入新 鲜培养基终止消化，将细胞吹打下来，将悬液吸入15ml离心管。最 终将细胞用培养液冲匀接种到12孔板中进行培养。细胞转染前一天， 将处于细胞接种至12孔培养板中(根据实验需求接种相应的密度)， 当增殖细胞密度达到40％时，即可进行第一次转染miR-212，48小时 候收样。收样，将RNAisoPlus加入每个孔，裂解一分钟后反复吹打 吸出，并将样品于-80℃保存。

3.细胞转染

待细胞密度长到40％开始转染，转染按照lipofectamine3000试剂 盒的说明书进行，48小时后进行收样处理或进行后续检测。

二、检测方案

1.RNA抽提及反转录

TRIpure试剂盒被用来提取组织和细胞总RNA，具体步骤如下：

(1)组织匀浆：取50-100mg组织在研磨中磨至粉末(边加液 氮边磨)，给磨完后的样品中加入1ml的TRIpure。12孔C2C12细胞 样品则直接在细胞培养板孔里加入1ml的TRIpure溶解，通过移液枪 移出细胞裂解物至EP管中。

(2)蛋白质/RNA/DNA分离阶段：将加了TRIpure的匀浆样品 在15-30℃条件下孵育5分钟后每1ml TRIpure加200微升氯仿。用 涡旋仪剧烈涡旋震荡使其充分裂解，随后常温下孵育2～3分钟。 12,000×g的离心力高速冷冻离心15分钟(2-8℃)。

(3)上述溶液离心后会得到三层水样溶液，用移液枪轻轻将最 上层水样层转移到干净的EP管中。随后向其加入异丙醇的量是上述 裂解液的一半量。混合的溶液上下轻轻颠倒混匀，常温孵育10分钟， 离心10分钟(12,000×g)。这一步骤用于RNA的沉淀。

(4)上述离心后的溶液轻轻倒掉上层悬液，加入75％的乙醇(1ml) 洗涤一次。500×g离心5分钟。这一步骤用于RNA的漂洗。

(5)倒掉上述离心管中的上清液，在空气中干燥几分钟。用移 液枪吸取30毫升无RNA酶的水溶解RNA，用NanoDrop ND-2000 分光光度计检测RNA质量和浓度，最后保存RNA(-80℃)。

2.反转录PCR

2.1 mRNA反转录

1st Strand cDNA Synthesis试剂盒被用来反转录 mRNA，具体步骤如下：

(1)去除基因组DNA反应

为了保证实验的质量，在冰上进行操作，将反应试剂加入到PCR 管中，瞬离混匀后在42℃下反应2分钟。

(2)cDNA制备

在上述反应PCR管中继续加入反应体系试剂。瞬离混匀。反应 程序为37℃，15min；85℃,5s，反应结束后将其稀释至100ul，混匀 并-20℃保存。

2.2 miRNA反转录

按照miRNA RT-QPCR试剂盒说明书进行miRNA反转录。反应 液在37℃的条件下反应60min；85℃反应5min。反应结束后，稀 释至100ul，混匀并分装，-20℃保存和备用。

3.CCK-8实验

将颗粒细胞接种到96孔细胞板中，每个处理9个重复，待细胞 密度40％左右，进行细胞转染，48小时后使用庄盟CCK-8试剂盒检 测细胞上清液吸光度。

4.EDU实验

(1)将卵巢颗粒细胞接种到96孔细胞板里，转染细胞后要染色 的细胞孔里加入100μL EdU稀释液进行反应。EdU稀释液可按照EdU 溶液(试剂A)与细胞培养基比例为1：1000的配置，最终浓度为 50μM；

(2)PBS在37℃水浴锅中预热，并用PBS清洗细胞1-2次，脱 色摇床洗1-3次；

(3)每孔加入50-100μL的4％多聚甲醛放置室温孵育，30min 后丢弃甲醛，用PBS清洗3-5次，脱色摇床摇2-3次；

(4)每孔加入100μL现配的Apollo液染色(此燃料需现配现用， 500μL体系的Apollo染色液配制顺序：469μL去离子水；25μL试剂 B；5μL试剂C；1.5μL试剂D；5mg试剂E)，避光处理且室温、孵 育30min后丢弃染液，每孔加入0.5％TritonX-100 100μL，15分钟后在脱色摇床上清洗3-4次；

(5)核燃料的配置是Hochest(试剂F)与去离子水按1：100 配置，每孔加入50μL核染液，避光处理且室温、孵育30min后丢弃 染液，每孔加入100μL PBS洗2-3次；

(6)在荧光显微镜下观察并照相。

5.qRT-PCR

5.1mRNA荧光定量

配制PCR反应液。混好的反应体系置于CFX96 Real-Time PCR detection system仪器上完成。PCR反应程序分为两步。首先：预变性 反应为95℃3min；其次：PCR反应为40次循环，95℃下30s，其中 退火温度根据温度梯度反应结果选取最佳退火温度。PCR反应结果以 β-actin为内参来校正结果。mRNA的相对表达量通过2-ΔΔCt方法计 算。

5.2miRNA荧光定量

混好的反应体系置于CFX96 Real-Time PCR仪器上完成。同时， 以U6作为miRNA定量的内参，采用2-ΔΔCt方法计算miRNA相对 表达量。每个样本都做三次技术性重复。miRNA的上游引物是miRNA 本身的成熟序列，而下游引物是试剂盒中提供的通用引物。

6.WesternBlot

6.1蛋白提取

1).用PBS冲洗细胞2-3次，最后一次清洗完，倒掉PBS，用 移液器尽量吸干残留液体；

2).加入适当体积的RIPA裂解液(使用前数分钟内加入蛋白酶抑 制剂)于培养板/培养瓶内3-5min。期间反复晃动培养板/瓶，使试剂 与细胞充分接触；

3).用细胞刮刀将细胞刮下，转移到1.5ml离心管中；

4).冰上裂解30min，期间用移液器反复吹打，确保细胞完全裂解。 然后12000rpm,4℃，离心10min，收集上清，即为总蛋白溶液。

6.2蛋白浓度测定

取未变性的蛋白溶液，用BCA蛋白浓度测定试剂盒检测。

6.3蛋白变性

将蛋白溶液按照4:1的比例加入5*还原型蛋白上样缓冲液，沸 水浴变性15min，收入-20℃冰箱保存备用；

6.4SDS-PAGE电泳

1).清洗玻璃板；

2).制胶与上样；

2.1)待玻璃板自然晾干后，将一块凹玻璃板和一块平玻璃组成一 对，放入制胶器，插入斜插板将玻璃板固定，检查底部是否对齐，避 免漏胶；

2.2)根据实验需求配制不同浓度的分离胶，加入TEMED后立即 混合均匀，将分离胶灌到适当的的高度，灌胶之前可以用梳子试一下， 梳子齿距离分离胶上液面大约5-8mm为宜。然后将纯水缓慢均匀加 入到分离胶上层，直至加满。大约30min后待分离胶凝固即可倒去 分离胶上层水并用吸水纸将剩余水吸干；

2.3)按照上述配方配制5％的浓缩胶，加入TEMED后立即混合 均匀，即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中， 注意梳子下面不能有气泡。

2.4)等浓缩胶凝固好，取下制胶器，小心拔掉梳子，即可准备开 始电泳；

2.5)将制胶器放入电泳槽后加足够的电泳液后上样电泳。浓缩胶 电压75V，分离胶用120V。电泳至溴酚蓝里最底部大约1cm即可终 止电泳，进行转膜。

6.5转膜

1).准备6张7×9cm的滤纸和一张大小适中的PVDF(0.45um) 膜，PVDF膜在使用之前要先用甲醇活化2min；

2).在加有转移液的盆里放入转膜用的夹子，两块海绵垫，一支玻 璃棒，滤纸和经过活化的PVDF膜；

3).将夹子打开，左边白色，右边为黑色，在两边各加一块海绵、 三层滤纸。

4).小心剥下分离胶放在滤纸上，将PVDF膜置于胶上，不要有 气泡，在膜上盖三张滤纸并除去气泡。最后盖上另一个海绵垫；

5).转膜条件(湿转):300mA恒流转膜半小时，转膜过程中将转膜 设备放在冰水中降温。

6.6免疫反应

1).将转印完的膜放入装有TBST的孵育槽中，快速涮洗一次， 然后加上的脱脂牛奶，放置脱色摇床上，室温下封闭30min；

2).按照抗体说明书，进行一抗稀释，配置好后，倒掉孵育槽中的 封闭液，加入配置好的一抗，4℃孵育摇床过夜(摇床慢摇)；

3.回收一抗，用TBST快速涮洗膜三次，然后加入TBST，放置 脱色摇床上快速洗脱，每次5min，洗三次；

4).将二抗用TBST按照1:5000的比例进行稀释，然后加入孵 育槽中，放置摇床上慢摇，室温下孵育30min；

5).用TBST快速涮洗膜三次，然后再加入TBST，放置脱色摇床 上快速洗脱，每次5min，洗三次。

6.7化学发光

在暗室中将ECLA液和ECLB液两种试剂在离心管中等体积 混合，在曝光匣上贴双层PE手套或者其他透明薄膜，将PVDF膜 的蛋白面朝上放在曝光匣两层薄膜之间，加入混合好的ECL溶液 充分反应，1-2min后，去尽残液，盖上层薄膜开始压胶片。压完的胶 片用显影、定影试剂进行显影和定影。根据不同的发光强度调整曝光 条件。

6.8凝胶图像分析

将胶片进行扫描存档，PhotoShop整理去色，Alpha软件处理系 统分析目标带的光密度值。

7.数据统计

实验数据采用SPSS(22.0版)进行分析。所有数据都以平均值±标 准误(SEM)表示。组间差异用单因素方差分析或t检验。组间差异的 显著平准确定为P<0.05。

8实验结果

8.1 miR-212转染效率

为深入探究miR-212在脂肪发育过程中的作用，对卵巢颗粒细胞 转染miR-212的过表达模拟物(mimics)、抑制剂(inhibitor)及阴性对 照观察对卵巢颗粒细胞增殖状况的影响。过表达模拟物及抑制剂的转 染显著提高或降低了miR-212在卵巢颗粒细胞中的表达量。

8.2 miR-212对卵巢颗粒细胞增殖的影响

通过CCK-8细胞增殖检测试剂盒检测过表达及抑制miR-212对 卵巢颗粒细胞增殖的影响，与对照组相比转染miR-212抑制剂显著促 进细胞的增殖，过表达处理组则相反。EdU的结果与CCK结果一致， 当用miR-212抑制剂处理细胞时新生细胞数量显著多于对照组，过表 达处理组新生细胞数量显著降低。

8.3 miR-212对增殖标志基因的影响

与上述结果一致，几个细胞周期相关激酶CyclinD以及CyclinE 的表达量也随miR-212的表达量降低而呈现显著上调的趋势，以上结 果表明，miR-212可能通过调控细胞周期蛋白激酶相关基因从而抑制 卵巢颗粒细胞增殖。

8.4 miR-212靶基因的筛选

通过对miR-212在不同物种间的序列比对发现，其在人、小鼠、 大鼠、猕猴等哺乳动物中高度保守。为更深入了解miR-212对卵巢颗 粒细胞分化的分子调控机制，通过pictar、miRBase、TargetScan三个 常用靶基因预测数据库对miR-212的靶基因进行预测，预测结果显示 miR-212种子序列可完全靶向结合FGF16的3’UTR区，。

8.5 miR-212与FGF16靶标关系验证

进一步验证FGF16与miR-212之间的结合关系，进行了荧光素 酶报告实验。miR-212的模拟物与WT-FGF16结合荧光素酶活性显著 下降，而在Mut-FGF16组中则荧光素酶活性无显著变化，进一步证 明了miR-212与FGF16的靶标关系。这些结果表明miR-212通过靶向调控FGF16从而促进卵巢颗粒细胞分化。

8.6 FGF16对卵巢颗粒细胞增殖的影响

本实验使用siRNA将靶基因表达量干扰掉，使用荧光定量的方 法检测干扰靶基因后对卵巢颗粒细胞增殖的影响，结果表明，干扰掉 靶基因后显著抑制卵巢颗粒细胞增殖，并且在蛋白水平的到相同结果。

Claims (10)

1.利用miR-212及其靶基因调控卵巢颗粒细胞的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：将miR-212转染入卵巢颗粒细胞中。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在进行所述转染前，还包括分离、接种、传代培养和收样操作。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述巢颗粒细胞为猪卵巢颗粒细胞。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，进行所述分离操作时，按照如下方法进行：

1)于母猪屠宰后取出卵巢，置于PBS中清洗后，将卵巢保存在38摄氏度的生理盐水中于1小时内分离卵巢颗粒细胞；

2)将卵巢放到预热好的37度生理盐水中清洗干净后，用手术刀将卵巢表面每间隔1毫米均匀轻轻划破，收集卵泡液，将吸取后的卵泡液放入15ml离心管，1000rpm离心8分钟，弃上清，用预热的PBS轻轻吹打均匀清洗离心重复两次；

3)配制的卵巢颗粒细胞培养液为20％FBS加DMEM以及1％的抗生素。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在进行接种前，待卵巢颗粒细胞增殖到85％后，弃掉原培养基，用PBS清洗两次后用巴氏吸管加入1ml胰酶，放入37度细胞培养箱，放置2min后加入新鲜培养基终止消化，将细胞吹打下来，将悬液吸入15ml离心管；最终将细胞用培养液冲匀接种到12孔板中进行培养。

6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在细胞转染前一天，将处于细胞接种至12孔培养板中，当增殖细胞密度达到35～45％时，进行转染，48小时候后收样。

7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在进行转染时，按照lipofectamine3000试剂盒的说明书进行。

8.根据权利要去3所述的方法，其特征在于，所述抗生素为青霉素、链霉素和两性霉素。

9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，进行所述收样时，将RNAisoPlus加入每个孔，裂解一分钟后反复吹打吸出，并将样品于-80℃下保存。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(2)中，细胞密度培养到40％。

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