CN112574996B - 一种长链非编码rna aagncr及其应用 - Google Patents

一种长链非编码rna aagncr及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种长链非编码RNA AAGNCR及其在预测猪肌内脂肪含量中的应用。本发明通过RT‑PCR证实了AAGNCR的客观存在，同时证明AAGNCR对肌内脂肪细胞脂质沉积具有促进作用。本发明针对AAGNCR序列合成抑制其表达的AAGNCR siRNA序列，该序列能够显著降低细胞中AAGNCR的表达量，对AAGNCR的表达具有明显的抑制效果。

Description

一种长链非编码RNA AAGNCR及其应用
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种长链非编码RNA AAGNCR及其在预测猪肌内脂肪含量中的应用。
背景技术
随着生活水平的提高，人们对高品质猪肉的需求量逐渐增加，我国地方猪品种相关产品售价显著高于引进品种。高品质猪肉的本质就是肌纤维直径小，肌内脂肪含量高。肌内脂肪含量是影响肉质的关键因素之一，影响肉的嫩度、风味以及多汁性。肌内脂肪含量受多方面因素调控，例如遗传、环境、营养水平等，而遗传的影响最为关键。肌内脂肪含量是质量性状，受微效多基因调控，其遗传力高达0.6。所以研究其调控机制，通过育种可以达到提高肌内脂肪含量的目的。而肌内脂肪含量须在成年后通过屠宰试验才能测定，严重影响了育种效率，筛选肌内脂肪含量的相关标记，实现仔猪早期筛选，可以极大地提高肌内脂肪含量的育种进程。
长链非编码RNA（long non-coding RNA）是近几年的研究热点，研究结果证实其通过多种方式参与各种生命过程，例如细胞分化、凋亡、免疫应答、生长发育、糖脂代谢、炎症以及肿瘤等。本项目通过前期高通量测序，筛选到一个新的lncRNA，命名为AAGNCR，在肌内脂肪组织中表达量高，在脂肪型猪种（高肌内脂肪含量）背最长肌中表达量持续高于瘦肉型猪种（低肌内脂肪含量），提示该lncRNA可能与肌内脂肪含量性状相关，有可能作为肌内脂肪含量的标记物，但是目前尚无关于该lncRNA功能的报道。
发明内容
针对目前存在的缺陷和问题，本发明提供一种长链非编码RNA AAGNCR及其在预测猪肌内脂肪含量中的应用。
本发明解决其技术问题所采用的方案是：一种长链非编码RNAAAGNCR，其特征在于：所述RNAAAGNCR的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
一种长链非编码RNAAAGNCR在调控肌内脂肪沉积方面的应用。
上述的应用，所述长链非编码RNAAAGNCR用于促进肌内脂肪沉积。
一种长链非编码RNAAAGNCR在制备用于肌内脂肪细胞标记物制剂方面的应用。
上述的应用，所述长链非编码RNAAAGNCR的干扰序列为AAGNCR siRNA，其核苷酸序列为: GACCAGAATTGAGCCA CATGCTTGT （SEQ ID NO：2）。
上述的应用，所述AAGNCR siRNA在抑制AAGNCR方面的作用。
一种预测猪肌内脂肪含量的制剂，包括长链非编码RNAAAGNCR。
本发明的有益效果：本发明收集脂肪型猪（高肌内脂肪）和瘦肉型猪（低肌内脂肪）猪种背最长肌的背最长肌组织，利用RT-qPCR技术检测了AAGNCR的表达情况。结果显示，在不同发育阶段， AAGNCR在脂肪型猪种肌内脂肪组织中表达持续高于瘦肉型猪种，其中在7日龄，脂肪型猪种AAGNCR表达量是瘦肉型猪种的6.39倍，两组数据的差异具有统计学意义（P=0.001）。同时在猪原代肌内脂肪细胞中， AAGNCR随着肌内脂肪细胞的脂质生成，表达量显著升高；通过siRNA介导的干扰AAGNCR，AAGNCR表达量降低，促进脂质生成的标志基因显著降低，抑制脂质生成的标志基因显著提高；油红O染色提示， AAGNCR表达量降低，肌内脂肪细胞脂质沉积减少。这些研究结果提示AAGNCR对肌内脂肪细胞脂质沉积具有促进作用，其表达量与肌内脂肪含量呈正相关，可以作为肌内脂肪含量早期预测的分子标记物。
本发明首先通过RT-qPCR证实了lncRNA AAGNCR在肌内脂肪组织中表达量较高，其表达量与猪肌内脂肪含量呈正相关，在成熟脂肪细胞中的表达量明显高于前脂肪细胞。为进一步研究AAGNCR表达量降低对脂肪细胞脂质生成的影响，从而探讨AAGNCR在脂质代谢中的作用，本发明针对AAGNCR序列，合成抑制其表达的siRNA序列，将其转染到前肌内脂肪细胞，人为抑制前脂肪细胞中AAGNCR的表达。结果证实，siRNA序列的转染可以显著降低AAGNCR的表达量，促脂质生成标志基因表达量也下调，抑制脂质生成的标志基因表达量上调，脂质沉积减少，表明该AAGNCR在肌内脂肪沉积中发挥重要作用，其表达量与肌内脂肪含量呈正相关，可以作为早期预测肌内脂肪含量的新分子标记。
附图说明
图1为AAGNCR在淮南猪不同组织中的表达情况；其中胃：胃，心：心肌，肝：肝脏，脾：脾脏，肺：肺脏，肾：肾脏，肠：小肠，背长：10-11肋骨处背最长肌，肌间：10-11肋骨处背最长肌中的肌间脂肪，皮下：10-11肋骨处皮下脂肪，表达量使用平均值±标准误表示， **表示每个组织表达量与胃的表达量差异极显著。
图2为130kg体重长白猪和淮南猪背最长肌组织切片的H&E染色图（200×），所采背最长肌均为10-11肋骨处背最长肌。
图3为AAGNCR在猪前肌内脂肪细胞脂质生成过程中的表达量变化趋势，其中Day0，Day 4分别表示成脂分化的第0天和第4天；表达量使用平均值±标准误表示，**表示Day4与Day 0天相比，差异极显著。
图4为在猪前肌内脂肪细胞中AAGNCR siRNA的干扰效率；其中NC：对照组，AAGNCRsiRNA：转染AAGNCR siRNA。表达量使用平均值±标准误表示，**表示差异极显著。
图5为转染AAGNCR siRNA对猪前肌内脂肪细胞脂质沉积的影响；其中NC：对照组，AAGNCR siRNA：转染AAGNCR siRNA。转染后，细胞接触抑制2天后进行诱导分化，诱导分化第8天，通过油红O染色，着色的为脂质，着色越多证明脂质沉积越多。
图6为转染AAGNCR siRNA后48h对成脂分化相关基因的影响；表达量使用平均值±标准误表示，**表示差异极显著。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。
实施例1：AAGNCR在猪不同组织中的表达
1、试验材料
按照标准样本采集方案，从河南兴锐农牧有限公司随机采集3头育肥中期（75 kg体重）的淮南猪，所有猪只饲养条件和生长环境一致，取其胃、心、肝、脾、肺、肾、肠、背最长肌、皮下脂肪、肌间脂肪组织样本。
2、试验方法
2.1、淮南猪不同组织总RNA的提取
（1）准备工作：使用洗涤剂清洗所有研钵和研磨棒以及样品勺，浸泡到3%的双氧水中4小时以上，洗刷干净后，蒸馏水冲洗3遍。烘干后用锡箔纸包装（以防取出后被环境中的RNA酶污染），然后再用牛皮纸包装。置于180℃烘箱干烤8个小时以上，结束后关闭烘箱电源，待温度降到室温取出，置于超净台备用。
（2）液氮研磨：在干净的台面，取出处理过的研钵，加入液氮预冷研钵和研磨棒，取出液氮保存的组织样品，每个样品取用50-100 mg样品，研磨过程中保证研钵中一直有液氮，直至将组织样品磨为粉末。用预冷过的样品勺将样品粉末放到有1 mL Trizol的2 mLEppendorf 管中，振荡器混匀后置于4 ℃静置10 min，让组织完全裂解。
（3）水相分离：每1 mL含有样品的Trizol混合液加入200 uL预冷的氯仿，震荡混匀1 min。4 ℃静置5 min。然后取出于4 ℃，12,000 rpm离心20 min。离心后混合液分为3层，下层为粉红色，中间层为膜状的白色沉淀，上层为无色液体，RNA存在于上层。使用无RNA酶的枪头小心将上层溶液吸出，置于新的1.5 mL Eppendorf 管中。
（4）RNA沉淀：按照1:1的比例加入等体积的异丙醇，轻柔上下颠倒混匀，于-20℃静置30 min。于4 ℃，12,000 rpm离心30 min，取出后可在管壁看到白色沉淀即为RNA，用移液枪将液体吸取弃去。
（5）RNA洗涤：向RNA沉淀加入1 mL 75%预冷的无水乙醇（使用DEPC处理水配置），温和上下颠倒清洗RNA沉淀。于4 ℃，12,000 rpm离心5 min，用移液枪将液体吸取弃去。重复洗涤一次，然后弃去液体后室温晾干10-15 min，让乙醇充分挥发干净。
（6）RNA溶解：每个样品加入15-50 uL DEPC水，测定浓度后在统一稀释为200 ng/uL，分装后置于-80 ℃保存。
2.2、总RNA的逆转录PCR反应
第一步：去除提取的总RNA中的基因组DNA：提取的总RNA 1 μg，5×gDNA EraserBuffer 2 μL，gDNA Eraser 1 μL，无RNA酶的ddH2O补到10 μL。混合液置于PCR仪中，42 ℃2 min。
第二步：进行反转录反应，体系如下：上一步的反应液10 μL，PrimeScript® RTEnzyme Mix I 1 μL，Random 6 mers（100 μM）1 μL，5×PrimeScript® Buffer 2（forReal Time）4 μL，用无RNA酶的ddH2O补到20 μL。将上述混合液置于PCR仪中，37 ℃ 15min，85 ℃ 5 s，即获得cDNA。该cDNA可用于AAGNCR PCR 检测。
2.3、定时定量PCR反应
使用SYBR® Premix Ex TaqTM（Tli RNaseH Plus）试剂盒在LightCycler®480System定量PCR仪上进行实时定量PCR反应。
反应体系如下：SYBR Premix Ex Taq II （Tli RNaseH Plus）（2×）10 μL，AAGNCR特异性上下游引物各0.8 μL（10 μM），cDNA 2 μL，灭菌ddH2O 6.4 μL。反应程序为：95 ℃ 30 s预变性；95 ℃ 10 s变性、60 ℃ 20 s退火、70 ℃ 10 s延伸，循环40次，获得Ct值。
然后95 ℃ 5 s、60 ℃ 1 min、95 ℃ 10 s，1个循环绘制融解曲线。同时以内参基因GAPDH作为校对。获得的Ct值按Applied Biosystem公司ABI PRISM 7300SequenceDetection System User Bulletin #2推荐方法进行计算。
通过采用qRT-PCR技术检测了AAGNCR在淮南猪10种组织样品的表达情况，结果如图1所示，AAGNCR在肌间脂肪组织表达量最高，在背最长肌中的表达量显著低于肌间脂肪组织。AAGNCR肌间脂肪组织中的表达量比背最长肌表达量高，提示AAGNCR可能对肌内脂肪沉积具有重要的生物学功能。
实施例2：AAGNCR在不同肌内脂肪含量猪种中的表达差异
1、试验材料
按照标准样本采集方案，从河南兴锐农牧有限公司随机采集淮南猪（脂肪型猪，高肌内脂肪含量）和长白猪（瘦肉型猪，低肌内脂肪含量）38胎龄、58胎龄、7日龄、130kg（淮南猪大约300日龄，长白猪大约260日龄，两个猪种生长速度不同）的背最长肌样本，每个阶段每个猪种采集10头，所有猪只饲养条件和生长环境一致。
2、试验方法
2.1提取淮南猪和长白猪背最长肌总RNA，方法同实施例1。
2.2 总RNA进行逆转录PCR反应
2.3 背最长肌样品石蜡切片制备和H&E染色
收集淮南猪和长白猪不同发育阶段背最长肌样品，淮南猪代表脂肪型猪种，肌内脂肪沉积多，而长白猪代表瘦肉型猪种，肌内脂肪沉积少。为了比较淮南猪和长白猪背最长肌的脂质沉积差异，选择130kg阶段（这个阶段，已经完成育肥，肌内脂肪沉积已基本完成，肌内脂肪含量差异最明显）两个猪种背最长肌进行组织切片和H&E染色。
背最长肌样品石蜡切片基本操作步骤：取背部10-11肋骨处背最长肌，10%福尔马林溶液固定。将固定好的背最长肌样品进行脱水，依次为50%乙醇1小时，70%乙醇1小时，80%乙醇过夜，90%乙醇1.5小时，无水乙醇1小时，无水乙醇1小时。然后进入二甲苯透明，石蜡包埋，随后使用切片机切为8um的薄片。
H&E染色基本流程：石蜡切片浸入二甲苯脱腊，梯度酒精脱水（无水乙醇I 2 min，无水乙醇II 2 min，90%乙醇2 min，80%乙醇1 min，70%乙醇1 min），自来水冲洗2-3次，苏木精染色10-20min，自来水冲洗浮色，1%盐酸酒精分色数秒，伊红染色5min，水洗，梯度酒精脱水分色（70%乙醇2 min，80%乙醇2 min，95%乙醇2 min，无水乙醇I 2 min，无水乙醇II 2min），二甲苯透明，中性树胶封皮，晾干后在显微镜下拍照。
结果如图2所示，淮南猪和长白猪在同样的体重下，淮南猪肌内脂肪沉积显著高于长白猪。
通过qRT-PCR技术检测了AAGNCR在这两种猪背最长肌的表达情况。结果见表1。表中：38胎龄代表38天胎猪背最长肌样品；58胎龄代表58天胎猪背最长肌样品；7日龄代表出生7天仔猪背最长肌样品；体重130kg代表在130kg体重时的背最长肌样品。表达量使用平均值±标准误表示。
Figure DEST_PATH_IMAGE002
结果发现，AAGNCR表达量在两个品种中，都是随着生长发育表达量逐渐升高；在同一阶段，均为淮南猪高于长白猪，其中7日龄，两组差异最大，AAGNCR在淮南猪的表达量大约是长白猪的8.16倍。这些结果提示，AAGNCR与肌内脂肪含量呈正相关，可能具有促进肌内脂肪沉积的作用。
实施例3：AAGNCR在脂肪细胞分化前后的表达量
1、试验材料
细胞：猪原代肌内脂肪细胞为本实验室分离培养冻存于液氮中，复苏解冻后使用。
试剂：荧光实时（Real-time）定量PCR（polymerase chain reaction）用的SYBRPremix Ex TaqTM（Tli RNaseH Plus）试剂盒购自TaKaRa公司。Real-time PCR特异性引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。
2、试验方法
2.1猪原代肌内脂肪细胞分离、培养
3日龄仔猪，麻醉处死，来苏尔溶液全身消毒，75%酒精消毒，分离5g左右背最长肌组织。用含有双抗的PBS冲洗3遍，去除肉眼可见的结缔组织和血管，剪成1-2mm3的肉糜，移入消化瓶。1g组织样品加入12500U的II型胶原酶（使用DMEM/F12培养基配置），37℃水浴消化2h。消化结束，用含10% FBS的DMEM/F12培养基等体积中和消化液。先后使用70目和200目不锈钢筛网过滤，收集滤液于离心管中。1500 rpm离心10 min，弃上清。加入无血清培养基重悬细胞，清洗2遍。用含15%血清的DMEM/F12培养基重悬细胞，以2.5×105细胞/cm2密度接种于培养皿中，37℃，5% CO2培养箱培养。培养1h后，取出培养皿，PBS清洗3次，洗去未贴壁细胞并换培养基。37℃，5% CO2培养箱继续培养。待细胞长至80%密度时，0.25%胰酶消化传代扩繁。
2.2猪原代肌内脂肪细胞的诱导分化
将猪原代肌内脂肪细胞置于完全培养基（DMEM、10%新生牛血清、100μg/mL青霉素、100μg/mL链霉素）中培养，培养条件为37℃、5%的CO2浓度，饱和湿度。细胞接触抑制后2天，完全培养基换为诱导培养基I（DMEM、10%胎牛血清、100μg/mL青霉素、100μg/mL链霉素、0.5mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、1mM地塞米松、5μg/mL胰岛素），记为Day 0天；2天后换为诱导培养基II（DMEM、10%胎牛血清、100μg/mL青霉素、100μg/mL链霉素、5μg/mL胰岛素），记为Day 2天；2天后换为完全培养基，记为Day 4天。
2.3猪原代肌内脂肪细胞的鉴定
经诱导分化的猪原代肌内脂肪细胞，吸去培养基，PBS漂洗3遍。每孔加入4%多聚甲醛，室温固定30 min。弃去固定液，加入0.5%的油红O工作液，室温染色45 min。弃去染色液，PBS清洗2遍。使用倒置显微镜观察染色情况。在显微镜下看到细胞内部有染成红色的大小不同的圆形脂滴，即可判断成功分离出原代肌内脂肪细胞。
2.2 脂肪细胞总RNA的提取
于Day O和Day 4天分别收集前脂肪细胞和成熟脂肪细胞，分别提取RNA，方法同实施例1。
2.3 引物设计
根据AAGNCR转录本的序列（SEQ ID NO：1），其中AAGNCR核苷酸序列为：
TTCTGTTTTAGCCAGAGGAAGATTCTTTTCCAAACCTACTAGAAGATTTCCCCTCAGTACCTCTTGACCAGAATTGAGCCACATGCTTGTGCTCCAGATACTTGAGACCTCTCGCCTTCGTCGTCCAGTTCTGTTTTAGCCAGAGGAAGATTCTTTTCCAAACCTACTAGAAGATTTCCCCTCAGTACCTCTTGACCAGAATTGAGCCACATGCTTGTGCTCCAGATACTTGAGACCTCTCGCCTTCGTCGTCCAGGTTGGTGCTGTGGCACTTTCACTGTCCCTGCTGTGGCTCTGAACCAGTGGCATGATGGAAGCAACAAGGTTTCACCTTGCACGTGGCTCACTTCTCTGGCGTTTCTCGCAGGTTGGTGCTGTGGCACTTTCACTGTCCCTGCTGTGGCTCTGAACCAGTGGCATGATGGAAGCAACAAGGTTTCACCTTGCACGTGGCTCACTTCTCTGGCGTTTCTCGCAGTCTGCCTGGTGTCCTTCTAAGAAGAGGAAATTTGGGCACAGAGCACCGGGAGGCACCTTCACAGAGAACAGGCTGTGGAGAAATTCAAGGGGAAGGTGGCCGTCTCCAAGCCAGAGAGAGAGGCCTCGGAAGGAAGCCAACTTGCCAACACCTTGATTTGGACGTCCGGCCCCCAGAACTATGAGAAAATAAACCTCTCGTTTAAGCCCCCCATCTGCCTGGTGTCCTTCTAAGAAGAGGAAATTTGGGCACAGAGCACCGGGAGGCACCTTCACAGAGAACAGGCTGTGGAGAAATTCAAGGGGAAGGTGGCCGTCTCCAAGCCAGAGAGAGAGGCCTCGGAAGGAAGCCAACTTGCCAACACCTTGATTTGGACGTCCGGCCCCCAGAACTATGAGAAAATAAACCTCTCGTTTAAGCCCCCCA。
通过Primer Premier 5软件设计定量引物，PPARgama作为促进成脂分化的标志基因，用作对照，AAGNCR、PPARgama、GAPDH引物信息具体如下：
AAGNCR的上游引物：
5’- GACCAGAATTGAGCCACAT -3’（SEQ ID No：3）；
下游引物：
5’- GCACCAACCTGCGAGAAA -3’（SEQ ID No：4）。
PPARgama的上游引物：
5’- GTGCCAGTTTCGATCCGTAGA -3’（SEQ ID No：5）；
下游引物：
5’- GGCCAGCATCGTGTAGATGA -3’（SEQ ID No：6）。
内参基因GAPDH的上游引物：
5’- GTGAAGGTCGGAGTGAACGGA -3’（SEQ ID No：7）；
下游引物：
5’- CCATTTGATGTTGGCGGGAT -3’（SEQ ID No：8）。
2.4 RNA的逆转录反应并进行定时定量PCR
方法同实施例1。
为了分析AAGNCR与成脂分化的关系，本发明通过实时定量PCR检测了AAGNCR在成脂分化前（前脂肪细胞，Day0）成脂分化后（成熟脂肪细胞，Day4）肌内脂肪细胞中的表达情况，同时以PPARgama表达量变化趋势作为对照，已知PPARgama能够促进成脂分化，在成脂分化过程种表达量显著升高。结果如图3所示，AAGNCR在成熟肌内脂肪细胞（Day4）中表达量显著高于前肌内脂肪细胞（Day0），这个表达变化趋势和PPARgama是一致的，表明AAGNCR可能参与调控肌内脂肪细胞的脂质生成。
实施例4：AAGNCR在抑制脂肪细胞分化中的作用
1、试验材料
细胞：猪原代肌内脂肪细胞为本实验室分离培养。
试剂：脂质体2000购自Invitrogen公司。
2、试验方法
本发明设计合成特异性抑制AAGNCR序列的siRNA（GACCAGAATTGAGCCACATGCTTGT）和对照序列NC（TTCTCCGAACGTGTCACGTTT）。
2.1 细胞转染
将猪原代肌内脂肪细胞种在6孔板中，当细胞密度达到80%～85%进行转染。按照脂质体2000的说明要求，转染前3 h换液（完全培养基、10%新生牛血清）。转染时，对于 6孔板的每一个孔，将10 μL AAGNCR siRNA（20 μM）稀释于含有125 μL无血清培养基的离心管中，同时将10 μL脂质体2000稀释到含有125 μL无血清培养基的另一个离心管中（脂质体使用前轻轻混匀），室温孵育。孵育5 min后，将稀释好的AAGNCR siRNA与脂质体2000混在一起，轻轻混匀，室温孵育。20 min后，把孵育的复合物加到含有细胞和培养基的培养孔中，轻轻前后摇动培养皿将所有液体混匀。放置在CO2培养箱中37 ℃孵育12 h后更换培养基。同时含有随机序列的NC作为对照组，其转染方法同AAGNCR siRNA。
2.2 细胞诱导分化
猪原代肌内脂肪细胞，分别转染AAGNCR siRNA和NC后，待细胞密度达到接触抑制后2天，开始诱导分化。在转染后24 h收集转染AAGNCR siRNA和NC的细胞用于检测干扰效率和脂质生成相关标志基因的表达量变化。
结果如图4所示，可以看出与对照组相比，合成的AAGNCR siRNA能够显著降低细胞中AAGNCR的表达量，表明设计合成的AAGNCR siRNA对AAGNCR的表达具有明显的抑制效果。
2.2 油红O染色
猪原代肌内脂肪细胞，分别转染AAGNCR siRNA和NC后，细胞接触抑制两天，加入诱导分化液I 2天（全培养基添加胰岛素、地塞米松和IBMX），诱导分化液II 2天（全培养基添加胰岛素），更换全培养基4天，福尔马林固定，油红O染色，拍照，分析脂质沉积情况。
为了验证AAGNCR对肌内脂肪细胞脂质沉积的作用，通过在猪原代肌内脂肪细胞转染AAGNCR特异性siRNA，诱导分化后第8天，通过油红O染色观察脂质沉积变化。结果如图5所示，与对照组相比，AAGNCR表达量降低后，培养皿中着色物质减少（油红O染料主要着色于脂质），说明脂质沉积减少，提示AAGNCR具有促进脂质沉积的作用。
2.4 引物设计
前脂肪细胞分化为成熟脂肪细胞过程受一系列基因的调控，例如AdipoQ、CEBPalpha、Hey1、PPARgama等都是促进成脂分化的，Pref1是抑制成脂分化的，这些基因表达量的高低能够反映成脂分化的程度。
根据NCBI数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）公布的成脂分化相关标志基因AdipoQ（397660）、CEBPalpha（397307）、Hey1（100157952）、PPARgama（397671）、Pref1（497066）基因mRNA序列，通过Primer Premier 5软件设计引物，引物由生工生物工程（上海）有限公司合成，涉及引物具体如下。
AdipoQ的上游引物：
5’-GCGCCTATGTCTACCGTTCA-3’（SEQ ID No：9）；
下游引物：
5’-GTAGACCGTGACGTGGAAGG-3’（SEQ ID No：10）。
CEBPalpha的上游引物：
5’- AACAACTGAGCCGCGAACTG-3’（SEQ ID No：11）；
下游引物：
5’- GCTCCGGCAGTCTTGAGAT-3’（SEQ ID No：12）。
Hey1的上游引物：
5’- CCTCCGATAGCGAACTGGAC-3’（SEQ ID No：13）；
下游引物：
5’- GACGGCGCTTCTCAATGATG-3’（SEQ ID No：14）。
Pref1的上游引物：
5’- AACCTGCGCGAACCTTGATA-3’（SEQ ID No：15）；
下游引物：
5’- AAATTGCCCGAAAAGCCAGG-3’（SEQ ID No：16）。
2.5 实时定量PCR
将转染AAGNCR siRNA和NC的细胞分别提取总RNA，反转录合成cDNA。通过实时定量PCR技术，测定AAGNCR的干扰效果以及AdipoQ、CEBPalpha、Hey1、PPARgama、Pref1等成脂分化标志基因表达量的变化。
结果如图6所示，转染24 h后，AAGNCR表达量降低，促进成脂分化的基因AdipoQ、CEBPalpha、Hey1、PPARgama表达量普遍降低，而抑制脂肪沉积的Pref1表达量显著升高，提示AAGNCR具有通过调控成脂分化关键基因参与调控成脂分化过程。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不限制本发明，凡在本发明的精神和原则范围内所做的任何修改、等同替换和改进，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 河南省农业科学院畜牧兽医研究所
<120> 一种长链非编码RNA AAGNCR及其应用
<141> 2020-12-31
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 904
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ttctgtttta gccagaggaa gattcttttc caaacctact agaagatttc ccctcagtac 60
ctcttgacca gaattgagcc acatgcttgt gctccagata cttgagacct ctcgccttcg 120
tcgtccagtt ctgttttagc cagaggaaga ttcttttcca aacctactag aagatttccc 180
ctcagtacct cttgaccaga attgagccac atgcttgtgc tccagatact tgagacctct 240
cgccttcgtc gtccaggttg gtgctgtggc actttcactg tccctgctgt ggctctgaac 300
cagtggcatg atggaagcaa caaggtttca ccttgcacgt ggctcacttc tctggcgttt 360
ctcgcaggtt ggtgctgtgg cactttcact gtccctgctg tggctctgaa ccagtggcat 420
gatggaagca acaaggtttc accttgcacg tggctcactt ctctggcgtt tctcgcagtc 480
tgcctggtgt ccttctaaga agaggaaatt tgggcacaga gcaccgggag gcaccttcac 540
agagaacagg ctgtggagaa attcaagggg aaggtggccg tctccaagcc agagagagag 600
gcctcggaag gaagccaact tgccaacacc ttgatttgga cgtccggccc ccagaactat 660
gagaaaataa acctctcgtt taagcccccc atctgcctgg tgtccttcta agaagaggaa 720
atttgggcac agagcaccgg gaggcacctt cacagagaac aggctgtgga gaaattcaag 780
gggaaggtgg ccgtctccaa gccagagaga gaggcctcgg aaggaagcca acttgccaac 840
accttgattt ggacgtccgg cccccagaac tatgagaaaa taaacctctc gtttaagccc 900
ccca 904
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gaccagaatt gagccacatg cttgt 25

Claims (4)

1.一种长链非编码RNAAAGNCR，其特征在于：所述长链非编码RNAAAGNCR的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种长链非编码RNA AAGNCR在调控猪肌内脂肪沉积方面的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述长链非编码RNAAAGNCR用于促进猪肌内脂肪沉积。
4.一种长链非编码RNA AAGNCR干扰序列在抑制猪肌内脂肪沉积方面的应用，其特征在于：所述长链非编码RNA AAGNCR干扰序列为AAGNCR siRNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
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