CN116144790A - 一种湖羊肌肉细胞增值相关的标志物及其检测引物和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种湖羊肌肉细胞增值相关的标志物及其检测引物和应用，所述的标志物为GNAI2基因，其序列为SEQ ID NO.1。本发明通过RT‑qPCR、CCK‑8、EdU以及免疫荧光技术进一步验证了GNAI2在湖羊肌肉细胞增殖过程中表达起显著上调作用，在细胞分化过程中表达起显著下调作用，提出GNAI2可作为生物标志物应用于鉴定湖羊肌肉细胞的增殖和分化，鉴定湖羊肌肉生长拐点的产品，可用于对湖羊肌肉生长发育状况进行鉴定。

Description

一种湖羊肌肉细胞增值相关的标志物及其检测引物和应用
技术领域
本发明属于畜牧兽医检测领域，具体涉及到一种湖羊肌肉细胞增值相关的标志物及其检测引物和应用。
背景技术
湖羊是世界著名的绵羊品种，不仅繁殖性能优势突出，而且肉骨比高，肉质细嫩、多汁，深受大众喜爱。然而，由于湖羊屠宰性能较差，不断制约着湖羊肉质性状的开发利用。
因此，科学地开展湖羊肉质性状调控机制的研究具有重大意义。随着分子生物学及生物信息学的快速发展，关于动物肌肉生长发育的研究也逐步深入、细化。
目前，GNAI2能够影响小鼠的表型，但在参与湖羊机体的生长发育却未见报道。
发明内容
本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。
鉴于上述和/或现有技术中存在的问题，提出了本发明。
因此，本发明的目的是，克服现有技术中的不足，提供一种湖羊肌肉细胞增值相关的标志物。
为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种湖羊肌肉细胞增值相关的标志物，所述标志物包括GNAI2，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明的再一个目的是，克服现有技术中的不足，提供一种湖羊肌肉细胞增值相关标志物的检测引物，所述检测引物选自特异性扩增GNAI2的引物，包括上游引物和下游引物，其上、下游引物序列分别为SEQ ID NO.3和SEQ IDNO.4所示。
本发明的另一个目的是，克服现有技术中的不足，提供所述的标志物GNAI2在判定湖羊肌肉生长拐点中的应用。
本发明的再一个目的是，克服现有技术中的不足，提供一种标志物GNAI2在制备影响湖羊肌肉细胞增殖分化的药物组合物中的应用。
作为本发明所述应用的一种优选方案，其中：所述药物组合物包括GNAI2的下调剂。
作为本发明所述应用的一种优选方案，其中：所述下调剂包括GNAI2的抑制物，GNAI2抑制物序列为由双链分子序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
作为本发明所述应用的一种优选方案，其中：所述药物组合物还包括与下调剂配伍的其他药类以及药学上可接受的干扰序列或辅料。
本发明的另一个目的是，克服现有技术中的不足，提供一种标志物GNAI2在制备鉴定湖羊肌肉细胞增殖分化规律的产品中的应用，所述产品包括芯片、制剂或试剂盒。
本发明的另一个目的是，克服现有技术中的不足，提供一种鉴定湖羊肌肉细胞增殖分化效率的方法，包括，
用候选物质处理表达或含有GNAI2基因的体系，和检测所述体系中GNAI2基因的表达；
若GNAI2基因的表达或活性最高，则表明湖羊肌肉细胞增殖效率最高，分化效率最低。
本发明有益效果：
(1)羊肌肉生长状况是肉羊养殖极为重视的一格性状，本发明提供了一种鉴定湖羊肌肉生长拐点的产品，可用于对湖羊肌肉生长发育状况进行鉴定，具有良好的经济效益。
(2)本发明提供一种鉴定湖羊肌肉生长拐点的手段，通过检测GNAI2基因的表达水平来判断测定湖羊日龄是否到达肌肉的生长拐点，鉴别湖羊骨骼肌细胞的增殖分化状况，弥补了本领域现有的空缺，为解析湖羊骨骼肌发育的遗传机理提供理论基础和科学依据；此外，其对于研究湖羊肌肉性状的遗传本质、提高湖羊产肉量以及遗传辅助育种都具有重要的意义。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：
图1为本发明实施例中利用RT-qPCR筛选GNAI2的最佳干扰序列结果图。
图2为本发明实施例中利用RT-qPCR检测GNAI2抑制条件下增殖标志基因(PCNA、CDK2以及cyclinD1)的表达情况图。
图3为本发明实施例中利用CCK-8法检测GNAI2抑制条件下湖羊肌肉细胞增殖的影响图。
图4为本发明实施例中利用EdU试剂盒检测GNAI2抑制条件下湖羊肌肉细胞EdU增殖细胞的影响图；其中，图4A在GNAI2抑制条件下荧光显微镜下所有细胞与EdU增殖细胞的图示；图4B是在GNAI2抑制条件下EdU增殖细胞占总细胞数的比例。
图5是为本发明实施例中利用RT-qPCR检测GNAI2抑制条件下分化标志基因(MyOG以及MyOD)的表达情况图。
图6是为本发明实施例中利用免疫荧光MyH3检测GNAI2抑制条件下湖羊肌肉细胞阳性肌管的分化情况。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合说明书实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
本发明经过广泛而深入的研究，已经发现GNAI2基因参与湖羊肌肉生长发育，通过全转录组测序分析以及查阅大量相关文献，发现GNAI2可能参与湖羊肌肉生长发育，为确定其与湖羊肌肉增殖分化之间的关系，从而为鉴定湖羊生长拐点寻找更好的途径和方法。实验证明，GNAI2能够有效地促进湖羊肌肉细胞的增殖，抑制分化，为掌握湖羊肌肉细胞增殖分化规律提供了一种全新的分子标记物。
本发明的实用性并不局限于对本发明的标志物基因的任何特定变体的基因表达进行定量。作为非限制性的实例，标志物基因可具有SEQ ID NO.2指定的核苷酸序列，可以在转录水平上检测生物标志物的表达水平。
本发明所涉及材料的来源如下：
GNAI2基因源于湖羊(登录号：GeneID:100302341)，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。GNAI2基因转录后得到的成熟mRNA序列(登录号：XM_027957550.2)，如SEQ ID NO.2所示。
本发明的实用性并不局限于对本发明的靶标基因的任何特定变体的基因表达进行定量。如果当核酸或其片段与其它核酸(或其互补链)最佳比对时(具有适当的核苷酸插入或缺失)，在至少大约60％的核苷酸碱基、通常至少大约70％、更通常至少大约80％、优选至少大约90％、及更优选至少大约95～98％核苷酸碱基中存在核苷酸序列相同性，则这两个序列是“基本同源的”(或者基本相似的)。
本发明可以利用本领域内已知的任何方法测定基因表达。可以在转录水平上检测生物标志物的表达水平。
检测技术：本发明的基因检测手段使用本领域普通技术人员已知的多种核酸技术进行检测，这些技术包括但不限于：核酸测序和核酸扩增技术。
核酸测序技术的示例性非限制性实例包括但不限于链终止子(Sanger)测序和染料终止子测序。由于RNA在细胞中不太稳定并且在实验中更易受到核酸酶攻击，因此在测序前通常将RNA逆转录成DNA。
本发明可在检测前或与检测同时地对核酸(例如，ncRNA)进行扩增。核酸扩增技术的示例性非限制性实例包括但不限于：聚合酶链式反应(PCR)、逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)。
通常称为PCR的聚合酶链式反应使用变性、引物对与相反链的退火以及引物延伸的多个循环，以指数方式增加靶核酸序列的拷贝数；基于转录的扩增方法；以及自我维持的序列扩增。
本发明中非扩增或扩增的核酸可通过任何常规的手段检测。
试剂盒及下调剂：本发明提供检测GNAI2基因表达水平的产品，下调剂购自吉玛生物公司。如本发明所用，所述的GNAI2的下调剂，即GNAI2干扰序列。
所述的GNAI2的下调剂是指任何可下调GNAI2的表达的物质。这些物质作为抑制GNAI2表达的物质，可用于探究湖羊细胞增殖分化规律。
实施例1
荧光定量检测GNAI2最佳干扰及其对增殖相关基因相对表达量的影响：
1、细胞复苏与培养
将细胞冻存管从液氮中取出后迅速放入37℃水浴锅中融解，约2min；800rpm，离心5min，弃上清；加5mL完全培养基(90％DMEM(美国Gibco公司)+10％FBS(美国Sigma公司)+1％青霉素/链霉素双抗溶液(美国Gibco公司))，轻轻吹散混匀，将细胞悬液置于新的培养瓶中；37℃，饱和湿度，5％CO2恒温培养箱中培养，48h后更换新鲜的完全培养基。
2、细胞转染
将铺板24小时后的肌卫星细胞用0.25％的胰酶消化，完全培养基终止消化后离心弃培养基，加适量完全培养基制备单细胞悬液，以2mL/孔(约1×107个细胞)接种至6孔板，37℃，饱和湿度，5％CO2培养箱进行培养。
实验设置对照组(GNAI2 NC)和实验组(GNAI2 siRNA)，每组设3个平行孔。
GNAI2的siRNA三个干扰序列：
Figure BDA0003973354690000051
3、总RNA提取
按每10cm2面积加1mL TRIzol裂解液收集经转染36小时的湖羊肌卫星细胞，用枪吹打至溶液透明；室温下静置5min；加200uL氯仿，在振荡器上剧烈震荡15s室温静置3min；4℃，12000rpm离心10min，转移上层水相于新的1.5mL无酶管中；加0.5倍体积无水乙醇，混匀后转入RNase-Free吸附柱CR3中，4℃，12000rpm离心30s，弃废液；加500uL去蛋白液RD，4℃，12000rpm离心30s，弃废液；加500uL漂洗液RW，室温静置2min，4℃，12000rpm离心30s，弃废液重复上步操作；将吸附柱放于新的2mL收集管中，4℃，12000rpm离心2min；将吸附柱转入新的1.5mL无酶管中，加50uL RNase-Free ddH2O，室温静置2min，4℃，12000rpm离心2min；重复上步操作；标注样品名称、时间，于-80℃保存。
4、cDNA第一链合成
参照天根生化科技(北京)有限公司的FastQuant cDNA第一链合成试剂盒说明书进行(冰上操作)。
(1)配制gDNA去除反应体系混合液：
Figure BDA0003973354690000061
将混合液彻底混匀，并短暂离心后，于42℃放置3min，置于冰上。
(2)配置反转录反应体系：
Figure BDA0003973354690000062
(3)将步骤(2)的反应液加至步骤(1)的混合液中，充分混匀；
(4)42℃，孵育15min；95℃，3min，置于冰上，用于后续qPCR检测。
5、RT-qPCR
根据NCBI网站上公布的绵羊GNAI2、PCNA、CDK2以及cyclin D1序列(登录号：XM_027957550.2、XM_004014340.5、XM_012158800.4、XM_027959928.2)，利用Primer3web(http://primer3.ut.ee/)设计上、下游引物。
GNAI2：
上游引物(SEQ ID NO.3)：GAGTACCAGCTCAATGACTCTGCC
下游引物(SEQ ID NO.4)：TAGGTCTTTGAAGGTGAAGTGCGT
PCNA：
上游引物(SEQ ID NO.8)：CGAGGGCTTCGACACTTAC
下游引物(SEQ ID NO.9)：GTCTTCATTGCCAGCACATT
CDK2：
上游引物(SEQ ID NO.10)：AGAAGTGGCTGCATCACAAG
下游引物(SEQ ID NO.11)：TCTCAGAATCTCCAGGGAATAG
cyclin D1：
上游引物(SEQ ID NO.12)：CCGAGGAGAACAAGCAGATC
下游引物(SEQ ID NO.13)：GAGGGTGGGTTGGAAATG
按照TaKaRa公司的
Figure BDA0003973354690000071
Premix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)说明书检测PCNA、CDK2以及cyclin D1基因的表达量，以绵羊的GAPDH基因(内参基因)作为内参，每个样品进行3次生物学重复，具体操作步骤如下：
(1)用RNase-Free dd H2O将cDNA稀释4倍；
(2)冰上配制PCR反应体系：
Figure BDA0003973354690000072
(3)PCR反应条件：95℃30s；95℃5s，60℃34s，40个循环；95℃15s，60℃1min，95℃15s。
6、数据分析
根据RT-qPCR测得的CT值，通过2-ΔΔCT算法计算增殖基因的相对表达情况，利用软件SPSS 16.0进行差异显著性分析，用GraphPad Prism 6软件作图。
5、结果
如图1所示，筛选GNAI2的siRNA-551作为最佳干扰效率。如图2所示，GNAI2干扰条件下的增殖相关基因表达量极显著低于GNAI2对照条件下的基因表达量(P<0.01)，说明GNAI2能够促进湖羊骨骼肌细胞增殖。
实施例2
CCK-8法检测GNAI2在过表达和抑制条件下对湖羊肌卫星细胞增殖的影响：
1、细胞培养及转染
将复苏24小时后的肌卫星细胞用0.25％的胰酶消化，完全培养基终止消化后离心弃培养基，加适量完全培养基制备单细胞悬液，以100uL/孔(约1×104个细胞)接种至96孔板，37℃，饱和湿度，5％CO2培养箱进行培养。
实验设置对照组(GNAI2NC)和实验组(GNAI2siRNA)，每组设3个平行孔。
2、细胞处理
分别在培养0、24、48、72h后弃去旧培养基，无菌PBS缓冲液清洗2遍，然后于每孔中加入10uLCCK-8溶液(避免产生气泡)，继续置于37℃培养箱孵育2小时。
3、OD值测定
用酶标仪在450nm处测定OD值，以OD值代表肌卫星细胞的相对增殖水平，并绘制细胞增殖曲线(见图3)。
4、结果
如图3所示，转染GNAI2siRMA在0、24、48、72h的湖羊肌卫星细胞增殖水平极显著低于NC对照组(P<0.01)。
由此可知，GNAI2对湖羊肌卫星细胞的增殖起促进作用。
实施例3
EdU细胞增殖检测：
1、细胞培养及转染
参照实施例2的方法进行湖羊肌卫星细胞培养与转染，细胞接种于96孔板。待细胞转染至24h，进行EdU细胞增殖检测。
2、EdU标记
用细胞完全培养基按1000：1的比例稀释EdU溶液(试剂A)，制备适量50μMEdU培养基；每孔加入100μL50μMEdU培养基孵育2小时，弃培养基；PBS清洗细胞1～2次，每次5分钟。
3、细胞固定化
每孔加入50μL细胞固定液(即含4％多聚甲醛的PBS(购自Solarbio公司)室温孵育30分钟，弃固定液；每孔加入50μL2mg/mL甘氨酸(购自Solarbio公司)，脱色摇床孵育5分钟后，弃甘氨酸溶液；
每孔加入100μLPBS，脱色摇床清洗5分钟，弃PBS；每孔加入100μL渗透剂(0.5％TritonX-100(购自Solarbio公司)的PBS)脱色摇床孵育10分钟；PBS清洗1次，5分钟。
4、Apollo染色
每孔加入100μL的1X
Figure BDA0003973354690000091
染色反应液(表3)，避光、室温、脱色摇床孵育30分钟后，弃染色反应液；加入100μL渗透剂(0.5％TritonX-100的PBS)脱色摇床清洗2～3次，每次10分钟，弃渗透剂；
5、DNA染色
用去离子水按100：1的比例稀释试剂F，制备适量1XHoechst33342反应液，避光保存；
每孔加入100μL1XHoechst33342反应液，避光、室温、脱色摇床孵育30分钟后，弃染色反应液；每孔每次加入100μLPBS清洗1～3次；
6、图像获取及分析
染色完成后立即在NIKONTS2R-FL显微镜下进行观测。
7、结果
如图4所示，转染GNAI2siRNA的EdU阳性细胞数量极显著低于NC对照组(P<0.01)。由此可知，GNAI2对湖羊肌卫星细胞的增殖起促进作用。
实施例4
荧光定量检测GNAI2对分化相关基因相对表达量的影响
1、总RNA提取和cDNA第一链合成
参照实施例1进行总RNA提取和cDNA第一链合成
2、RT-qPCR
根据NCBI网站上公布的绵羊MyOG以及MyOD序列(登录号：NM_001174109.1、NM_001009390.1)，利用Primer3web(http://primer3.ut.ee/)设计上、下游引物。
MyOG
上游引物(SEQ ID NO.14)：AATGAAGCCTTCGAGGCCC
下游引物(SEQ ID NO.15)：CGCTCTATGTACTGGATGGCG
MyOD
上游引物(SEQ ID NO.16)：GCTCCAGAACCGCAGTAAGTT
下游引物(SEQ ID NO.17)：CGGCGACAGCAGCTCCATA
接下来的步骤参照实例2进行RT-qPCR试验
3、数据分析
根据RT-qPCR测得的CT值，通过2-ΔΔCT算法计算增殖基因的相对表达情况，利用软件SPSS16.0进行差异显著性分析，用GraphPadPrism6软件作图(见图4)。
4、结果
如图5所示，GNAI2干扰条件下的分化相关基因表达量显著高于GNAI2对照条件下的基因表达量(P<0.05)，说明GNAI2抑制湖羊骨骼肌细胞分化。
实施例5
免疫荧光MyH3检测GNAI2过表达与抑制条件下阳性肌管的分化情况：
1、细胞培养及转染
参照实施例1的方法进行湖羊肌卫星细胞培养与转染，细胞接种于24孔板。
待细胞长至80％转染相应的处理同时更换2％的马血清培养基(2％马血清+1％青霉素链霉素+97％DMEM)。
每个组3个平行孔，诱导分化4-5天后进行细胞免疫荧光试验。
2、细胞固定
PBS清洗2次，每次3-5分钟，加入300μL4％多聚甲醛室温固定30min。PBS清洗2次，每次3-5分钟，用0.5％TritonX-100室温通透20min，PBS清洗5min，加入300μL1％BSA(购自Solarbio公司)室温封闭1h。
3、封闭
除去封闭液加入200μL一抗MyH3(1：400)(购自Affinity公司)4℃过夜。用PBS清洗2次，每次3-5分钟，加入200μL二抗(1：1000)(购自Abconal公司)，室温避光孵育2h，PBS清洗2次，每次3-5分钟。加入200μLDAPI(5μg/ml)(购自Beyotime公司)染色5min，PBS清洗2次，每次3-5分钟。
4、图像获取及分析
染色完成后于NIKONTS2R-FL荧光倒置显微镜观察细胞分化、肌管形成情况。
5、结果
如图6所示，转染GNAI2抑制物的MyH3阳性肌管数量多于NC对照组。由此可知，GNAI2对湖羊肌卫星细胞的分化起抑制作用。
本研究发现，GNAI2作为IGFBP3下游靶基因，在肌肉生长发起过程中扮演重要的角色，本发明将GNAI2作为研究线索，通过全转录组筛选出在胎羊骨骼肌中高表达的基因GNAI2，并利用RT-qPCR、CCK-8、EdU以及免疫荧光技术为深入探究GNAI2参与湖羊肌肉细胞增殖分化的分子机制提供理论借鉴。
SEQ ID NO.1：
agacgctcggaactgccgactcgggagctacccgttgagggccggcggcgtgagcggagtggggtcgggc
ggggccgagccgggccggggccttgtgggggccgggcagcggccgggccggcggacggcgggatgggctg
caccgtgagcgcagaggacaaggcggcggccgagcgctccaagatgatcgacaagaacctgcgggaagac
ggcgagaaggcggcgcgggaggtgaagttgctgctcttgggtgctggggagtcagggaagagcaccattg
tcaagcagatgaagatcatccacgaggatggctactcggaggaggagtgccgacagtaccgggcggtcgt
ctacagcaacaccatccagtctattatggccattgtcaaagccatgggcaatctgcagattgactttgccgacccctccc
gcgcggacgatgccaggcagctgttcgcgctgtcgtgcacggctgaggagcagggcgtgctgcctgagga
cctgtccggtgtcatccggaggctctgggctgaccacggggtgcaggcctgctttggccgctcgcgggag
taccagctcaatgactctgccgcctactacctgaacgacctggagcgcatcgcccagagcgactacatcc
ctacgcagcaggacgtgctgcggactcgagtgaagaccacgggcatcgtggagacgcacttcaccttcaa
agacctacacttcaagatgtttgacgtgggcggccagcggtctgagcggaagaagtggatccactgctttgagggcgtca
cagccatcatcttctgtgtagctctgagcgcctatgacctggtgctcgccgaggacgaggagatgaaccgcatgcacgag
agcatgaagctgtttgacagtatctgcaacaacaagtggttcacagacacgtccatcatcctcttcctgaacaagaagga
cctgtttgaggagaagatcatacacagccccctgaccatctgcttccctgagtatacaggggccaacaagtacgacgagg
cagccagctacatccagagcaagttcgaggacctgaacaagcgcaaggacaccaaggagatctacacgca
cttcacgtgcgccactgacaccaagaacgtgcagttcgtgttcgacgccgtcactgacgtcatcatcaagaacaacctga
aggactgcggcctcttctgaggggcagcggggcctggcaggatgggccaccgccgactctgctaccccag
cccctgcggaagacgggggcaagaggaccacgctccccgcctgtccccctggccgcttttccccttctttcctctctgtt
tttggctccccaccgtccagccctcagctccagagacttgggggaggggctgccacaggcctccctgtttgaagcctgcc
cttgtcccaggtgcagggagtgccctagcccctcctggtctccattctggttttaaccattgttttgttctgtgatgggg
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gcccccacccccaagccactcggaggccccaaaggaaaaagcacaagaagcgtgagacgccaccattcct
gaagaccacagtccacttgttcattctcgtagcttttttttttttaattaaaagaaagtcaaaggggggggaaaaaaaag
aaaactgcaaacctagaaaactttttagaaaaaactatttaaaactgtcagatcctgaccagcacccacccaaccccttt
ccggtgattccgtgccttgagtgtgtctacgtgtttacacccatccctctgctggttgccccctgtgcgggtggcacccc
gaccctgccctccacagaattgggttccaagggctgttccagacaactgccaacatcactgagggcccca
ccccagtggccctgggccctggctccattaacctaaacgtagctccttagcgctaacctaggaaccgccgctgcctgctg
aggggccatgcccctcatgccctcgccccaggcccgggtccttcagcgttgaacacttccttgcttttttcacatgtttt
atggaattgttcacctggtttgaaataataaaacgtagaaagaaaaaaaaaaaa
SEQ ID NO.2：
atgggctgcaccgtgagcgcagaggacaaggcggcggccgagcgctccaagatgatcgacaagaacct
gcgggaagacggcgagaaggcggcgcgggaggtgaagttgctgctcttgggtgctggggagtcagggaag
agcaccattgtcaagcagatgaagatcatccacgaggatggctactcggaggaggagtgccgacagtacc
gggcggtcgtctacagcaacaccatccagtctattatggccattgtcaaagccatgggcaatctgcagattgactttgcc
gacccctcccgcgcggacgatgccaggcagctgttcgcgctgtcgtgcacggctgaggagcagggcgtgc
tgcctgaggacctgtccggtgtcatccggaggctctgggctgaccacggggtgcaggcctgctttggccg
ctcgcgggagtaccagctcaatgactctgccgcctactacctgaacgacctggagcgcatcgcccagagc
gactacatccctacgcagcaggacgtgctgcggactcgagtgaagaccacgggcatcgtggagacgcact
tcaccttcaaagacctacacttcaagatgtttgacgtgggcggccagcggtctgagcggaagaagtggatccactgcttt
gagggcgtcacagccatcatcttctgtgtagctctgagcgcctatgacctggtgctcgccgaggacgagg
agatgaaccgcatgcacgagagcatgaagctgtttgacagtatctgcaacaacaagtggttcacagacacgtccatcatc
ctcttcctgaacaagaaggacctgtttgaggagaagatcatacacagccccctgaccatctgcttccctgagtatacagg
ggccaacaagtacgacgaggcagccagctacatccagagcaagttcgaggacctgaacaagcgcaaggac
accaaggagatctacacgcacttcacgtgcgccactgacaccaagaacgtgcagttcgtgttcgacgccgtcactgacgt
catcatcaagaacaacctgaaggactgcggcctcttctga
SEQ ID NO.3：
GAGTACCAGCTCAATGACTCTGCC
SEQ ID NO.4：
TAGGTCTTTGAAGGTGAAGTGCGT
SEQ ID NO.5：
GCAUCGUGGAGACGCACUUTTAAGUGCGUCUCCACGAUGCTTSEQ ID NO.6：
GCGGGAGUACCAGCUCAAUTTAUUGAGCUGGUACUCCCGCTTSEQ ID NO.7：
GCAUCGUGGAGACGCACUUTTAAGUGCGUCUCCACGAUGCTTSEQ ID NO.8：
CGAGGGCTTCGACACTTAC
SEQ ID NO.9：
GTCTTCATTGCCAGCACATT
SEQ ID NO.10：
AGAAGTGGCTGCATCACAAG
SEQ ID NO.11：
TCTCAGAATCTCCAGGGAATAG
SEQ ID NO.12：
CCGAGGAGAACAAGCAGATC
SEQ ID NO.13：
GAGGGTGGGTTGGAAATG
SEQ ID NO.14：
AATGAAGCCTTCGAGGCCC
SEQ ID NO.15：
CGCTCTATGTACTGGATGGCG
SEQ ID NO.16：
GCTCCAGAACCGCAGTAAGTT
SEQ ID NO.17：
CGGCGACAGCAGCTCCATA
应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (9)

1.一种湖羊肌肉细胞增值相关的标志物，其特征在于：所述标志物包括GNAI2，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种湖羊肌肉细胞增值相关标志物的检测引物，其特征在于：所述检测引物选自特异性扩增GNAI2的引物，包括上游引物和下游引物，其上、下游引物序列分别为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。
3.权利要求1所述的标志物GNAI2在判定湖羊肌肉生长拐点中的应用。
4.权利要求1所述标志物GNAI2在制备影响湖羊肌肉细胞增殖分化的药物组合物中的应用。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于：所述药物组合物包括GNAI2的下调剂。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于：所述下调剂包括GNAI2的抑制物，GNAI2抑制物序列其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
7.如权利要求5或6所述的应用，其特征在于：所述药物组合物还包括与下调剂配伍的其他药类以及药学上可接受的干扰序列或辅料。
8.权利要求1所述标志物GNAI2在制备鉴定湖羊肌肉细胞增殖分化规律的产品中的应用，其特征在于：所述产品包括芯片、制剂或试剂盒。
9.一种鉴定湖羊肌肉细胞增殖分化效率的方法，其特征在于：包括，
用候选物质处理表达或含有GNAI2基因的体系，和检测所述体系中GNAI2基因的表达；
若GNAI2基因的表达或活性最高，则表明湖羊肌肉细胞增殖效率最高，分化效率最低。
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