CN114480672B

CN114480672B - 一种通过miR-145筛选高产肉率碱地黑牛的方法

Info

Publication number: CN114480672B
Application number: CN202210161441.4A
Authority: CN
Inventors: 董雅娟; 刘瑞莉; 王胜; 韩明轩; 于堃; 张文琦; 陈振鹏
Original assignee: Qingdao Agricultural University
Current assignee: Qingdao Agricultural University
Priority date: 2022-02-22
Filing date: 2022-02-22
Publication date: 2023-08-15
Anticipated expiration: 2042-02-22
Also published as: CN114480672A

Abstract

本发明属于生物育种技术领域，提供了一种miR‑145在碱地黑牛育种和调节MYPN基因表达中的应用。miR‑145能够通过抑制MYPN的表达，影响碱地黑牛的肌肉细胞的增殖和生长，从而影响肉质的生长，在育种中应筛选miR‑145含量低的个体作为高产肉率肉牛。本发明为优质肉牛的育种提供了新的方向。

Description

一种通过miR-145筛选高产肉率碱地黑牛的方法

技术领域

本发明属于生物育种技术领域，具体涉及miR-145的新应用。

背景技术

骨骼肌的肌纤维作为畜禽肉类食品的重要组成部分，肌纤维的性质也是影响其肉品质的重要因素。因此，在产肉动物育种过程中，研究骨骼肌的调控机制可以对提高畜禽产肉量以及改善肉品质有一定的指导意义。

miRNA（microRNA）是小分子非编码单链RNA，长度在22个核苷酸左右，目前发现的miRNA 近40000种。miRNAs广泛存在于多种真核生物中，miRNAs在生物体的细胞增殖、分化、凋亡等生物过程中起到广泛的调控作用，对生物体的生长发育有十分重要的影响。有研究表明，miR-145可以抑制缺氧诱导的小鼠的心肌细胞凋亡，减小缺血再灌注损伤导致的心肌梗死面积。根据以往研究表明，miR-145通过抑制靶基因FSCN1的表达来抑制成肌细胞C2C12的分裂增殖。有研究发现，miR-145在猪背最长肌中，随着年龄的增长表达量逐渐上升。冯阳等人揭示出miR-145在肌纤维形成过程中的差异表达情况，为进一步研究miR-145在骨骼肌发育过程中的功能提供了一定的依据。这说明miR-145对肌肉的生长发育具有一定的调控作用。

肌钯蛋白（MYPN）是2001年被发现的一个145 KD并广泛分布于骨骼肌和心肌中的肌节蛋白，其结构与普遍表达的肌动蛋白相关蛋白PALLD相似，它是通过标记辅助选择进行肉质选择的重要候选基因。MYPN的功能类似于脚手架，可以将脊椎动物Z线中的半肌动蛋白和α-辅肌动蛋白结合起来，α-辅肌动蛋白又直接与细肌丝相结合构成Z线内部网络。有研究表明，过表达MYPN的心脏锚蛋白重复序列（CARP）结合区域会使肌节蛋白的组分遭到严重的破坏，说明其表达有可能是通过MYPN和CARP的相互作用而使得肌纤维组织与肌肉基因存在关联；并且有关MYPN的研究主要集中于其对人类肌病的作用，如线状体肌病、渐进性肌无力、肾上腺素肌病等，并且有研究表明，MYPN突变可能导致肌张力降低和扩张型心肌病。在产肉动物上，有研究表明MYPN基因3’非编码区的一段序列AJ560657的231、298、318碱基处有3个SNP，通过对其进行肉质性状关联性分析，证明MYPN可作为影响猪肉质性状的候选基因。还有研究表明牛MYPN的A1795G SNP与牛的眼肌面积和系水力显著相关。Silvia等通过对不同品种猪进行了MYNP的SNP和胴体性状的关联研究，结果发现其可影响骨骼肌沉积和肉类生产特性。

山东胜伟集团是在盐碱地领域深耕实践的基础上，立足于盐碱地复育和肉牛良种繁育两大优势，在全国首创“盐碱地安格斯肉牛产业园”模式。碱地黑牛是山东胜伟集团与国际肉牛繁育机构联合，通过筛选世界顶级安格斯肉牛基因，培育研发出的适应盐碱地的高端肉牛品种，该品种牛具有生长发育快，早熟，易肥育，易配种，肉质好，出肉率高，对环境适应能力强，分娩难产率低等特点，是生产大理石纹牛肉的优秀牛种。

发明内容

针对现有技术中的问题，本发明提供一种bta-miR-145在调节MYPN基因表达中的应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。

一种miR-145在碱地黑牛育种中的应用。

所述应用为筛选miR-145含量低的个体作为高产肉率肉牛。

一种miR-145在调节MYPN基因表达中的应用。

优选地，所述应用为将含miR-145模拟物（mimics）或抑制剂（inhibitor）的载体转染靶细胞。

优选地，所述载体包括但不限于慢病毒、腺病毒、腺相关病毒、脂质体和构建病毒的质粒。

优选地，所述靶细胞选自碱地黑牛的体细胞、受精卵、细胞系。

本发明具有以下优点：

本发明通过试验证明miR-145可以调节碱地黑牛骨骼肌的增殖和生长，还能调节MYPN基因的表达。miR-145能够通过抑制MYPN的表达，影响碱地黑牛肌肉细胞的增殖和生长，从而影响肉质的生长，在育种中应筛选miR-145含量低的个体作为高产肉率肉牛。本发明为优质肉牛的育种提供了新的方向。

附图说明

图1是差异miRNA聚类分析图和bta-miR-145在背肌中的表达量；

图2是碱地黑牛骨骼肌细胞诱导分化过程（2d、3d、4d、5d）；

图3是Edu检测细胞增殖；

图4是MYPN和GAPDH基因熔解曲线（上）和扩增曲线（下）和MYPN基因在碱地黑牛不同组织的表达量分析；

图5是双荧光素酶报告基因检测bta-miR-145与MYPN-3’UTR相互作用；

图6是免疫荧光检测MYPN表达量。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。

实施例1 差异miRNA筛选

选取12月龄碱地黑牛和鲁西黄牛各4头，采背最长肌组织置于液氮保存。分别用Trizol试剂（Invitrogen）提取总RNA。当RIN≥7.0且28S/18S≥0.7时，表示提取的RNA质量合格。本研究样品RIN均在7.3之上，OD_260/280的比值均在0.8-2.0的范围内，说明提取的RNA完整性好，纯度高，可用于后续的文库构建。

将RNA样品构建序列文库：使用Illumina基因组分析仪系统测序后，构建sRNA文库。通过比对分析软件Bowtie（设置允许一个错配）将sRNA测序的clean reads定位到参考基因组上，共获得26061624个clean reads；与miRBase数据库的牛物种的参考序列进行比较，匹配到已知miRNA上的Total和Unique Clean Reads的总数量分别为29849254和37946。

表1 差异表达的miRNA

根据差异miRNA筛选标准：|log2(Fold_change)|≥1且Q≤0.05，获得差异表达的miRNA 71个（表1），其中上调39个，下调32个（图1A）。根据TPM（Transcripts Per Million）筛选出碱地黑牛和鲁西黄牛中表达量有差异的miRNA为miR-145（图1B）。

实施例2 miR-145对碱地黑牛骨骼肌细胞分化和增殖的影响

将5月龄碱地黑牛胎儿的后肢肌肉为来源分离培养获得牛原代细胞。待细胞生长至80%融合时，加入含有2%马血清的DMEM培养基进行体外成肌诱导分化，收集细胞，用完全培养基调整细胞悬液浓度，分于6孔板中，2×10⁵个细胞/孔，每孔2mL，置于37℃、5% CO₂培养箱中培养24h，转染空白对照（blank）、miR-145过表达阴性对照（NC mimic）、miR-145过表达（miR-145 mimic）、miR-145抑制阴性对照（NC inhibitor）和miR-145抑制（miR-145inhibitor），继续培养48h后将培养基换成2%马血清的高糖DMEM培养基，继续培养。转染后2d，3d，4d，5d观察细胞形态，在0h、24h、48h、72h分别采用CCK-8和EdU法检测细胞增殖率。

表2 miR-145 mimic和inhibitor序列

转染后2-5d不同处理的细胞形态如图2所示：使用2%马血清诱导分化2天后开始出现细胞融合现象，与blank组比较，miR-145 mimic组细胞融合数量较少，miR-145inhibitor组有大量细胞出现融合现象并形成多核细胞；3天时，与blank组，相比miR-145inhibitor组形成大量肌管，细胞长度明显增加，miR-145 mimic组出现少量肌管；4天和5天时，与blank组相比，miR-145 inhibitor组肌管直径增大，数量无明显差异，miR-145 mimic组肌管的直径较小，数量无明显差异。可见，miR-145抑制牛骨骼肌细胞分化。

表3 CCK-8法检测细胞增值率

CCK-8法检测细胞增值率结果如表3所示：0h时各处理组无差异，24h时，与blank组相比，miR-145 mimic开始降低细胞增殖率，而miR-145 inhibitor组升高增值率；48h时，miR-145 mimic组显著降低细胞增殖率（P<0.05）；72h时，miR-145 mimic组极显著降低细胞增殖率（P<0.01），且miR-145 inhibitor组显著提高了细胞增殖率（P<0.05）。Edu法检测细胞增值率结果如图3所示：与blank组相比，miR-145 mimic显著降低了Edu阳性细胞的数量（P<0.01），miR-145 inhibitor显著增加了Edu阳性细胞的数量（P<0.01）。综上所述，CCK-8和EdU法的结果均表明miR-145抑制碱地黑牛骨骼肌细胞增殖。

实施例3 miR-145靶基因筛选及表达鉴定

使用TargetScan 7.2软件对bta-miR-145进行靶基因预测，共预测靶基因797个，根据KEGG富集和GO功能注释最终选取MYPN为其靶基因，并进行后续功能验证。

选取12月龄碱地黑牛和鲁西黄牛各4头，采背最长肌、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、脂肪组织置于液氮保存。分别用Trizol试剂（Invitrogen）提取总RNA，然后反转录获得cDNA，以其为模板对MYPN基因进行SYBR Green qPCR，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）为内参基因，检测各个样本CT值，并求平均值，计算各基因mRNA相对表达水平。

表4 各基因qPCR引物

MYPN和GAPDH基因熔解曲线和扩增曲线（图4A），无杂峰，峰值单一，特异性良好。荧光定量PCR结果显示，MYPN在碱地黑牛背最长肌中表达量最高，极显著于其他组织（P＜0.01），依次为肺脏、心脏、肾脏、肝脏，在脾脏和脂肪中表达量最低（图4B）。

实施例4 miR-145与MYPN基因表达的控制

根据表5分别合成MYPN基因3’非编码区的基因，其中WT为野生型，MUT为突变型，并且两端添加酶切位点，双酶切后连接同样双酶切的pSI-Check2载体，序列验证正确的质粒分别命名为MYPN-3UTR-WT和MYPN-3UTR-MUT。

表5 miR-145以及MYPN基因3’非编码区序列（下划线为酶切位点）

合成表5中的bta-miR-145和表2中的NC mimic正义链，用LipoFiter^TM转染试剂（汉恒生物科技(上海)有限公司）将其和MYPN-3UTR-WT或MYPN-3UTR-MUT质粒转染293T细胞，转染6h后换取新鲜培养基，转染48h后收集细胞检测，转染成功的细胞进行双荧光素酶检测。

双荧光素酶检测使用Promega Dual-Luciferase system试剂盒，按照说明书进行操作，然后测定记录Renilla luciferase值，此即为报告基因发光值。结果如图5所示：与NC组相比，bta-miR-145显著下调MYPN-3’UTR-WT的luciferase的表达（P<0.001）,突变后，与NC相比，bta-miR-145未能下调MYPN-3’UTR-MUT的luciferase的表达（P＞0.05），说明二者存在结合作用。

实施例5 miR-145对MYPN基因表达的影响

参照实施例2中的方法将碱地黑牛原代细胞进行成肌诱导分化，然后转染blank、NC mimic、miR-145 mimic、NC inhibitor和miR-145 inhibitor，继续培养48h后将培养基换成2%马血清的高糖DMEM培养基，继续培养。

收取细胞进行MYPN免疫荧光试验。取出各组样本（12孔板），用1mL PBS洗2次，每次3min，弃去PBS；加入1mL4%多聚甲醛室温固定30min；用1mL PBS洗2次，每次3min，弃去PBS；加入1mL 0.5%TritonX-100室温通透30min；用1mL PBS洗2次，每次3min，弃去PBS；加入1mL5%BSA，37℃封闭1h，弃去封闭液；加入300μL PBS稀释后的抗体，4℃，孵育过夜；用1mL PBS洗2次，每次5min，弃去PBS；加入300μL PBS稀释后的抗体，37℃，孵育1h；用1mL PBS洗2次，每次5min，弃去PBS；加入300μL抗荧光淬灭封片液（含DAPI）；荧光显微镜观察拍照。

MYPN免疫荧光结果（图6）显示，与空白组相比，miR-145 mimic抑制MYPN的表达；miR-145 inhibitor促进了MYPN的表达。

序列表

<110> 青岛农业大学

<120> 一种通过miR-145筛选高产肉率碱地黑牛的方法

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

guccaguuuu cccaggaauc ccu 23

<210> 2

<211> 22

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

uuuguacuac acaaaaguac ug 22

<210> 3

<211> 23

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

agggauuccu gggaaaacug gac 23

<210> 4

<211> 22

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

caguacuuuu guguaguaca aa 22

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gatgctggtg ctgagtatgt 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

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<400> 6

gcagaaggtg cagagatgat 20

<210> 7

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cctccgcccg tgttcta 17

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gatgcccgct tcgttc 16

<210> 9

<211> 23

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

guccaguuuu cccaggaauc ccu 23

<210> 10

<211> 532

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

agggggcaga ctgtggaggg ggaaggagga caaaccagat aaggtggttt ccaatcaact 60

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<211> 532

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

agggggcaga ctgtggaggg ggaaggagga caaaccagat aaggtggttt ccaatccagt 60

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Claims

1.一种miR-145在调节碱地黑牛MYPN基因表达中的应用，其特征在于，所述应用为将含miR-145模拟物（mimics）或抑制剂（inhibitor）的载体转染靶细胞；

所述靶细胞选自碱地黑牛的体细胞、受精卵、细胞系。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述载体选自慢病毒、腺病毒、腺相关病毒、脂质体或构建病毒的质粒。