CN112575095A

CN112575095A - 与鸡屠宰性状相关的miRNA及其应用

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Publication number: CN112575095A
Application number: CN202011557638.7A
Authority: CN
Inventors: 张跟喜; 张欣超; 李培峰; 吴鹏飞; 何明亮; 张丽; 魏清宇; 周楷智; 张涛; 谢恺舟; 戴国俊; 王金玉
Original assignee: Yangzhou University
Current assignee: Yangzhou University
Priority date: 2020-12-24
Filing date: 2020-12-24
Publication date: 2021-03-30
Anticipated expiration: 2040-12-24
Also published as: CN112575095B

Abstract

本发明公开了与鸡屠宰性状相关的miRNA，所述的miRNA为Novel‑gga‑miR‑158，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明还公开了用于检测所述的与鸡屠宰性状相关的miRNA的表达量的特异性引物。本发明还公开了检测试剂盒及其检测方法，本发明还公开了所述的miRNA、特异性引物、所述的检测试剂盒在在开发鸡屠宰性状的辅助选择标记中的应用。本发明最后公开了筛选或培育优良屠宰性能的鸡的方法。本发明提供的检测试剂盒可用于检测Novel‑gga‑miR‑158在鸡肌肉组织的表达量，检测方法简单快捷。本发明还可以利用该Novel‑gga‑miR‑158的表达量筛选或培育屠宰性能优良的鸡。

Description

与鸡屠宰性状相关的miRNA及其应用

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体涉及与鸡屠宰性状相关的miRNA及其应用。

背景技术

家禽业是畜牧业的重要组成部分。黄羽肉鸡源自我国本土家禽品种，与白羽肉鸡相比，具有独特的风味和更好的肉质。在我国，黄羽肉鸡的产量逐年增加，近两年与白羽肉鸡产量基本相当。但黄羽肉鸡在肌肉产量、生长速度和饲料利用率方面存在不足，仍有很大的改良潜力。

miRNA是长度大约在20nt的非编码RNA，它通过与靶基因的3′UTR区结合，进行转录后调控。已有大量的研究表明miRNA在细胞的增殖、分化、凋亡等生命活动过程中发挥着重要作用。为了进一步阐明影响鸡屠宰性状的分子遗传机制，需对影响鸡该性状的非编码RNA进行挖掘。

RNA测序(RNA-seq)作为一种高通量技术，已广泛的用于挖掘与重要性状相关的关键miRNAs，也用于鉴定新的miRNAs，新的miRNAs的发现将有利于阐明miRNA在鸡生长发育中的调控机制。

目前关于与鸡屠宰性状相关的miRNAs报道很少，因此鉴定新的miRNAs来研究鸡发育过程尤为重要，用于开发鸡屠宰性状的辅助选择标记。

发明内容

发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明所要解决的技术问题是提供了一种与鸡屠宰性状相关的miRNA，命名为Novel-gga-miR-158。

本发明还要解决的技术问题是提供了用于检测所述的鸡屠宰性状相关的miRNA表达量的特异性引物。

本发明还要解决的技术问题是提供了一种检测试剂盒及其检测方法。

本发明还要解决的技术问题是提供了所述的miRNA、所述的特异性引物、所述的检测试剂盒在开发鸡屠宰性状的辅助选择标记中的应用。

本发明最后要解决的技术问题是提供了一种筛选或培育优良屠宰性能的鸡的方法。

技术方案：为了实现上述发明目的，本发明提供了与鸡屠宰性状相关的miRNA，所述的miRNA为Novel-gga-miR-158，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明内容还包括用于检测所述的与鸡屠宰性状相关的miRNA的表达量的特异性引物，所述特异性引物序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明内容还包括一种荧光定量检测试剂盒，所述试剂盒包括所述的特异性引物。

其中，所述荧光定量检测试剂盒还包括2×miRcute Plus miRNA PreMix、通用反向引物和无酶双蒸水组成。

其中，所述检测试剂盒还包括内参U6的引物对，所述内参U6的引物序列如SEQ IDNO.3和SEQ ID NO.4所示。

本发明内容还包括所述的miRNA、所述的特异性引物或所述的荧光定量检测试剂盒在开发鸡屠宰性状的辅助选择标记中的应用。

其中，所述应用为通过荧光定量PCR检测鸡腿肌组织中所述的miRNA的表达量。

本发明内容还包括所述的检测试剂盒的检测方法，具体方法为通过荧光定量PCR检测Novel-gga-miR-158在鸡肌肉组织的表达量验证鸡屠宰性能的好坏。

本发明内容还包括筛选或培育优良屠宰性能的鸡的方法，其方法包括降低Novel-gga-miR-158表达量。

本发明的原理是：本发明通过提取鸡肌肉组织总RNA进行反转录，得到cDNA。利用扩增Novel-gga-miR-158的特异性上游引物、内参U6引物等组成的试剂盒进行荧光定量PCR，PCR反应体系和扩增程序同常规的荧光定量PCR。采用2^-ΔΔCT方法对该miRNA在各个体中的表达水平进行判定，确定其屠宰性能的高低，新的miRNAs的发现将有利于阐明miRNA在鸡生长发育中的调控机制。

有益效果：与现有技术相比，本发明具备以下优点：本发明首次研究获得了与鸡屠宰性状相关的的miRNA，本发明提供的Novel-gga-miR-158可用于开发与鸡屠宰性状相关的的辅助选择标记，同时用于研究非编码RNA在鸡生长性状中的调控机制；并且同时基于该miRNA进一步研究获得了检测该miRNA表达量的特异性引物，并进一步研发获得了检测试剂盒。本发明提供的检测试剂盒可用于检测Novel-gga-miR-158在鸡肌肉组织的表达量，检测方法简单快捷。本发明还可以利用该Novel-gga-miR-158的表达量筛选或培育屠宰性能优良的鸡。

附图说明

图1、Novel-gga-miR-158及其靶基因调控图；

图2、qPCR验证结果。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明所述的技术方案给予进一步详细的说明。

实施例1基于RNA-seq和mRNA联合分析获得影响鸡屠宰性状的miRNA---Novel-gga-miR-158

1.测序样本的采集

实验样本采自山西农业大学(原山西省农科院畜牧研究所)饲养管理水平一致的边鸡群体。16周龄时，在边鸡快、慢品系中分别随机选择3只体重相近的健康个体，采集其腿肌组织用于高通量测序(RNA-seq)，测序由北京百迈客生物科技有限公司完成。同时测定其活重、屠宰重、胸肌重、腿肌重、全净膛重和半净膛重等屠宰性状。所采集的快、慢品系个体的屠宰性状测定结果见表1。

表1快、慢品系边鸡屠宰性状测定

注：同一行肩标不同大写字母表示差异极显著(P＜0.01)。

2.差异表达miRNA的筛选和靶基因预测

在对RNA-seq结果进行质量控制后，将快、慢组间的miRNA表达水平差异P≤0.05定义为差异表达miRNA，共获得42个差异表达miRNA，其中包括gga-miR-455-3p，gga-miR-460b-5p，gga-miR-7b，gga-miR-205a，gga-miR-184-3p，gga-miR-194等22个已知的miRNA，以及novel-gga-miR-158，novel-gga-miR-144，novel-gga-miR-204，novel-gga-miR-183，novel-gga-miR-81，novel-gga-miR-292等20个新的miRNA。采用miRanda和RNAhybrid两个软件对差异基因进行靶基因预测，对获得的靶基因取交集后进行Pathway分析。显著富集到7个信号通路，Novel-gga-miR-158的靶基因在7个信号通路中被富集的频率最高，表2列出3条与肌肉发育相关的重要通路。

表2 Novel-gga-miR-158靶基因显著富集的与肌肉发育相关的通路

3.miRNA和靶基因调控网络构建

基于STRING数据库，预测了所有靶基因的相互关系，利用Cytoscape (3.6.1)软件前50个主要的靶基因构建了调控网络，发现这50个靶基因受Novel-gga-miR-158、novel-gga-miR-144、Novel-gga-miR-291、gga-miR-205a、gga-miR-221-5p、gga-miR-338-3p等13个差异表达的miRNA调节，进一步分析发现Novel-gga-miR-158的靶基因占的比例最高(图1)，提示Novel-gga-miR-158具有重要的功能。

4.qPCR对Novel-gga-miR-158进行验证

利用快、慢长系边鸡的腿肌组织提取总RNA进行反转录，得到cDNA。根据北京百迈客生物科技有限公司高通量测序获得的Novel-gga-miR-158核苷酸序列，即SEQ ID NO.1，设计特异性上游引物SEQ ID NO.2。内参基因引物序列根据NCBI中U6的mRNA序列(登录号：NM_001006337.2)进行设计。采用包含特异引物的荧光定量试剂盒，按照常规反应体系和扩增程序对该miRNA的表达量进行测定。

该试剂盒由特异性引物、内参U6的引物对、2×miRcute Plus miRNA PreMix (含SYBR&ROX)、通用反向引物和无酶双蒸水组成，其中所述的特异性引物的序列如SEQ IDNO.2，内参U6的引物对如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示；2×miRcute Plus miRNAPreMix (含SYBR&ROX)、通用反向引物和无酶双蒸水均来自南京诺唯赞生物科技股份有限公司的荧光定量试剂盒(ChamQTM

qPCR Master Mix)。Novel-gga-miR-158：5′-UCGCCCUUCUCGUCCCACCAGA-3′(SEQ ID NO.1)Novel-gga-miR-158：F：5′-CGTCGCCCTTCTCGTCCC-3′(SEQ ID NO.2)

U6：F：5′-GTCACTTCTGGTGGCGGTAA-3′(SEQ ID NO.3)

R：5′-GTTCAGTAGAGGGTCAAA-3′(SEQ ID NO.4)

荧光定量反应体系为20μl：2×miRcute Plus miRNAPreMix 10.0μl；特异性引物0.4μl；通用反向引物0.4μl；模板cDNA2.0μl；ddH₂O 7.2μl。荧光定量反应程序：95℃预变性5min；95℃10sec，60℃30sec，40个循环；95℃15sec，60℃60sec，95℃15sec获得溶解曲线。

运用2^-ΔΔCT方法分析边鸡快、慢长个体腿肌组织中Novel-gga-miR-158的相对表达量。由图2可知，qPCR显示慢长系个体中该miRNA的表达量为快长系个体的2倍左右，与RNA-seq的测序结果趋势一致。本发明提供的试剂盒可用于检测Novel-gga-miR-158在鸡肌肉组织的表达量，检测方法简单快捷，本发明提供的Novel-gga-miR-158可用于开发鸡屠宰性状的辅助选择标记，同时用于研究miRNA在鸡生长发育中的调控机制。

序列表

<110> 扬州大学

<120> 与鸡屠宰性状相关的miRNA及其应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> RNA

<213> miRNA(Novel-gga-miR-158)

<400> 1

ucgcccuucu cgucccacca ga 22

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 特异性引物(Novel-gga-miR-158)

<400> 2

cgtcgccctt ctcgtccc 18

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> u6上游引物(Artificial Sequence)

<400> 3

gtcacttctg gtggcggtaa 20

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> u6下游引物(Artificial Sequence)

<400> 4

gttcagtaga gggtcaaa 18

Claims

1.与鸡屠宰性状相关的miRNA，其特征在于，所述的miRNA为Novel-gga-miR-158，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.用于检测权利要求1所述的与鸡屠宰性状相关的miRNA的表达量的特异性引物，其特征在于，所述特异性引物序列如SEQ ID NO.2所示。

3.一种荧光定量检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求2所述的特异性引物。

4.根据权利要求3所述的荧光定量检测试剂盒，其特征在于，所述荧光定量检测试剂盒还包括2× miRcute Plus miRNA PreMix、通用反向引物和无酶双蒸水组成。

5.根据权利要求3所述的荧光定量检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒还包括内参U6的引物对，所述内参U6的引物序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

6.权利要求1所述的miRNA、权利要求2所述的特异性引物或权利要求3~5任一项所述的荧光定量检测试剂盒在开发鸡屠宰性状的辅助选择标记中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述应用为通过荧光定量PCR检测鸡腿肌组织中权利要求1所述的miRNA的表达量。

8.权利要求3~5任一项所述的检测试剂盒的检测方法，其特征在于，具体方法为通过荧光定量PCR检测Novel-gga-miR-158在鸡肌肉组织的表达量验证鸡屠宰性能的好坏。

9.一种筛选或培育优良屠宰性能的鸡的方法，其特征在于，其方法包括降低Novel-gga-miR-158表达量。