CN103599337A - 大蒜皂苷脂质体及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种大蒜皂苷脂质体，包括下列重量份的组分：大蒜皂苷1份、磷脂10～100份、胆固醇1～50份，乳化剂0～50份，其可以通过薄膜分散法、超声分散法、逆向蒸发法等常规的方法制备，例如注入法、冷冻干燥法等制备。所述大蒜皂苷脂质体可以制成片剂、胶丸、口服液、注射剂、气雾剂或滴剂等多种剂型，用于制备抗菌、降胆固醇、降血脂、抗血小板聚集和提高纤溶活性、抗缺氧、抗氧化损伤等的药物。

Description

大蒜皂苷脂质体及其制备方法

技术领域

本发明涉及药物制剂领域，具体涉及大蒜皂苷的脂质体制剂及其制备方法。

背景技术

大蒜（garlic）为百合科葱属植物蒜的地下鳞茎，目前世界各地均有种植。大蒜是人类日常生活中不可缺少的佐料，同时具有抗菌、消炎、杀虫、降血脂、降血压、抗风湿、抗肿瘤、调节机体免疫力和抗氧化等多种生理活性，是药食同源的宝贵资源。大蒜的成分复杂，主要是含硫有机化合物、糖类、氨基酸类、酶、脂类、维生素微量元素和皂苷类等多种成分。不同加工过程的大蒜制品，其化学成分不同，因而具有不同的功效，且安全程度也不同。大蒜的生物活性成分还不完全清楚，目前认为主要是含硫化合物和皂苷类。研究过程中需要将大蒜成分提取分离后做进一步活性确证。

皂苷（saponin）又称碱皂体、皂素、皂苷、皂角苷或皂草苷，由皂苷元与糖构成。自1982年Smoczkiewicz MA等在大蒜提取物中检测到甾体皂苷起，到目前为止各国研究学者已陆续从大蒜中提取分离鉴定了20多种皂苷类化合物。同时，还证实了大蒜皂苷具有抗菌、降低胆固醇、抗血小板聚集和提高纤溶活性、抗缺氧、抗氧化损伤等多种生物活性（大蒜皂苷研究进展，宋兴良，临沂师范学院学报，2011，33（6），p.74-77）。

现有文献已经报道了大蒜皂苷的提取方法，然而目前却鲜有对大蒜皂苷剂型制备和开发利用的报道，使大蒜皂苷的用途未能得到充分有效的利用。

发明内容

本发明的目的在于弥补现有技术的不足，提供一种大蒜皂苷脂质体及其制剂。

为实现上述目的，本发明提供以下技术方案：

一种大蒜皂苷脂质体，包括下列重量份的组分：大蒜皂苷1份、磷脂10～100份、胆固醇1～50份，乳化剂0～50份。

在一种优选实施方式中，所述大蒜皂苷脂质体包括下列重量份的组分：大蒜皂苷1份、磷脂10～30份、胆固醇2～10份，乳化剂0～30份。

所述磷脂可以是天然磷脂或合成磷脂。所述磷脂选自大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂、脑磷脂、磷脂酰乙醇胺（PE）、磷脂酸（PA）、磷脂酰胆碱（PC）、磷脂酰甘油（PG）、磷脂酰肌醇（PI）、二鲸蜡磷酸酯（DCP）、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱（DMPC）、二月桂酰磷脂酰胆碱（DLPC）等的一种或多种。

所述乳化剂对脂质体混悬液的均匀性和稳定性有促进作用。所述乳化剂选自吐温、泊洛沙姆等的一种或多种。

所述磷脂、胆固醇、乳化剂与大蒜皂苷活性成分的含量配比太小，则影响脂质体的稳定性、包封率和载药量；反之，如磷脂、胆固醇、乳化剂的用量过多，不仅造成原料浪费和增加成本，过多的乳化剂还可能增加毒性。

本发明的大蒜皂苷脂质体可以采用常规的方法制备，例如注入法、薄膜分散法、超声分散法、逆向蒸发法、冷冻干燥法等。制得的脂质体粒径形态均一、粒径为0.1～5μm，包封率高、稳定性好，符合药典要求。

例如，采用薄膜分散法制备所述大蒜皂苷脂质体包括步骤：

1）将磷脂和胆固醇溶于可挥发有机溶剂中，并在30～50℃下旋转蒸发形成薄膜；

2）在pH6.0～7.5的磷酸盐缓冲液中依次加入乳化剂（如果有的话）和大蒜皂苷得到溶液；

3）将步骤2）所得的溶液加入步骤1）形成的薄膜中，混合搅拌得大蒜皂苷脂质体混悬液。

上述方法还可以进一步包括步骤：

4）将步骤3）的脂质体混悬液冷冻干燥或喷雾干燥，得到固态的大蒜皂苷脂质体。

所述制备方法的步骤1）中使用的可挥发有机溶剂选自甲醇、乙醇、乙醚、丙酮、氯仿等的一种或多种。步骤2）的磷酸盐缓冲液的pH优选为6.8。

所述大蒜皂苷脂质体可以制成多种剂型，例如片剂、胶丸、口服液、注射剂、气雾剂或滴剂。

所述大蒜皂苷脂质体可以用于制备抗菌、降胆固醇、降血脂、抗肿瘤、抗血小板聚集和提高纤溶活性、抗缺氧、抗氧化损伤等的药物。除制备药物外，本发明的大蒜皂苷脂质体还可以广泛用于保健食品、化妆品等领域。

具体实施方式

以下实施例用于详细说明本发明的技术内容，但不应理解为对本发明保护范围的限制。除非特别说明，实施例中所用的试剂和材料均为普通市售产品。

材料与仪器：粒径检测仪Mastersizer2000(英国马尔文公司，230型精密pH计(美国奥立龙)，TU-8010紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)。

大蒜皂苷可以采用现有技术中已知的任意方法制备。本发明以下实施例中使用的大蒜皂苷通过下述方法制备：取蒜片1kg，中药粉碎机粉碎过60目筛，加入体积百分浓度为70%的乙醇3L，在温度10℃下搅拌提取72小时，离心，上清液旋转蒸发回收乙醇并适当浓缩，得提取浓缩液。提取浓缩液过D101型大孔树脂柱，用8倍以上柱体积的蒸馏水洗柱，约5倍柱体积的体积百分浓度为7%的乙醇洗脱（用紫外检测仪检测上样和洗脱曲线，恒流泵控制上样和洗脱速度），收集洗脱液，旋转蒸除溶剂，残余物冷冻干燥，即得大蒜皂苷。大蒜皂苷是大蒜中的主要活性成分之一，具有抗菌、降血脂、抗动脉硬化、抗肿瘤等作用。所制得的大蒜皂苷不含有大蒜油和s-烯丙半胱氨酸、s-烯丙基疏基-L-半胱氨酸等已知活性物质。

实施例1大蒜皂苷脂质体的制备

处方：

大蒜皂苷	0.3g
		大豆卵磷脂	6.0g
胆固醇	2.0g

制备方法（薄膜分散法）：将6.0大豆卵磷脂、2.0g胆固醇溶于20ml乙醚中，旋转蒸发形成薄膜；将0.3g大蒜皂苷溶于约5ml磷酸盐缓冲液（pH6.8）中，并将制得的溶液加入上述薄膜中，30℃下放置30min；补加磷酸盐缓冲溶液至300ml，30℃下搅拌1.5h，得大蒜皂苷脂质体混悬液。每毫升混悬液约含有固体脂质体27.6mg。大蒜皂苷脂质体混悬液经冷冻干燥，可得到固态的大蒜皂苷脂质体。

将大蒜皂苷脂质体混悬液5℃放置10天，没有沉淀析出。应用超滤离心法测定包封率为75.10%。粒径为0.077～4.366μm之间，平均粒径为1.217μm。

实施例2大蒜皂苷脂质体的制备

处方：

大蒜皂苷	0.2g
		蛋黄卵磷脂	2.5g
胆固醇	1.1g

制备方法（逆向蒸发法）：将2.5g蛋黄卵磷脂、1.1g胆固醇溶于20ml乙醚中，加入4ml含有0.2g大蒜皂苷的磷酸盐缓冲液（pH6.8），超声处理2min（每处理0.5min，间歇0.5min），旋转蒸发至凝胶状，涡旋振荡使凝胶转相，继续旋转蒸发除去乙醚，超速离心（10000r.min^-1离心60min）除去游离的大蒜皂苷，取沉淀，加磷酸盐稀释（pH6.8）（稀释至300ml体积），得大蒜皂苷脂质体混悬液。每毫升混悬液含有固体脂质体约12.6mg。大蒜皂苷脂质体混悬液经冷冻干燥，可得到固态的大蒜皂苷脂质体。

将大蒜皂苷脂质体混悬液5℃放置10天，没有沉淀析出。应用超滤离心法测定包封率为66.41%。粒径为0.084～2.978μm之间，平均粒径为1.035μm。

实施例3大蒜皂苷脂质体的制备

处方：

大蒜皂苷	0.2g
		蛋黄卵磷脂	2.0g
胆固醇	1.6g
		吐温80	2.0g
泊洛沙姆F68	3.0g

制备方法：将2.5g蛋黄磷脂，2.0g胆固醇共溶于15ml乙醇中，于30℃的水浴中旋转蒸发成膜；依次将3.0g泊洛沙姆F68，2.0g吐温80，0.2g大蒜皂苷加入5ml的磷酸盐缓冲溶液（pH6.8）中制得溶液；将该溶液加入上述膜中，涡旋混合后加磷酸盐缓冲溶液（pH6.8）稀释至300ml，磁力搅拌匀化60min，得脂质体混悬液。每毫升混悬液含有固体脂质体约29.3mg。大蒜皂苷脂质体混悬液经冷冻干燥，可得到固态的大蒜皂苷脂质体。

将大蒜皂苷脂质体混悬液5℃放置10天，没有沉淀析出。。应用超滤离心法测定包封率为71.97%。粒径为0.05-0.1μm之间，平均粒径为0.160μm。

实施例4大蒜皂苷脂质体的制备

处方：

大蒜皂苷	0.3g
		大豆卵磷脂	4.0g
胆固醇	0.6g
		吐温80	6.4g

制备方法（注入法）：将4.0g卵磷脂和0.6g胆固醇共溶于10ml乙醇；将6.4g吐温80溶于55℃40ml磷酸缓冲盐溶液中（pH6.8），再将0.3g大蒜皂苷溶解于上述磷酸盐缓冲溶液中；将醇溶液匀速注入上述水溶液中，补加磷酸盐缓冲溶液（pH6.8）至300ml，慢速搅拌20min，55℃水浴保温50min，超声3min，过0.45μm滤膜，即得大蒜皂苷脂质体混悬液样品。每毫升混悬液含有固体脂质体37.6mg。大蒜皂苷脂质体混悬液经冷冻干燥，可得到固态的大蒜皂苷脂质体。按以上步骤，不加大蒜皂苷制备空白脂质体溶液（备用）。

将大蒜皂苷脂质体混悬液5℃放置10天，没有沉淀析出。应用超滤离心法测定包封率为65.23%。粒径为0.052-0.417μm之间，平均粒径为0.339μm。

实施例5大蒜皂苷脂质体的制备

处方：

大蒜皂苷	0.2g
		大豆卵磷脂	6.0g
胆固醇	2.0g
		泊洛沙姆F68	6.0g

制备方法：将6.0g大豆卵磷脂、2.0g胆固醇溶于20ml乙醚中，旋转蒸发形成薄膜；将6.0g泊洛沙姆F68和0.2g大蒜皂苷溶于约20ml磷酸盐缓冲液（pH6.8中，并将制得的溶液加入上述薄膜中，30℃下放置30min；补加磷酸盐缓冲溶液（pH6.8）至300ml，30℃下搅拌1.5h，得大蒜皂苷脂质体混悬液。每毫升混悬液约含有固体脂质体47.3mg。大蒜皂苷脂质体混悬液经冷冻干燥，可得到固态的大蒜皂苷脂质体。

将大蒜皂苷脂质体混悬液5℃放置10天，没有沉淀析出。应用超滤离心法测定包封率为70.64%。粒径为0.087-1.522μm之间，平均粒径为1.254μm。

实施例6缓释片剂的制备

处方：

大蒜皂苷脂质体混悬液	20ml
		乳糖	1.8g
羟丙基甲基纤维素	1.6g
		预胶化淀粉	0.04g
硬脂酸镁	0.02g

制备方法：20ml大蒜皂苷脂质体混悬液（实施例1）与1.8g乳糖、1.6g羟丙基甲基纤维素、0.04g预胶化淀粉混匀，20ml乙醇做润湿剂制成软材，用16目尼龙筛网制粒，40℃干燥0.5h，16目尼龙筛网整粒，加0.02g硬脂酸镁混匀，压片，即得。

按中国药典2010年版溶出度测定法第一法测定，结果显示该缓释片剂2h释放度31%，5h释放度80%，8h释放度88%，12h释放度90%，18h和24h释放度92%，具有缓释释放的特征。

实施例7大蒜皂苷脂质体对皮肤刺激性实验

将实施例1-5的样品涂抹于10名健康志愿受试者的左手手腕内侧，连续使用3d，观察皮肤，均无发痒、发红、水泡、红肿、丘疹等刺激性反应。

3批样品的皮肤刺激性实验

取健康家兔9只，随机分成3组，每组3只实验前24h将动物脊柱两侧用电动剃须刀去毛,每侧面积为4cm×6cm。在每只家兔的一侧去毛区涂上含药脂质体混悬液或空白对照脂质体混悬液，另一侧作为无处理对照区。每天涂药1次，连续7d，观察皮肤的状况。实验结果表明，大蒜皂苷脂质体混悬液和空白脂质体混悬液对家兔无皮肤刺激性和过敏反应。

实施例8大蒜皂苷脂质体体外抗氧化性实验

1、实验材料

受试物：大蒜皂苷及大蒜皂苷脂质体（实施例1-5）

2、实验方法

2.1DPPH法测定大蒜提取物皂苷的抗氧化、清除自由基的原理

二苯代苦味酰基自由基（DPPH·）是一种很稳定的以氮为中心的自由基，若受试物能清除它，则表示受试物具有降低羟自由基、烷自由基或过氧自由基等自由基的有效浓度，打断脂质过氧化链反应的作用。DPPH·有个单电子，光谱扫描显示在516nm处有强吸收，其乙醇水溶液呈深紫色，加入受试物后，通过在516nm测定其清除DPPH自由基而引起吸光度减少的情况可以反映受试物的抗氧化活性，计算其清除自由基的能力。

2.2标准曲线的绘制

精密称取10mg DPPH·用无水乙醇溶解并定容于100ml容量瓶中，作为标准储备液，则该DPPH·标准储备液的质量浓度为100μg/ml。分别取1、2、4、6、8、10ml标准储备液在50mL棕色容量瓶中50ml刻度处定容，产生标准系列溶液，其质量浓度依次为：2、4、8、12、16、20μg/ml。在516nm处测定上述标准系列溶液的吸光度，绘制标准曲线。得到其线性回归方程为：Y=29.3500X+0.1882，相关系数r=0.9927，表明DPPH·浓度与其吸光度呈极显著正相关关系。

2.3自由基残留率的测定

取适量精制大蒜皂苷，以无水乙醇为溶剂，配制不同浓度的大蒜皂苷乙醇溶液（1μg/ml和8μg/ml），分别取0.5ml样液，加入4.5ml质量浓度为20μg/mlDPPH标准液，摇匀。516nm处动态测定混合物在不同时间的吸光度，根据标准曲线得到DPPH·残留量。以不同浓度样液测得的结果得到大蒜皂苷清除自由基能力与皂苷浓度的关系。

分别取0.5ml大蒜皂苷脂质体混悬液样品(实施例1-5，即大蒜皂苷磷脂复合物)，加入4.5ml质量浓度为20μg/ml DPPH标准液，摇匀。516nm处动态测定混合物在不同时间的吸光度，根据标准曲线得到DPPH·残留量。以不同处方样液测得的结果得到大蒜皂苷磷脂复合物清除自由基能力与处方的关系。2.4大蒜皂苷浓度与清除自由基效果的关系

分别将不同浓度的大蒜皂苷（1μg/ml和8μg/ml）/以及不同处方大蒜皂苷脂质体混悬液样品与DPPH·作用，516nm处测定混合物在不同时间的吸光度，根据2.1得到的标准曲线换算出不同时间时DPPH·的残留质量浓度，继而由下列公式计算出DPPH·的残留率。

DPPH·残留率=[DPPH·]_T/[DPPH·]_T=0×100%

式中：[DPPH·]_T为某一时刻DPPH·的质量浓度；[DPPH·]_T=0为DPPH·的起始质量浓度。

各样品的抗氧化性如下表1所示：

表1：

试验结果表明，大蒜皂苷和大蒜皂苷脂质体混悬液（磷脂复合物）都具有清除DPPH·自由基的能力，具有一定的抗氧化活性，而且，随抗氧化成分量的增加，清除自由基能力也增强。不同的是，清除DPPH·自由基的速度有差异。大蒜皂苷在含量相对比较高时清除速度也相对较快。

实施例9大蒜皂苷脂质体的降血脂药效实验

1、实验材料

实验样品：实施例1和实施例2的大蒜皂苷脂质体

实验动物：SD大鼠，8只，雌雄各半，体重300～400g，随机分组，每组2只。

2、实验方法

在实验环境下大鼠喂饲基础饲料观察一周，取尾血，测血清总胆固醇(TC)，观察指标的正常值。自正式实验开始各组动物用高脂饲料喂饲二周，取尾血，测定血脂以确定是否形成高脂血症。高脂血症模型建立后，再根据TC水平，进行随机分组，继续给予高脂饲料，同时给药大蒜皂苷脂质体，并定期称量体重，于实验开始的第四周，取尾血，测定血脂各项指标，每组取平均值，记录实验结果。

3、实验结果：如下表2所示。

表2：

注：给药剂量以混悬液中的固体脂质体的量计算。

实验结果显示，高脂血症模型大鼠在给药大蒜皂苷脂质体之后，生存状态良好，总胆固醇和甘油三酯的水平显著下降，甚至接近高脂血症模型建立之前的正常水平，表明大蒜皂苷具有降血脂的作用，并且本发明的大蒜皂苷脂质体的药效随给药剂量增大而增强，可以用于制备降血脂的药物。

除药品领域外，本发明的大蒜皂苷脂质体及其制剂还可以广泛应用于保健食品、化妆品等领域。

Claims (9)

1.一种大蒜皂苷脂质体，包括下列重量份的组分：大蒜皂苷1份、磷脂10～100份、胆固醇1～50份，乳化剂0～50份。 

2.如权利要求1所述的大蒜皂苷脂质体，包括下列重量份的组分：大蒜皂苷1份、磷脂10～30份、胆固醇2～10份，乳化剂0～30份。 

3.如权利要求1所述的大蒜皂苷脂质体，其中所述磷脂选自大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂、脑磷脂、磷脂酰乙醇胺、磷脂酸、磷脂酰胆碱、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、二鲸蜡磷酸酯、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、二月桂酰磷脂酰胆碱等的一种或多种。 

4.如权利要求1所述的大蒜皂苷脂质体，其中所述乳化剂选自吐温、泊洛沙姆等的一种或多种。 

5.制备权利要求1至4任一项所述的大蒜皂苷脂质体的方法，包括步骤： 

1）将磷脂和胆固醇溶于可挥发有机溶剂中，并在30～50℃下旋转蒸发形成薄膜； 

2）在pH6.0～7.5的磷酸盐缓冲液中依次加入乳化剂和大蒜皂苷得到溶液； 

3）将步骤2）所得的溶液加入步骤1）形成的薄膜中，混合搅拌得大蒜皂苷脂质体混悬液。 

6.如权利要求5所述的方法，进一步包括步骤： 

4）将步骤3）的脂质体混悬液冷冻干燥或喷雾干燥，得到固态的大蒜皂苷脂质体。 

7.如权利要求5所述的方法，其中步骤1）所述的可挥发有机溶剂选自甲醇、乙醇、乙醚、丙酮、氯仿等的一种或多种。 

8.如权利要求1至4任一项所述的大蒜皂苷脂质体，其中所述大蒜皂苷脂质体可以制成片剂、胶丸、口服液、注射剂、气雾剂或滴剂。 

9.权利要求1至4任一项所述的大蒜皂苷脂质体在制备抗菌、降胆固醇、降血脂、抗肿瘤、抗血小板聚集和提高纤溶活性、抗缺氧、抗氧化损伤的药物中的用途。