CN101762572B - 用于pH值传感的比率荧光纳米水凝胶及其制备方法 - Google Patents

Abstract

用于pH值传感的比率荧光纳米水凝胶及其制备方法，属于pH值传感材料领域。该方法包括：按质量百分比1∶0.05∶0.05∶0.005称取聚亚安酯，溴百里酚兰，香豆素6，尼罗红；将称取的聚亚安酯加入到9/1的体积比的乙醇/水混合溶液中，配制浓度成500ppm的溶液；将溴百里酚兰、香豆素6、尼罗红三种物质共溶于上述溶液中搅拌1h；然后在二次蒸馏水中透析24h，隔4h换一次水，得到水凝胶悬浊液；将制备的悬浊液进行过滤，得到产物。本发明克服了单一荧光强度的探测灵敏性会因为探针的分布、浓度以及光电子系统的随机漂移而受到削弱这一缺陷，适合于作为细胞内pH值探测材料。

Description

用于pH值传感的比率荧光纳米水凝胶及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种用于pH值传感的比率荧光纳米水凝胶及其制备方法，属于pH值传感材料技术领域。

背景技术

pH值检测在生物、医学等多种领域中都占有十分重要的地位。在用于pH值检测的多种材料中，水凝胶由于具有很高的稳定性、生物亲和性以及受激反应性(体积随外部刺激发生变化)而备受关注。目前多种纳米水凝胶已经被研制，并用于探测各种分析物。但是由于目前的纳米水凝胶的探测机制多是基于体积变化，因此必须集成或依附于微型装置上以适应光学或者电学方法测量，结果只能于宏观领域中进行探测。最近有研究报导了通过改变纳米水凝胶体积与荧光强度的关系而制备了荧光纳米水凝胶，并利用此种纳米水凝胶实现了细胞水平上的探测。众所周知，单一荧光强度的探测灵敏性会因为探针的分布、浓度以及光电子系统的随机漂移而受到削弱。基于荧光寿命的测量方法虽然可以避开上述缺点，但对于较短的衰减寿命(如纳米量级)，则对探测仪器的复杂性大大增加，这为实际应用带来了不便。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：克服单一荧光强度的探测灵敏性会因为探针的分布、浓度以及光电子系统的随机漂移而受到削弱这一缺陷，提供一种用于pH值传感的比率荧光纳米水凝胶及其制备方法。

本发明的技术方案：

本发明的第一个目的在于提供一种用于pH值传感的比率荧光纳米水凝胶：这是一种多掺杂型纳米水凝胶，非荧光型的pH值指示剂和几种荧光分子镶嵌于粒径为纳米级别的水凝胶颗粒当中。

为实现上述目的，本发明采取以下技术方案：

用于pH值传感的比率荧光纳米水凝胶含有溴百里酚兰作为pH值指示剂；香豆素6和尼罗红作为荧光分子构成共振能量传递体系；将以上三种成分均匀地分散在具有生物体相容性的聚亚安酯水凝胶基质当中。

一种优选技术方案，所述用于pH值传感的比率荧光纳米水凝胶各组分的质量百分比聚亚安酯∶溴百里酚兰∶香豆素6∶尼罗红为1∶0.05∶0.05∶0.005。

本发明的第二个目的在于提供一种用于pH值传感的比率荧光纳米水凝胶的制备方法。

为实现上述目的，本发明采取以下技术方案：

一种用于pH值传感的比率荧光纳米水凝胶的制备方法，步骤如下：

步骤一，按质量百分比1∶0.05∶0.05∶0.005称取聚亚安酯，溴百里酚兰，香豆素6，尼罗红；

步骤二，将步骤一称取的聚亚安酯，在磁力搅拌中，加入到9/1的体积比的乙醇/水混合溶液中，配制成聚亚安酯浓度为500ppm的溶液；

步骤三，将步骤一称取的溴百里酚兰、香豆素6、尼罗红三种物质共溶于步骤二制成溶液中，搅拌一个小时；

步骤四，将步骤三制备的混合溶液，在二次蒸馏水中进行透析24小时，其间每隔4小时换一次二次蒸馏水，得到水凝胶的悬浊液；

步骤五，将步骤四制备的悬浊液，通过一个孔径为0.2微米的过滤膜进行过滤，除掉较大的团聚物，得到最终的用于pH值传感的比率荧光纳米水凝胶。

本发明的有益效果：

在本发明提出了一种用于pH值传感的比率荧光纳米水凝胶，应用于生理范围的pH值传感。它可以通过单一波长激发同时产生两个信号，然后根据两个信号的比率来探测待分析物。这种内在校准机制使得传感信号更加稳定可靠，实际应用起来也更方便。该用于pH值传感的比率荧光纳米水凝胶由非响应性的聚合物作为基质，其pH敏感性来源于凝胶中所装载的有机分子。因此，该用于pH值传感的比率荧光纳米水凝胶具有恒定体积，从而在生物活体探测时不会因扰乱细胞活动而产生虚假信号。

附图说明

图1是用于pH值传感的比率荧光纳米水凝胶的横截面示意图以及主要成分的化学结构式。

图2是溴百里酚兰在不同pH值(pH值5、7和9)水溶液中的吸收光谱(灰色阴影所示)，以及香豆素6(C6)和尼罗红(NR)在乙醇溶液中各自的吸收(虚线)和发射(实线)光谱。

图3是用于pH值传感的比率荧光纳米水凝胶在干燥状态下的透射电镜照片。

图4是用于pH值传感的比率荧光纳米水凝胶在不同pH值下的荧光发射光谱，其中500nm和620nm的发射峰分别归属于荧光分子香豆素6和尼罗红。从酸性到碱性环境pH值分别为：4.92，5.29，5.91，6.24，6.47，6.64，6.81，6.98，7.38，7.73，8.04，8.34，8.67，9.18。

图5是用于pH值传感的比率荧光纳米水凝胶中尼罗红和香豆素6的发射强度比率(I_F(620)/I_F(500))与pH值的关系。

图6是新制备的用于pH值传感的比率荧光纳米水凝胶在水相中的粒径分布(室温下测量)。

图7是陈置一个月后的用于pH值传感的比率荧光纳米水凝胶在水相中的粒径分布(室温下测量)。

图8是新鲜的(实线)以及陈置一个月后的(虚线)用于pH值传感的比率荧光纳米水凝胶悬浊液的荧光光谱曲线(均以450nm光激发)。

图9是另一批用于pH值传感的比率荧光纳米水凝胶中尼罗红和香豆素6的发射强度比率(I_F(620)/I_F(500))与pH值的关系。

具体实施方式

下面通过附图和具体实施方式对本发明做进一步说明。

本发明中提出的用于pH值传感的比率荧光纳米水凝胶，是一种多掺杂型纳米水凝胶，其中各组分的质量百分比聚亚安酯∶溴百里酚兰∶香豆素6∶尼罗红为1∶0.05∶0.05∶0.005。

用于pH值传感的比率荧光纳米水凝胶的制备方法，步骤如下：

步骤一，按质量百分比1∶0.05∶0.05∶0.005分别称取10mg聚亚安酯、0.5mg溴百里酚兰、0.5mg香豆素6和0.05mg尼罗红；

步骤二，将22.23ml乙醇和2.47ml水混合后得到9/1体积比的乙醇/水混合溶液，将步骤一中称取的10mg聚亚安酯，在磁力搅拌中，加入上述乙醇/水混合溶液中，配制成聚亚安酯浓度为500ppm的溶液；

步骤三，将步骤一称取的0.5mg溴百里酚兰、0.5mg香豆素6和0.05mg尼罗红三种物质共溶于步骤二制成的溶液中，搅拌一个小时；

步骤四，将步骤三制备的混合溶液，在二次蒸馏水中进行透析24小时，其间每隔4小时换一次二次蒸馏水，得到水凝胶的悬浊液；

步骤五，将步骤四制备的悬浊液，通过一个孔径为0.2微米的过滤膜进行过滤，除掉较大的团聚物，得到最终的的用于pH值传感的比率荧光纳米水凝胶。

所用材料：聚亚安酯购自美国Cardiotech公司(威尔明顿，美国)，溴百里酚兰、香豆素6和尼罗红购自Sigma Aldrich公司。所有的药品、试剂都没有经过进一步的提纯。

所用设备：吸收光谱和荧光光谱分别在Lambda 14 p UV-vis分光光度计(美国Perkin Elmer公司)和Aminco AB 2型荧光分光光度计(美国Thermo公司)上测量。透射电镜和动态光散射分别在LEO912AB型电镜(德国Zeiss公司)和Zetasizer 3000(德国Malvern公司)仪器上进行。

用于pH值传感的比率荧光纳米水凝胶的流体动力学尺寸表征：

将新鲜的用于pH值传感的比率荧光纳米水凝胶悬浊液进行动态光散射和荧光光谱表征，然后将样本陈置一个月后再进行一次动态光散射和荧光光谱表征。两次表征得到样本的平均流体动力学直径分别为136nm和125nm，这表明几乎没有团聚情况的发生。(见图6，7)

用于pH值传感的比率荧光纳米水凝胶的荧光光谱：

从图8中可以观察到，随着新鲜样本的陈置，在620nm处的发射逐渐减弱，而500nm处的发射逐渐增强。假定这双重发射是由香豆素6和尼罗红之间的共振能量传递效应引起的，这种变化可以解释为染料渗漏。即使浸出量相同，供体的荧光可能会增强，其代价是受体发射强度的减弱。根据荧光强度的减弱，染料渗漏的量可粗略计算出低于8％

用于pH值传感的比率荧光纳米水凝胶pH值传感功能的重复性研究：

为了研究用于pH值传感的比率荧光纳米水凝胶pH值传感功能的重复性，以相同的方法再次制备了另一批用于pH值传感的比率荧光纳米水凝胶。图9为该批用于pH值传感的比率荧光纳米水凝胶的pH值校准曲线，实验数据由该批用于pH值传感的比率荧光纳米水凝胶在620nm与500nm处发光强度的比值计算而来。

本发明提出的用于pH值传感的比率荧光纳米水凝胶的截面示意图如图1所示：作为pH值探针分子的溴百里酚兰，作为荧光分子的香豆素6和尼罗红，均匀地分散在具有生物体相容性的聚亚安酯(一种非刺激响应型亲水性聚合物)水凝胶基质当中。

在制备过程中，聚亚安酯、溴百里酚兰、香豆素6以及尼罗红是以自由分子的状态存在于乙醇/水(体积比9/1)的混合溶液当中的。在步骤四的透析过程中，随着乙醇分子逐渐渗出透析膜，有机分子周围局域环境的极性逐渐增强。在疏水作用下，聚亚安酯聚合物的长链会发生交叉连接和坍塌而最终形成一种三维的稳定纳米结构，同时溴百里酚兰、香豆素6和尼罗红这些疏水性分子也被固定于水凝胶颗粒内部：聚亚安酯水凝胶，作为该用于pH值传感的比率荧光纳米水凝胶的基质；作为非荧光型pH值指示剂的溴百里酚兰，其依赖于pH值的显著吸收特性几乎覆盖了整个可见光的波长范围(图2)，因而被选定作为掺杂材料用来激活非响应型纳米水凝胶对pH值的敏感性；香豆素6和尼罗红的光谱是部分重叠的，因而被选取用来传输双重的荧光信号(图2)，而光谱部分重叠也确保了这两种荧光分子之间能够产生高效的共振能量传递效应。

所制备的用于pH值传感的比率荧光纳米水凝胶对pH值的感应能力源于以下两个特点。第一，pH探针分子溴百里酚兰的吸收光谱与荧光分子香豆素6和尼罗红的发射光谱均有交叠，如图2所示。从图中可以看出，溴百里酚兰的吸收光谱随pH值的变化而变化。在酸性条件下(pH＜7)，溴百里酚兰的吸收峰与香豆素6的发射峰有交叠；而在碱性环境下(pH＞7)，其吸收峰值又与尼罗红的发射峰交叠。第二，在荧光分子香豆素6与尼罗红之间可以发生有效的共振能量传递。由图2可以看到，香豆素6的发射峰与尼罗红的吸收峰存在着很好的交叠。在溶液中，二者由于处于自由状态，达不到临界距离(＜10nm)而不会发生共振能量传递。而在本发明提出的用于pH值传感的比率荧光纳米水凝胶中，大量的香豆素6和尼罗红分子被固定于直径为130-140nm的水凝胶颗粒当中，这足以保证大部分香豆素6和尼罗红可满足临界距离(＜10nm)的条件而发生共振能量传递。下面依据图2来具体阐述用于pH值传感的比率荧光纳米水凝胶的pH值感应机理。用于pH值传感的比率荧光纳米水凝胶的pH值敏感性由其中的溴百里酚兰分子赋予。在450nm光激发下，用于pH值传感的比率荧光纳米水凝胶中的荧光分子香豆素6发出绿色荧光(峰值在520nm)，其中的一部分能量通过共振能量传递传递给尼罗红分子发出620nm红光。在酸性条件下(pH＜6)，用于pH值传感的比率荧光纳米水凝胶中香豆素6未进行能量传递的绿色荧光大部分被溴百里酚兰吸收，而尼罗红的红色荧光得以保留，从而主要发出红色荧光。在碱性条件下(pH＞8)，用于pH值传感的比率荧光纳米水凝胶中尼罗红的大部分红色荧光被溴百里酚兰吸收，而香豆素6的绿色荧光得以保留，这时用于pH值传感的比率荧光纳米水凝胶主要发出绿色荧光。

用于pH值传感的比率荧光纳米水凝胶中有机分子的掺杂比例是考虑以下两方面因素，根据实验优化而得到的：(一)溴百里酚兰、香豆素6和尼罗红的掺杂量不宜过多而损害了聚合物长链的交叉连接和坍塌，以至于影响用于pH值传感的比率荧光纳米水凝胶的形成；(二)溴百里酚兰、香豆素6和尼罗红三者间的比例以产生适宜的发射强度比为最佳。

用于pH值传感的比率荧光纳米水凝胶pH值荧光响应性的理论推导：

溴百里酚兰的离解平衡式可以表示为：

由上面的平衡式可相应得到如下的表达式

$K_a=\frac{\left[H^{+}\right]\left[A^{-}\right]}{\left[\mathrm{HA}\right]}$

这里K_a为溴百里酚兰的解离常数，[HA]和[A^-]分别为达到平衡时酸性和碱性溴百里酚兰的浓度，[H⁺]是溶液中的H⁺浓度。假定用于pH值传感的比率荧光纳米水凝胶中荧光分子(香豆素6、尼罗红)的荧光强度服从Beer-Lambert定律。

I＝I₀10^-εlc

这里I₀为用于pH值传感的比率荧光纳米水凝胶中溴百里酚兰分子不存在时的荧光强度，l为用于pH值传感的比率荧光纳米水凝胶的颗粒半径，ε和c分别是酸性(或碱性)溴百里酚兰分子的摩尔吸收率和浓度。这样用于pH值传感的比率荧光纳米水凝胶的荧光强度比率尼罗红(620nm)/香豆素6(500nm)可以写为：

$\frac{I_{\mathrm{NR}}}{I_{C6}}=\frac{I_{0\mathrm{NR}}{10}^{{-\mathrm{\ϵ}}_{A^{-}}{\mathrm{lc}}_{A^{-}}}}{I_{0C6}{10}^{{-\mathrm{\ϵ}}_{\mathrm{HA}}{\mathrm{lc}}_{\mathrm{HA}}}}=\frac{I_{0\mathrm{NR}}}{I_{0C6}}{10}^{l(c_{\mathrm{HA}}+c_{A^{-}})(\frac{{\mathrm{\ϵ}}_{\mathrm{HA}}}{1+c_{A^{-}}/c_{\mathrm{HA}}}-\frac{{\mathrm{\ϵ}}_{A^{-}}}{1+c_{\mathrm{HA}}/c_{A^{-}}})}$

通过设定

k₁＝I_0NR/I_0C6， $l_2={\mathrm{l\ϵ}}_{\mathrm{HA}}(c_{\mathrm{HA}}+c_{A^{-}}),$ $k_3={\mathrm{l\ϵ}}_{A^{-}}(c_{\mathrm{HA}}+c_{A^{-}})$

$c_{A^{-}}/c_{\mathrm{HA}}=K_a/{10}^{-\mathrm{pH}},$ $c_{\mathrm{HA}}/c_{A^{-}}={10}^{-\mathrm{pH}}/K_a$

上述表达式可以简化如下式

$\frac{I_{\mathrm{NR}}}{I_{C6}}=k_1{10}^{\frac{k_2}{1+K_a/{10}^{-\mathrm{pH}}}-\frac{k_3}{1+{10}^{-\mathrm{pH}}/K_a})}$

利用透射电镜对干燥状态下的用于pH值传感的比率荧光纳米水凝胶进行了表征，发现其具有较规则的球状形貌，直径为20-30nm，粒度分布均匀(图3)。由于水凝胶具有高度亲水性，用于pH值传感的比率荧光纳米水凝胶在水溶液中的流体动力学尺寸要大于其干燥状态下的粒径。根据动态光散射法分析，水溶液中的用于pH值传感的比率荧光纳米水凝胶直径为130-140nm(图6)。该用于pH值传感的比率荧光纳米水凝胶在水相中相当稳定，样本在静置一个月后其尺寸基本不发生改变(图7)。

图4是用于pH值传感的比率荧光纳米水凝胶在不同pH值下的荧光发射光谱，其中500nm和620nm的发射峰可分别归属到荧光分子香豆素6和尼罗红。从图中可清晰看出，用于pH值传感的比率荧光纳米水凝胶的双重发射强度随pH值的变化呈现出不同的趋势。随着pH值的增加，香豆素6的荧光强度逐渐增强，而尼罗红的荧光却逐渐减弱。用于pH值传感的比率荧光纳米水凝胶所展现出的这种pH值依赖特性与设计思想完全一致。这种用于pH值传感的比率荧光纳米水凝胶，可以通过测量其不同pH值的双重发射强度，建立荧光强度比率与pH值的关系。图5是用于pH值传感的比率荧光纳米水凝胶中尼罗红和香豆素6的发射强度比率(I_F(620)/I_F(500))与pH值的关系。在pH值5到9范围内，用于pH值传感的比率荧光纳米水凝胶的荧光比率变化了接近9倍(由3.5减小到0.4)。考虑到荧光分子尼罗红和香豆素6的发射与溴百里酚兰吸收光谱的重叠，可以假设I_F(620)and I_F(500)分别依赖于酸性溴百里酚兰和碱性溴百里酚兰的浓度，从而得到用于pH值传感的比率荧光纳米水凝胶的荧光比率与pH值的理论表达式：

$k_1{10}^{(\frac{k_2}{1+k_a/{10}^{-\mathrm{pH}}}-\frac{k_3}{1+{10}^{-\mathrm{pH}}/K_a})---\left(1\right)}$

通过与实验数据的拟合，得到用于pH值传感的比率荧光纳米水凝胶中溴百里酚兰的pK_a为7.64。显然，所制备的用于pH值传感的比率荧光纳米水凝胶非常适宜探测人体生理范围的pH值。另外，由于用于pH值传感的比率荧光纳米水凝胶尺寸小并具备高度的亲水性，其pH值响应时间为数秒钟。

综上所述，本发明提出了一种用于pH值传感的比率荧光纳米水凝胶。随着溴百里酚兰(作为pH值指示剂)以及香豆素6和尼罗红(由共振能量传递效应所关联的两种荧光分子)的引入，最初非响应和非荧光型的聚亚安酯水凝胶被赋予了依赖于pH值的比率型荧光——该方法也可以应用于构造其他的用于pH值传感的比率荧光纳米水凝胶以取代以往的染料。由于灵敏度高、亲水性好、稳定性好、响应定量以及pH值检测范围涵盖了生理pH值范围(pH值6-8)等优点，该用于pH值传感的比率荧光纳米水凝胶作为细胞内pH值探测材料是很有前景的。

Claims (2)

1.一种用于pH值传感的比率荧光纳米水凝胶，其特征在于，这是一种多掺杂型纳米水凝胶，其中含有：溴百里酚兰，作为pH值指示剂；香豆素6和尼罗红，作为荧光分子构成共振能量传递体系；以上三种成分随机地分散在作为基质的聚亚安酯水凝胶当中；

该比率荧光纳米水凝胶各组分的质量百分比为聚亚安酯∶溴百里酚兰∶香豆素6∶尼罗红为1∶0.05∶0.05∶0.005。

2.权利要求1所述的用于pH值传感的比率荧光纳米水凝胶的制备方法，包括如下步骤：

步骤一，按权利要求1组分的质量百分比1∶0.05∶0.05∶0.005称取聚亚安酯，溴百里酚兰，香豆素6，尼罗红；

步骤二，将步骤一称取的聚亚安酯，在磁力搅拌中，加入到9/1的体积比的乙醇/水混合溶液中，配制成聚亚安酯浓度为500ppm的溶液；

步骤三，将步骤一称取的溴百里酚兰、香豆素6、尼罗红三种物质共溶于步骤二制成的溶液中，搅拌一个小时；

步骤四，将步骤三制备的混合溶液，在二次蒸馏水中进行透析24小时，其间每隔4小时换一次二次蒸馏水，得到水凝胶的悬浊液；

步骤五，将步骤四制备的悬浊液，通过一个孔径为0.2微米的过滤膜进行过滤，除掉较大的团聚物，得到最终的用于pH值传感的比率荧光纳米水凝胶。

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