CN101089614A - 一种功能型表面增强拉曼散射探针的制备方法 - Google Patents

Abstract

一种功能型表面增强拉曼散射探针的制备方法涉及激光拉曼光谱检测领域，具体涉及一种功能型表面增强拉曼散射探针的制备方法及其应用于细胞内pH传感和细胞内多组分探测。该制备方法是将10^－5M敏感材料与银胶或金胶溶液按体积比3∶1000～300∶1000混和均匀，再以体积比3∶1～10∶1加入0.1M的氯化钠溶液，得到功能型表面增强拉曼散射探针；该探针尺寸在20～50nm范围，是水溶性的。所述的敏感材料以氨基(－NH₂)作为pH敏感基团并含有易于与金属表面结合的基团。本发明的功能型SERS探针具有超高的灵敏度，适用的激发波长范围广，提高了测量的可靠性。实现对细胞的多方位实时、在线探测。

Description

一种功能型表面增强拉曼散射探针的制备方法

技术领域

本发明涉及激光拉曼光谱检测领域，具体涉及一种功能型表面增强拉曼散射探针的制备方法及其应用于细胞内pH传感和细胞内多组分探测。

背景技术

由于光学探针在细胞成像、细胞内信息的实时获取等方面的重要作用，近年来人们对光学探针的制备及其在单细胞水平的应用倍加重视，发展了各种类型、各种结构的探针用以研究细胞形态或探测细胞内组分等。通常采用的光学探针有荧光探针和拉曼探针两类。荧光探针由于具有检测速度快，简便易行等优点而得到广泛应用，但它存在荧光强度小、激发光谱窄、易于被光漂白等缺点。拉曼探针利用拉曼光谱进行探测，具有清晰的光谱学特征，可以提供分子结构方面的丰富信息，但是普通拉曼散射信号强度很低，而且容易被背景荧光淹没，因此检测难度较大。

应用表面增强拉曼散射(Surface enhanced Raman scattering，SERS)技术可以极大地增强分子拉曼信号强度，有效消除(猝灭)荧光背景的干扰，从而使拉曼探针检测的灵敏度得到惊人的提高(10⁵～10⁶倍)。

发明内容

技术问题：本发明的目的是提供一种功能型表面增强拉曼散射探针的制备和应用方法，即是一种功能型SERS探针的制备方法及其在细胞内pH值检测、细胞成像和细胞内多组分探测中的应用方法。

技术方案：为了实现上述目的，本发明的制备工艺流程为：将10^-5M敏感材料与银胶(或金胶)溶液按体积比3∶1000～300∶1000混和均匀，再以体积比3∶1～10∶1加入0.1M的氯化钠溶液，得到功能型SERS探针。

所述的银胶(或金胶)溶液的制备方法，其特征在于采用Lee和Meisel在文章J.Phys.Chem.B 86，3391-3395中所述的方法制备。

所述的敏感材料，其特征在于以氨基(-NH₂)作为pH敏感基团。由于在不同pH溶液中该基团的去质子化或质子化程度不同，从而导致该敏感材料的拉曼信号强度随pH呈规律性变化。

所述的敏感材料，其特征在于含有易于与金属表面结合的基团，比如-HS等。

所述的功能型SERS探针，其特征在于：尺寸在20～50nm范围，是水溶性的，在水溶液中分散性好，易于被细胞吞噬而无创伤地进入细胞。

所述的功能型SERS探针，其特征在于：含有pH敏感基团，它的SERS光谱中相应频移处的信号强度随pH呈规律性变化。

所述的功能型SERS探针，其特征在于：SERS信号的信噪比高，稳定性好。

所述的功能型SERS探针应用于细胞内pH值检测的具体步骤为：将体外培养的细胞与SERS探针共同孵育，SERS探针通过被细胞吞噬而无损伤地进入细胞内部。SERS探针中的pH敏感基团与细胞内的H⁺相互作用后，它在SERS光谱中相应频移处的信号强度发生改变，而探针中其它基团对应的频移处信号强度则保持不变。计算pH敏感基团的信号强度与其它基团的信号强度的比值，通过该比值的变化可以实时反映出细胞内pH的变化。

所述的功能型SERS探针应用于细胞内多组分探测的具体步骤为：将体外培养的细胞与SERS探针共同孵育，SERS探针通过被细胞吞噬而无损伤地进入细胞内部。由于细胞内某些DNA、蛋白质等分子接近探针中的银(或金)纳米粒子表面，因此除了SERS探针的原有信号外，还可以探测到这些DNA或蛋白质分子的SERS信号。通过分析它们的SERS信号，可以实时获得细胞内DNA或蛋白质等多组分的构象和空间分布等信息。

有益效果：本发明的优点如下：

其一是本发明的功能型SERS探针具有超高的灵敏度，只需要极少量的探针即可实现实时探测，降低了荧光探针对细胞的毒性并且避免了荧光探针的光漂白等缺点。此外，该探针的尺寸在20～50nm，可以通过被细胞吞噬而进入细胞内部，对细胞没有机械性损伤。

其二是本发明的功能型SERS探针适用的激发波长范围广，包括可见光和红外光区域，避免了荧光探针中激发光谱窄的缺点。

其三是本发明的功能型SERS探针用于细胞内pH值传感，通过探针中pH敏感基团的信号强度与其它基团的信号强度的比值反映pH的变化，避免了激发源的波动等因素造成的测量误差。提高了测量的可靠性。

其四是本发明的功能型SERS探针除了可以用于细胞内pH传感，还可以同时获得细胞内DNA、蛋白质等多组分的构象和空间变化等信息。实现对细胞的多方位实时、在线探测。

本发明的功能型SERS探针可以实现细胞内的pH值、细胞多组分构象和空间分布等特征的实时追踪传感，高分辨地获取生物细胞结构与内部功能信息，为在单分子及单细胞水平上实时监测生物活动提供了一种灵敏和便捷的方法，为生命机理的解释和疾病病变的预测提供了一种研究手段。

附图说明

现结合附图对本发明做出说明。附图中以采用银胶和2-氨基苯酚硫制备的功能型SERE探针为例，其中2-氨基苯酚硫为pH敏感材料。

图1是本发明的功能型SERS探针在pH缓冲液中的SERS光谱。

图1-1中A代表在pH8.0的缓冲液中SERS探针的SERS光谱。

B代表在pH3.0的缓冲液中SERS探针的SERS光谱。

图1-2为功能型SERS探针分别在pH3.0，pH4.0，pH5.0，pH6.0，pH7.0，pH8.0缓冲液中的归一化SERS光谱。

图1-3为功能型SERS探针的pH响应曲线。pH范围是3.0~8.0。

图2是本发明的功能型SERS探针用于胰腺癌细胞内pH传感。

图2-1为进入胰腺癌细胞内的功能型探针的SERS光谱，

其中，A为胰腺癌细胞置于pH5.0缓冲液十分钟后的SERS光谱；B为胰腺癌细胞置于pH3.0缓冲液十分钟后的SERS光谱。

图2-2为进入胰腺癌细胞内的功能型探针的pH响应曲线。pH范围是3.0～8.0。

图3是本发明的功能型SERS探针用于胰腺癌细胞内多组分探测。

左上的插图是所探测的细胞的白光像。细胞中的黑点是进入细胞中的SERS探针。

具体实施方式

附图中以采用银胶和2-氨基苯酚硫制备的功能型SERE探针为例，其中2-氨基苯酚硫为pH敏感材料。

图1-1中A代表在pH8.0的缓冲液中SERS探针的SERS光谱。

B代表在pH3.0的缓冲液中SERS探针的SERS光谱。

1505cm^-1处的拉曼峰为-NH₂基团的振动峰，具有良好的pH响应，随着缓冲液的pH降低，上述拉曼频移处的信号强度下降。而1390cm^-1处的拉曼峰则是苯环振动峰，对pH不敏感，基本保持不变。因此，利用1505cm^-1处的信号强度与1390cm^-1处的信号强度的比值，即I₁₅₀₅/I₁₃₉₀，来反映pH的变化。

图1-2为功能型SERS探针分别在pH3.0，pH4.0，pH5.0，pH6.0，pH7.0，pH8.0缓冲液中的归一化SERS光谱。所有SERS光谱均以1390cm^-1处的信号强度进行归一化。1505cm^-1处的信号强度随着pH的降低明显下降。

图2-1为进入胰腺癌细胞内的功能型探针的SERS光谱，

其中，A为胰腺癌细胞置于pH5.0缓冲液十分钟后的SERS光谱；B为胰腺癌细胞置于pH3.0缓冲液十分钟后的SERS光谱。1505cm^-1处的信号强度随着pH的降低明显下降，证明探针进入细胞后保持了其pH敏感性。

以下举例说明本发明的具体实施方式，但本发明的内容并不限于所举的例子。

该制备方法是将10^-5M敏感材料与银胶或金胶溶液按体积比5∶1000或50∶1000或200∶1000混和均匀，再以体积比10∶1或5∶1或3∶1加入0.1M的氯化钠溶液，得到功能型表面增强拉曼散射探针；该探针尺寸在20～50nm范围，是水溶性的。所述的敏感材料以氨基(-NH₂)作为pH敏感基团并含有易于与金属表面结合的基团。

本发明的功能型表面增强拉曼散射探针用于活细胞内pH值的检测：将体外培养的细胞与SERS探针共同孵育，SERS探针通过被细胞吞噬而无损伤地进入细胞内部。细胞内的H⁺与SERS探针中的pH敏感基团发生相互作用，pH敏感基团的SERS信号强度与探针中其它基团的SERS信号强度的比值发生变化。通过计算pH敏感基团的信号强度与其它基团信号强度的比值变化实时直观反映出细胞内pH的变化，实现细胞内pH值的动态变化。

本发明的功能型表面增强拉曼散射探针用于活细胞内多组分探测：将体外培养的细胞与SERS探针共同孵育，SERS探针通过被细胞吞噬而无损伤地进入细胞内部。探测位于细胞内部的探针的SERS光谱并进行拉曼光谱指认，提取出归属于DNA或蛋白质分子的SERS信号。通过它们的SERS信号的频移变化或强度变化来实时反映细胞内DNA或蛋白质等多组分的结构变化信息。

实施例一，制备功能型SERS探针

第一步，首先按Lee和Meisel所述方法制备银胶溶液：在冰浴条件下，将50mL浓度为5×10^-3M的硝酸银溶液加入150mL浓度为2×10^-3M的硼酸钠溶液中并混合均匀，室温下搅拌1小时。得到黄绿色透明溶液，即银胶溶液，待用。

第二步，将浓度为10^-5M的2-氨基苯酚硫的甲醇溶液与第一步制备的银胶溶液按体积比3∶1000混和均匀，反应20分钟。2-氨基苯酚硫分子容易通过-HS键插在银胶中的银纳米粒子表面。标记了2-氨基苯酚硫分子的银纳米粒子通过离心从溶液中分离。离心机转速为10000rpm，离心时间为10分钟。再以体积比6∶1加入0.1M的氯化钠溶液，混合均匀，得到功能型SERS探针。该探针中的-NH₂基团对pH敏感，其对应的SERS信号强度随着pH的降低而明显下降，其它基团则对pH不敏感，对应的信号强度基本不变。如图1-1所示。

实施例二，功能型SERS探针用于胰腺癌细胞内pH传感

第一步，测量SERS探针对pH的响应曲线。将功能型SERS探针溶液分别加入到pH3.0～pH8.0的缓冲溶液中，pH值间隔为1.0。10分钟后，将混和溶液滴到硅片上并固定在拉曼共焦显微镜的载物台上，测量其SERS光谱。对应于每个pH值均重复测量10次，计算每个SERS光谱中1505cm^-1处与1390cm^-1处的信号强度比值，即I₁₅₀₅/I₁₃₉₀，取10次实验结果的平均值。以pH为横坐标，I₁₅₀₅/I₁₃₉₀为纵坐标绘制SERS探针对pH的响应曲线，如图1-3。探针具有较高的酸性检测极限，线性响应范围为3.0～6.0。

第二步，将胰腺癌细胞置于培养基中进行体外培养(37℃，5％CO₂)。24小时后，将SERS探针溶液按体积比(3∶1)加入培养基中，轻轻摇匀，并且重新置于培养箱内。此时，SERS探针通过被细胞吞噬而进入细胞内部。一小时后，弃培养基，用磷酸盐缓冲液(PBS，7.4)轻轻洗细胞3次，去掉未被细胞吞噬而残留在培养基中的SERS探针。待用。

第三步，实时检测细胞内pH变化。将第二步处理的细胞置于6个不同pH缓冲液中，pH范围是3.0～8.0。10分钟后，将pH3.0缓冲液中的细胞置于共焦拉曼光谱仪的载物台上，选定一个细胞区域。测量细胞内的探针的SERS光谱。接着，按上述同样的步骤，依次测量置于pH4.0～8.0缓冲液中的细胞的SERS光谱。最后，根据SERS光谱，计算对应于每个pH值的I₁₅₀₅/I₁₃₉₀值，绘制细胞内的SERS探针的pH响应曲线，如图2-2。通过I₁₅₀₅/I₁₃₉₀值的改变可以实时反映细胞内的pH变化，为癌症治疗提供了一种新的监测途径。

实施例三，功能型SERS探针用于胰腺癌细胞内多组分探测

第一步，将胰腺癌细胞置于培养基中进行体外培养(37℃，5％CO₂)。24小时后，将SERS探针溶液按体积比(3∶1)加入培养基中，轻轻摇匀，并且重新置于培养箱内。此时，SERS探针通过被细胞吞噬而进入细胞内部。一小时后，弃培养基，用磷酸盐缓冲液(PBS，7.4)轻轻洗细胞3次，去掉未被细胞吞噬而残留在培养基中的SERS探针。待用。

第二步，将第一步处理的细胞置于磷酸盐缓冲液(PBS，7.4)中，并固定在共焦拉曼显微镜的载物台上。选取一个单细胞区域，探测细胞内的SERS光谱，如图3。除了探针的原有信号外，还探测到1241cm^-1，1300cm^-1以及1575cm^-1处的SERS信号，它们是细胞内各种氨基酸和核酸分子的信号。通过进一步分析这些信号的频移和强度，可以获得胞内蛋白质的构象信息。因此，本发明的功能型SERS探针还可以进行细胞内多组分的探测。

Claims (2)

1.一种功能型表面增强拉曼散射探针的制备方法，其特征在于该制备方法是将10^-5M敏感材料与银胶或金胶溶液按体积比3∶1000～300∶1000混和均匀，再以体积比3∶1～10∶1加入0.1M的氯化钠溶液，得到功能型表面增强拉曼散射探针；该探针尺寸在20～50nm范围，是水溶性的。

2.如权利要求1所述的一种功能型表面增强拉曼散射探针的制备方法，其特征在于所述的敏感材料以氨基(-NH₂)作为pH敏感基团并含有易于与金属表面结合的基团。

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