CN111500682A - 基于表面增强拉曼散射光谱技术的dna杂化检测方法 - Google Patents

基于表面增强拉曼散射光谱技术的dna杂化检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于表面增强拉曼散射光谱技术的DNA杂化检测方法，包括如下步骤：(1)制备30纳米直径的银纳米颗粒悬浊液；(2)将巯基化的DNA探针加入到步骤(1)中制备的悬浊液中；(3)将待测DNA样品加入到步骤(2)中铆定了DNA探针的银纳米颗粒悬浊液中；(4)向步骤(3)中得到的悬浊液中加入硫酸镁溶液，呈负电的银纳米颗粒及DNA探针将在二价镁离子的桥接作用下团簇，形成三明治团簇结构，最后，将装有三明治团簇结构的离心管固定到玻璃管支撑上，进行拉曼光谱测量。本发明既保证DNA测量过程中对DNA试验品的无损检测，又实现DNA杂化信号的可靠区分，测量精度高，速度快，成本低。

Description

基于表面增强拉曼散射光谱技术的DNA杂化检测方法
技术领域
本发明属于DNA检测的光学装置技术领域，尤其涉及一种基于表面增强拉曼散射光谱技术的DNA杂化检测方法。
背景技术
DNA和蛋白质的检测对于遗传病的诊断和治疗，以及传染源检测、药物发现等至关重要，而这类生物检测通常依赖于DNA杂交或抗原抗体的相互作用，超灵敏检测技术实现DNA杂交或抗原抗体相互作用的直接有效检测有很重要的意义。电化学传感器由于其自身超高的灵敏度，固有的简单性和小型化，低成本和低功耗受到学者的广泛关注和研究。电化学传感器检测手段的主要原理是首先将一个与待测DNA碱基互补配对的DNA识别探针铆定到信号传感器上，当待测DNA与DNA识别探针碱基互补配对以后，信号传感器产生配对信号，实现DNA碱基互补配对事件的检测。将铆定有DNA识别探针的识别表面暴露在含有待检测DNA单链的样本中，是实现高效率，高准确度探测DNA碱基互补配对事件的前提。通过表面修饰巯基己醇，探针DNA上碱基吸附可以很好的被排斥，使得探针DNA可以很好的暴露出来。早期的DNA杂化检测传感器使用氧化还原指示符区分电极上的单链和双链DNA，Mikkelsen等人利用等人利用Co(phen)33+作为氧化还原指示符，其中Co(phen)33+与双链DNA有很好的亲和性，当碱基发生碱基互补配对形成双链时，产生电化学响应。Ozsoz等人利用亚甲蓝作为氧化还原指示符因为亚甲蓝对暴露的鸟嘌呤碱基有很好亲和力。DNA杂化传感的另一种方法是利用双链DNA自身在长距离内充当电子传递的管道的能力，且电子传递速率随距离的减小很小而单链DNA的电子传输效率很低。采用电化学传感检测DNA杂化已经得到很多的研究和发展，但是由于电化学反应本身的复杂性和低可控性，特别是电极材料及氧化还原指示剂的选择使得电化学传感技术的进一步发展受到阻碍。
发明内容
为解决上述问题，本发明公开了一种基于表面增强拉曼散射光谱技术的DNA杂化检测方法，该方法一方面利用非接触式光学检测技术提高检测可靠性，另一方面利用近场光学增强效果显著提高单位点光谱的强度和灵敏度，实现DNA杂化光谱信号的直接检测。
为达到上述目的，本发明的技术方案如下：
一种基于表面增强拉曼散射光谱技术的DNA杂化检测方法，该方法包括如下步骤：
(1)制备30纳米直径的银纳米颗粒悬浊液；
(2)按体积比1:100将10-4摩尔每升巯基化的DNA探针加入到步骤(1)中制备的银纳米颗粒悬浊液中，然后将其进行离心水洗后重新分散于超纯水中使其成为铆定了DNA探针的银纳米颗粒悬浊液；
(3)将待测DNA样品加入到步骤(2)中铆定了DNA探针的银纳米颗粒悬浊液中，加入的体积等于10-4摩尔每升巯基化的DNA探针的体积，充分混合，混合后的悬浊液水浴缓慢加热到95摄氏度，并保温10分钟，然后逐渐冷却到室温；
(4)向步骤(3)中得到的悬浊液中加入1毫摩尔每升的硫酸镁溶液，加入的体积等于10-4摩尔每升巯基化的DNA探针的体积，呈负电的银纳米颗粒及DNA探针将在二价镁离子的桥接作用下团簇，形成三明治团簇结构，最后，将装有三明治团簇结构的离心管固定到玻璃管支撑上，进行拉曼光谱测量。
所述的基于表面增强拉曼散射光谱技术的DNA杂化检测方法，所述30纳米银纳米颗粒采用化学方法合成，具体包括以下步骤：首先，将溶剂水与丙三醇按照质量比为6:5的比例混合搅拌均匀，加热到95摄氏度时加入质量为溶剂水质量0.003％的硝酸银保温一分钟，然后加入质量为硝酸银质量的0.33％的柠檬酸钠，通过冷凝回流装置防止溶剂水蒸发，持续保温在95℃，搅拌一小时，冷却到室温，便得到30纳米直径的银纳米颗粒悬浊液。
所述的基于表面增强拉曼散射光谱技术的DNA杂化检测方法，采用化学方法合成的30纳米银纳米颗粒采用柠檬酸钠还原，具体方法是：将制备好的30纳米银纳米颗粒悬浊液经12000转每秒高速离心水洗后分散于溶剂水中，柠檬酸根吸附在银纳米颗粒上，无法被离心水洗清除，再分散后的30纳米银纳米颗粒表面功能团为带负电的柠檬酸根。
所述的基于表面增强拉曼散射光谱技术的DNA杂化检测方法，步骤(2)中所述铆定了DNA探针的银纳米颗粒悬浊液；具体方法是：按体积比1:100将10-4摩尔每升巯基化的DNA探针加入到步骤(1)中制备的银纳米颗粒悬浊液中，静置反应30分钟后用超纯水离心洗涤三次，去除悬浊液中残留的未吸附的巯基化探针DNA，获得表面铆定巯基化探针DNA的30纳米银纳米颗粒悬浊液。
所述的基于表面增强拉曼散射光谱技术的DNA杂化检测方法，步骤(3)中得到的悬浊液还包括，用超纯水离心洗涤三次，去除悬浊液中残留的未杂化的待测DNA样品得到杂化后的DNA样品的步骤。
所述的基于表面增强拉曼散射光谱技术的DNA杂化检测方法，步骤(4)中所述拉曼光谱测量的具体方法是：通过聚焦镜实现激光入射，使入射激光光束照射到DNA与纳米颗粒自组装样品上，激光激发团簇后30纳米银纳米颗粒产生局域表面等离子体发生共振耦合，使得团簇后30纳米银纳米颗粒间形成的纳米间隙内的局域电磁场增强到108-1012数量级，通过采集激光入射点的表面增强拉曼光谱，并与未发生DNA杂化的光谱作对比获取测量位点处拉曼光谱的产生来源，从而确定该测量位点处的是否发生DNA杂化。
有益效果：
1.本发明采用非接触式光学测量技术，耦合近场光学增强技术与拉曼光谱技术实现超灵敏DNA分子化学结构信息的测量，即表面增强拉曼测量技术；既保证DNA测量过程中对DNA试验品的无损检测，又实现DNA杂化信号的可靠区分，测量精度高，速度快，成本低。
2.表面修饰有探针DNA的纳米颗粒悬浊液的制备是实现DNA杂化检测的关键技术之一。由于巯基与银之间可以形成很强的化学键，这样便获得表面修饰有探针DNA的纳米颗粒悬浊液。由于银纳米颗粒带负电，排斥带负电的碱基，保证DNA可以很好的暴露在溶液中，方便进行碱基互补配对。
3.DNA与纳米颗粒自组装是实现DNA杂化检测的另一个关键技术。所述DNA与纳米颗粒自组装样品通过团簇剂二价镁离子诱导。由于DNA本身呈电负性，纳米颗粒也呈电负性，带正电二价镁离子起到桥接作用，促进DNA与纳米颗粒团簇形成三明治结构。团簇后纳米颗粒的之间的间隙在1-3纳米，当激光入射时，会产生局域表面等离子体共振，使得纳米间隙内局域电磁场得到显著增强到108-1012数量级，而处在此纳米间隙内的DNA分子的拉曼光谱信号作为一种电磁波，强度会得到极大的增强，使得DNA分子的拉曼光谱信号获取成为可能。
4.杂化后双链DNA与未杂化单链DNA信号可靠识别与区分是实现DNA杂化检测的最关键技术之一。拉曼光谱作为一种分子指纹光谱随着分子结构变化而变化，巯基化DNA与未巯基化DNA拉曼信号显著不同，巯基化DNA信号中腺嘌呤的信号显著强于DNA中另外三种碱基的信号，且巯基化对其他碱基的相对信号强度影响很小，基于此，可以通过表面增强拉曼光谱确认巯基化DNA是否铆定到银纳米颗粒表面，另外，DNA中主要包含四种碱基：腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶，不同碱基可以通过不同的拉曼特征峰进行特异性识别，同时，不同碱基拉曼特征峰的相对峰强可以定量分析DNA链中相应碱基的含量，由于发生碱基互补配对前后的单链DNA与双链DNA中碱基相对含量会发生变化，通过比对发生碱基互补配对前后的表面增强拉曼光谱中相应碱基的特征峰相对强度变化实现碱基互补配对的可靠检测与识别。
附图说明
图1是本发明的基于表面增强拉曼散射的DNA杂化检测方法总体图；
图2是本发明所述的样品制备过程示意图；
图3是本发明所述的表面修饰有探针DNA的纳米颗粒进行DNA杂化的示意图；
图4是本发明所述的DNA与纳米颗粒自组装的示意图；
图5是DNA中四种碱基的拉曼光谱图示；
图6是巯基化与未巯基化的同一条DNA拉曼光谱比对图示；
图7是碱基互补配对前后DNA样品拉曼光谱比对图示；
附图标记列表：
1.拉曼光谱测量模块，2.样品池模块，3.DNA与纳米颗粒自组装样品，4.计算机控制的信号采集、处理及显示模块，5.激光，6.分束镜，7.聚焦镜，8.光谱仪，9.CCD相机，10.平底玻璃管，11.玻璃管支撑，12.30纳米银纳米颗粒，13.巯基化探针DNA，14.待测DNA样品，15.二价镁离子，16.表面铆定巯基化探针DNA的30纳米银纳米颗粒，17.杂化后的DNA样品，18.三明治团簇结构。
具体实施方式
如图所示，本实施例所述的基于表面增强拉曼散射光谱技术实现DNA杂化检测的实验方法，主要由四部分构成：拉曼光谱测量模块1、样品池模块2、DNA与纳米颗粒自组装样品3和计算机控制的信号采集、处理及显示模块4；四个模块共同耦合工作，实现DNA样品的测量。
本实施例中所述拉曼光谱测量模块1包含：激光器5，分束镜6，聚焦镜7及光谱仪8，CCD相机9，激光器5出射激光经分束镜6透射，再经聚焦镜7聚焦后入射到DNA与纳米颗粒自组装样品3上，反射回来的散射信号经聚焦镜7聚焦准直后经分束镜6反射进入到光谱仪8，光谱仪滤波后的信号经CCD相机9收集；
本实施例中所述样品池模块2包含平底玻璃管10，玻璃管支撑11，所述平底玻璃管10尺寸为φ50mm×80mm，可更换,所述玻璃管支撑11采用环氧树脂加工，用于支撑平底玻璃管(10)；
所述DNA与纳米颗粒自组装样品模块3包含平底玻璃管10,30纳米银纳米颗粒12，巯基化探针DNA 13，待测DNA样品14，团簇剂二价镁离子15；
首先是样品制备，如图2所示，30纳米银纳米颗粒12采用化学方法合成，首先，将30克溶剂水与25克丙三醇混合搅拌均匀，在烧瓶中加热到95摄氏度时加入9毫克硝酸银保温一分钟，然后加入0.03毫克柠檬酸钠，烧瓶上装有冷凝回流装置，防止溶剂水蒸发，持续保温在95℃，搅拌一小时，冷却到室温，便得到30纳米直径的银纳米颗粒悬浊液12。由于采用的还原试剂为柠檬酸钠，合成的银纳米颗粒悬浊液中纳米颗粒的表面修饰有柠檬酸根，即纳米颗粒表面呈电负性。为了去除合成过程中残留的化学试剂，合成的银纳米颗粒悬浊液经三次离心水洗后重新分散于超纯水中。然后，将巯基化的DNA探针13加入到银纳米颗粒悬浊液中使其溶度为10-6摩尔每升，由于DNA探针上巯基与银纳米颗粒可以形成化学键，且键合作用强于柠檬酸根与银纳米颗粒，所以，DNA探针通过巯基铆定到银纳米颗粒表面，由于溶液体系下，银纳米颗粒表面及DNA探针均呈负电，所以，DNA探针中碱基可以很好的暴露在溶液中而不是吸附到银纳米颗粒表面。同样，为了去除悬浊液中未吸附的DNA探针，铆定了DNA探针的银纳米颗粒悬浊液进行三次离心水洗后重新分散于超纯水中。之后，将待测DNA样品14加入到分散后的悬浊液中，充分混合，为了确保能够发生充分碱基互补配对，混合后的悬浊液水浴缓慢加热到95摄氏度，并保温10分钟，然后逐渐冷却到室温。为了去除悬浊液中未发生碱基互补配对的待测DNA样品14，冷却后的悬浊液进行三次离心洗涤后重新分散于超纯水中。图3a所示为待测DNA样品14与探针DNA 13发生碱基互补配对，而图3b所示为待测DNA样品14不能与探针DNA 13发生碱基互补配对的情形。接下来，向悬浊液中加入1毫摩尔每升的硫酸镁15溶液，呈负电的银纳米颗粒12及探针DNA 13将在二价镁离子15的桥接作用下团簇，形成三明治团簇结构18，如图2及图3所示。图4a和图4b所示分别为待测DNA样品14能与探针DNA 13发生碱基互补配对和不能发生碱基互补配对的情形。最后，将装有三明治团簇结构18的平底玻璃管10固定到玻璃管支撑11上，进行拉曼光谱测量。
拉曼光谱测量模块1测量拉曼光谱的流程为：激光器5出射激光经分束镜6透射，再经聚焦镜7聚焦后入射到DNA与纳米颗粒自组装样品3上，反射回来的散射信号经聚焦镜7聚焦准直后经分束镜6反射进入到光谱仪8，光谱仪滤波后的信号经CCD相机9收集，收集的信号经计算机控制的信号采集、处理及显示模块处理分析得到拉曼光谱。
DNA主要由四种碱基：腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶组成。图5为DNA中四种碱基：腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶的拉曼光谱，图中的a、b、c、d分别为腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶，不同碱基之间的拉曼光谱有显著区别，本发明分别用位于723cm-1,647cm-1,788cm-1,1365cm-1波数的特征峰特异性识别DNA中的四种碱基，腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶。
图6中，a和b分别为未巯基化DNA与巯基化DNA表面增强拉曼光谱图示，图6c为a和b的差分光谱，可以明显发现巯基化之后的DNA相比于未巯基化DNA中属于腺嘌呤的位于723cm-1波数的拉曼峰得到显著增强，通过该测试结果可以验证是否完成DNA的巯基化。图7a和b为满足碱基互补配对的两条单链DNA的表面光增强拉曼光谱。图7c为a和b发生碱基互补配对后形成的双链DNA的表面增强拉曼光谱，由于DNA中不同碱基含量与相应特征峰的相对强度直接相关，碱基互补配对后的双链DNA中不同碱基含量与碱基互补配对前单链DNA含量不同，相对峰强也会发生变化，其中腺嘌呤信号尤为敏感，如图7所示，图7d为双链DNA与两条单链DNA的差分光谱。可以发现，发生碱基互补配对后的双链DNA的表面增强拉曼光谱中位于723cm-1的属于腺嘌呤特征峰变弱。从而实现利用碱基特征峰的相对峰强实现DNA杂化的可靠检测。
本发明还可以有其它实施方式，凡依据本发明的技术实质所采用的任何细微修改、等效变换、替代所形成的技术方案，均落在本发明专利要求保护的范围之内。

Claims (6)

1.一种基于表面增强拉曼散射光谱技术的DNA杂化检测方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：
(1)制备30纳米直径的银纳米颗粒悬浊液；
(2)按体积比1:100将10-4摩尔每升巯基化的DNA探针加入到步骤(1)中制备的银纳米颗粒悬浊液中，然后将其进行离心水洗后重新分散于超纯水中使其成为铆定了DNA探针的银纳米颗粒悬浊液；
(3)将待测DNA样品加入到步骤(2)中铆定了DNA探针的银纳米颗粒悬浊液中，加入的体积等于10-4摩尔每升巯基化的DNA探针的体积，充分混合，混合后的悬浊液水浴缓慢加热到95摄氏度，并保温10分钟，然后逐渐冷却到室温；
(4)向步骤(3)中得到的悬浊液中加入1毫摩尔每升的硫酸镁溶液，加入的体积等于10-4摩尔每升巯基化的DNA探针的体积，呈负电的银纳米颗粒及DNA探针将在二价镁离子的桥接作用下团簇，形成三明治团簇结构，最后，将装有三明治团簇结构的离心管固定到玻璃管支撑上，进行拉曼光谱测量。
2.根据权利要求1所述的基于表面增强拉曼散射光谱技术的DNA杂化检测方法，其特征在于：所述30纳米银纳米颗粒采用化学方法合成，具体包括以下步骤：首先，将溶剂水与丙三醇按照质量比为6:5的比例混合搅拌均匀，加热到95摄氏度时加入质量为溶剂水质量0.003％的硝酸银保温一分钟，然后加入质量为硝酸银质量的0.33％的柠檬酸钠，通过冷凝回流装置防止溶剂水蒸发，持续保温在95℃，搅拌一小时，冷却到室温，便得到30纳米直径的银纳米颗粒悬浊液。
3.根据权利要求2所述的基于表面增强拉曼散射光谱技术的DNA杂化检测方法，其特征在于：采用化学方法合成的30纳米银纳米颗粒采用柠檬酸钠还原，具体方法是：将制备好的30纳米银纳米颗粒悬浊液经12000转每秒高速离心水洗后分散于溶剂水中，柠檬酸根吸附在银纳米颗粒上，无法被离心水洗清除，再分散后的30纳米银纳米颗粒表面功能团为带负电的柠檬酸根。
4.根据权利要求1或2或3所述的基于表面增强拉曼散射光谱技术的DNA杂化检测方法，其特征在于：步骤(2)中所述铆定了DNA探针的银纳米颗粒悬浊液；具体方法是：按体积比1:100将10-4摩尔每升巯基化的DNA探针加入到步骤(1)中制备的银纳米颗粒悬浊液中，静置反应30分钟后用超纯水离心洗涤三次，去除悬浊液中残留的未吸附的巯基化探针DNA，获得表面铆定巯基化探针DNA的30纳米银纳米颗粒悬浊液。
5.根据权利要求1或2或3所述的基于表面增强拉曼散射光谱技术的DNA杂化检测方法，其特征在于：步骤(3)中得到的悬浊液还包括，用超纯水离心洗涤三次，去除悬浊液中残留的未杂化的待测DNA样品得到杂化后的DNA样品的步骤。
6.根据权利要求1或2或3所述的基于表面增强拉曼散射光谱技术的DNA杂化检测方法，其特征在于：步骤(4)中所述拉曼光谱测量的具体方法是：通过聚焦镜实现激光入射，使入射激光光束照射到DNA与纳米颗粒自组装样品上，激光激发团簇后30纳米银纳米颗粒产生局域表面等离子体发生共振耦合，使得团簇后30纳米银纳米颗粒间形成的纳米间隙内的局域电磁场增强到108-1012数量级，通过采集激光入射点的表面增强拉曼光谱，并与未发生DNA杂化的光谱作对比获取测量位点处拉曼光谱的产生来源，从而确定该测量位点处的是否发生DNA杂化。
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CN109929748A (zh) * 2019-03-08 2019-06-25 东南大学 基于针尖增强拉曼散射光谱技术实现dna测序的仪器平台

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