CN101694467A - 一种表面增强拉曼散射探针的制备方法 - Google Patents

Abstract

一种表面增强拉曼散射探针的制备方法涉及一种具有高表面增强拉曼散射活性的聚乙烯吡咯烷酮包裹的聚集银纳米探针的制备方法，及其应用于调控银纳米粒子的聚集程度和细胞内的SERS检测，该方法选用银胶溶液作为原料，氯化钠作为聚集剂，将聚乙烯吡咯烷酮包裹在银聚集体表面；具体方法是通过将拉曼标记物按照与银胶溶液体积比1∶1000-1∶100加入银胶溶液中在搅拌条件下混合均匀，再加入氯化钠溶液使混合了拉曼标记物的银胶溶液聚集成二至五个粒子的聚集体，最后加入聚乙烯吡咯烷酮溶液，继续搅拌5-15分钟后用孔径规格为100-220nm的滤器将所得的溶液过滤即得到表面增强拉曼散射探针；该探针为水溶性胶体溶液。

Description

一种表面增强拉曼散射探针的制备方法

技术领域

本发明涉及一种具有高表面增强拉曼散射(Surface enhanced RamanScattering，SERS)活性的聚乙烯吡咯烷酮(Polyvinylpyrrolidone，PVP)包裹的聚集银纳米探针的制备方法，及其应用于调控银纳米粒子的聚集程度和细胞内的SERS检测。更一般地涉及金属纳米材料，聚合物材料。

背景技术

近年来，通过设计具有一定功能的光学探针来检测生物样品一直是研究的热点。荧光探针是传统的光学探针，经过长时间的发展，荧光探针已经得到了广泛应用。然而荧光探针具有激发光谱较窄，样品容易光漂白，荧光染料浓度过高对生物样品有毒性等缺点。与传统的荧光光谱检测手段相比，表面增强拉曼散射技术(Surface enhanced Raman scattering，SERS)具有谱线窄，有效淬灭荧光背景干扰，能够提供探测样品的指纹信息，以及样品不易光漂白等优点。不仅如此，由于表面增强拉曼散射对拉曼信号巨大的增强效应(10⁵-10⁶倍甚至更高，使得样品的检测浓度可以很低甚至达到单分子量级。目前基于表面增强拉曼散射技术的纳米结构和纳米器件已经成为探测和分析生物样品的有利工具。尽管有许多具有很高灵敏度的SERS探针被报道，具有良好稳定性和生物兼容性的探针却不多见。使金属纳米粒子聚集可以提供更多“热点”从而显著提高SERS强度，然而过度的聚集会导致金属纳米粒子形成大的不稳定团簇并且迅速沉淀。在细胞、组织乃至活体的应用对SERS探针的要求更高，不但要求探针具有很高的SERS增强效果，能在较小的激发光功率条件下采集到SERS信号，而且要求金属纳米粒子的大小尺寸不能过大，否则会引起细胞损伤。而且需要探针具有良好的化学稳定性和生物兼容性。要满足上述要求，SERS探针通常会进行表面修饰来提高性能。目前SERS探针的表面修饰主要有两种方法：包裹二氧化硅和包裹聚合物。包裹聚合物的方法也有很多种，相比于其他的包裹聚合物的方法，包裹聚乙烯吡咯烷酮的方法操作简单，成本低廉，可重复性好，可以有效控制探针尺寸，优化SERS信号强度，而且具有良好的化学稳定性以及生物兼容性。

发明内容

技术问题：本发明的目的是提供一种尺寸大小可控、SERS信噪比高、化学稳定性好、制备简单以及具有很好的生物兼容性的表面增强拉曼散射探针的制备方法。

技术方案：为了实现上述目的，本发明的制备工艺流程为：选用银胶溶液作为原料，氯化钠作为聚集剂，将聚乙烯吡咯烷酮包裹在银聚集体表面；具体方法是通过将拉曼标记物按照与银胶溶液体积比1∶1000-1∶100加入银胶溶液中在搅拌条件下混合均匀，再加入氯化钠溶液使混合了拉曼标记物的银胶溶液聚集成二至五个粒子的聚集体，最后加入聚乙烯吡咯烷酮溶液，继续搅拌5-15分钟后用孔径规格为100-220nm的滤器将所得的溶液过滤即得到表面增强拉曼散射探针；该探针为水溶性胶体溶液。所述的拉曼标记物为能够以静电吸附或者共价键结合的方式处于银纳米粒子的表面，在激发光的照射下产生强烈的拉曼散射信号的分子。所述的拉曼标记物的浓度为10^-2M～10^-6M。

有益效果：本发明的优点如下：

其一是本发明的SERS探针的尺寸大小可控，既使得银纳米粒子聚集产生热点保证了表面拉曼散射的巨大增强效应又使得了探针的聚集程度在2-5个银纳米粒子之间，整体的尺寸在220纳米以内，从而保证了该探针在细胞中的应用不会引起细胞膜的机械性损伤。

其二是本发明的SERS探针具有优良的化学稳定性。制备好探针溶液在避光室温静置的条件下至少可以保持稳定长达两个月，即使在更长的保存时间中出现了少量沉淀，经过简单的用手摇晃探针溶液可以立刻恢复均匀。

其三是本发明的SERS探针制备过程操作简单，可重复性好，成本低廉，环境友好。探针的制备所需原料中，聚乙烯吡咯烷酮是一种价格低廉的高分子聚合物，无毒，被广泛应用于工业以及医药领域。银纳米粒子和拉曼标记物也只需要极少量就可以完成探针的制备。

其四是本发明的SERS探针具有很高的灵敏度，在较小的激发光功率(2.3毫瓦)入射下可以实现细胞内SERS检测。探针还具有良好的生物兼容性，对细胞的毒性很小。

附图说明

现结合附图对本发明做出说明。附图中采用以罗丹明6G和4巯基苯甲酸作为拉曼标记物为例进行说明。

图1本发明制备的PVP包裹聚集银纳米粒子的SERS生物探针的制备示意图：i为在银纳米粒子中加入拉曼标记物；ii为加入氯化钠引起银纳米粒子的聚集；iii为加入PVP，形成保护层。

图2为本发明制备的以罗丹明6G作为拉曼标记物探针的SERS光谱。

图3-1从a至h，分别为纯银胶溶液，加入罗丹明6G后的银胶溶液以及第一组溶液在加入氯化钠之后1分钟，30分钟，60分钟，90分钟，2小时以及5小时的吸收光谱。

图3-2从a至g分别为纯银胶溶液，加入罗丹明6G的银胶溶液以及第二组溶液在加入氯化钠之后30分钟，60分钟，90分钟，2小时，5小时的吸收光谱。

图3-3包裹PVP(圆型图例)罗丹明6G探针溶液和未包裹PVP(方形图例)的罗丹明6G吸附银胶溶液的SERS光谱在1510波数处的强度随氯化钠溶液加入量的关系图。

图4为4巯基苯甲酸探针在(a)Hela细胞中；(b)探针溶液中的SERS光谱。

具体实施方式

实施例一探针制备(以罗丹明6G探针为例)

第一步实验采用Lee和Meisel报道的方法制备银胶溶液。将1.0×10^-2M硝酸银溶液按照与银胶溶液体积比1∶10加入去离子水中，搅拌并加热至沸腾。将1％柠檬酸钠溶液按照与银胶溶液体积比1∶50加入到沸腾的硝酸银溶液中，持续搅拌并加热沸腾40分钟得到银胶溶液。制成的银胶溶液避光、密闭保存备用。

第二步配制1mM的罗丹明6G水溶液，取罗丹明6G溶液在磁力搅拌下按照与银胶溶液体积比1∶1000-1∶100加入到银胶溶液中，反应5分钟。将0.5M氯化钠溶液按照与银胶溶液体积比1∶150加入罗丹明6G和银胶溶液的混合溶液中引起银纳米粒子的聚集，然后迅速按照与银胶溶液体积比1∶75加入1％的分子量为50000的PVP水溶液。反应在磁力搅拌下持续10分钟，然后用孔径规格为100-220nm的滤器将所得的胶体溶液过滤，以除去少量过大的聚集体。过滤后SERS探针即制得。SERS活性如图2。

实施例二探针的化学稳定性检测(以罗丹明6G探针为例)

第一步做一组吸收光谱稳定性的对比实验，第一组先配制1mM的罗丹明6G水溶液，取罗丹明6G溶液在磁力搅拌下按照与银胶溶液体积比1∶500加入到银胶溶液中反应5分钟。再按照与银胶溶液体积比1∶750加入浓度为0.5M氯化钠溶液；第二组在第一组基础上按照与银胶溶液体积比1∶150加入1％分子量为50000的PVP水溶液。将第一组和第二组的溶液随着时间的变化分别记录其吸收光谱。由吸收光谱强度的变化可以得知，如果没有PVP的保护，如图3-1，加入氯化钠后，位于429nm处的银钠米粒子的等离子吸收峰强度迅速下降，并最终趋于消失。这说明银钠米粒子在短时间内过度聚集并最终形成不可逆转的沉淀。如图3-2，在有PVP包裹的银胶的吸收光谱则在较长时间内基本维持在加入氯化钠之后的状态。这说明PVP确实可以控制银钠米粒子的聚集程度，从而达到控制探针的尺寸的目的。探针具有良好的化学稳定性。

第二步做一组SERS光谱稳定性对比实验，第一组先配制1mM的罗丹明6G水溶液，取15μL罗丹明6G溶液在磁力搅拌下加入到15mL银胶溶液中，反应5分钟。然后不断加入0.5M浓度的氯化钠溶液，加入量从0μL至30μL。第二组在罗丹明6G和银胶溶液的混合溶液中先加入PVP溶液形成保护层，再加入0μL至30μL的氯化钠溶液。测量两组溶液的SERS新信号。结果表明没有包裹PVP的银胶溶液的SERS强度随着氯离子量的增加在达到一个最大值后迅速下降。而包裹了PVP的探针溶液SERS强度在达到最大值后基本保持稳定，如图3-3。该对比实验也说明PVP包裹的SERS探针具有良好的化学稳定性。

实施例三探针在活细胞中的SERS活性以及探针的生物兼容性(活细胞内SERS活性以4巯基苯甲酸探针为例，细胞成活率以罗丹明6G探针为例)第一步将宫颈癌细胞(Hela)置于培养基中进行体外培养(37℃，5％CO₂)。24小时后，将4巯基苯甲酸SERS探针溶液(制备方法与罗丹明6G探针溶液一致)按体积比(3∶1)加入细胞培养基中，轻轻摇匀，并且重新置于培养箱内。SERS探针通过被细胞吞噬而进入细胞内部。1.5小时之后，吸出培养基，用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗细胞3次以去除未被细胞吞噬而残留在培养基中的SERS探针，待用。

第二步将用缓冲液冲洗过的细胞置于共焦显微镜的载物台上，选定一个细胞区域测量细胞内的SERS光谱，并成像。细胞在吞噬PVP包裹的SERS探针之后仍然保持良好的形态。而吞噬未包裹PVP的SERS探针的Hela细胞则出现细胞质收缩现象，细胞活力减弱。在活细胞内，包裹PVP的探针仍然保持了很高的SERS灵敏度，较之在液在溶液中的SERS信号，强度和信噪比均有很大提高如图4。

第三步测定细胞成活率。将体外培养的宫颈癌细胞(细胞密度10⁴/cm³)接种于96孔板中并在培养箱中培养24小时。每孔加入20μL罗丹明6G探针溶液并置于培养箱中培养，14小时后每孔加入3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)溶液50μL，再置于培养箱培养4小时。吸出每孔上清液，然后每孔加入150μL二甲基亚砜(DMSO)，摇匀后用酶标仪在490nm波长下读出吸光度，并换算成细胞的成活率。同时以空白细胞作对比。结果显示孵育了PVP包裹的罗丹明SERS探针的Hela细胞成活率约为80％，说明PVP包裹的SERS探针具有良好的生物兼容性。

Claims (3)

1.一种表面增强拉曼散射探针的制备方法，其特征在于该方法选用银胶溶液作为原料，氯化钠作为聚集剂，将聚乙烯吡咯烷酮包裹在银聚集体表面；具体方法是通过将拉曼标记物按照与银胶溶液体积比1∶1000-1∶100加入银胶溶液中，在搅拌条件下混合均匀。再加入氯化钠溶液使混合了拉曼标记物的银胶溶液聚集成二至五个粒子的聚集体。最后加入聚乙烯吡咯烷酮溶液，继续搅拌5-15分钟后用孔径规格为100-220nm的滤器将所得的溶液过滤即得到表面增强拉曼散射探针；该探针为水溶性胶体溶液。

2.根据权利要求1所述的表面增强拉曼散射探针的制备方法，其特征在于：所述的拉曼标记物为能够以静电吸附或者共价键结合的方式处于银纳米粒子的表面，在激发光的照射下产生强烈的拉曼散射信号的分子。

3.根据权利要求1所述的表面增强拉曼散射探针的制备方法，其特征在于：所述的拉曼标记物的浓度为10^-2M～10^-6M。

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