CN102346148B - 一种基于自组装材料对癌细胞表面增强拉曼检测的方法 - Google Patents
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Abstract
一种基于自组装材料对癌细胞表面增强拉曼检测的方法，属于分析化学技术领域。本发明包括金纳米棒探针及金纳米粒子探针制备, 金纳米棒探针和金纳米粒子探针的自组装，表面增强拉曼检测癌细胞。表面增强拉曼散射（Surface Enhanced Raman Scattering,SERS）是拉曼散射的一种，它可以被简短地描述为当分子吸附在特别制备的金属表面时，它的拉曼信号强度要比简单计算的预期值高出105-106倍的这种现象。这就使得单分子检测成为了可能。本发明制备出组装结构均一、可控并且具有SERS活性的纳米材料组装体并将其应用于癌细胞进行检测。
Description
技术领域
一种基于自组装材料对癌细胞表面增强拉曼检测的方法，属于分析化学技术领域。
背景技术
功能性纳米材料包括量子点、金纳米粒子、金纳米棒等，这些纳米材料具有特殊的光学、磁学、电学、热力学等特性，纳米材料的应用已经成为当前研究的热点。尤其是金纳米粒子和金纳米棒的特殊的光吸收、光散射效应及拉曼增强效应使得其作为传感器在纳米科学与技术研究中应用最为广泛的两种材料。
单分散的纳米材料通过自组装手段形成一些独特的材料具有等离子耦合，电磁场增强，荧光淬灭或者增强及多重功能性质耦合等性质。通过研究可控、动态自组装材料的性质可以更好地理解宏观材料的物理和化学性质。在可控纳米材料自组装的过程中，纳米材料的各向异性及其表现出来的特异化学反应性质成为纳米材料自组装的关键因素。金纳米棒同时具有空间几何和化学各向异性，并且金纳米棒可以通过改变长径比（金纳米棒的长度和金纳米棒的直径的比值）调节金纳米棒的纵向共振峰来实现金纳米棒在可见光或者近红外区域强的光吸收，因而这些独特的性质使得金纳米棒能够实现可控自组装材料良好的“原料”，进而能够提供对自组装纳米材料进行理论解析的一个良好的模型。
由于介质的某些不均匀性（如电场、粒子数密度等），光波与介质相互作用时，光波会改变传播方向，这就是光的散射现象。它包括两种情况：一是光波与介质无能量交换产生弹性散射，如瑞利散射等；另外一种是由印度物理学家C.V.Raman在1928年发现的光波与介质发生能量交换，散射光波长与入射光波长之间就会发生位移现象，这时即为非弹性散射，也被称为拉曼散射现象。Raman由于发现这种新的光散射现象获得了1930年的诺贝尔物理学奖。表面增强拉曼散射（Surface Enhanced Raman Scattering,SERS）是拉曼散射的一种，它可以被简短地描述为当分子吸附在特别制备的金属表面时，它的拉曼信号强度要比简单计算的预期值高出105-106倍的这种现象。这就使得单分子检测成为了可能。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于自组装材料对活细胞癌细胞表面增强拉曼检测的方法，制备出组装结构均一，可控并且具有SERS活性的纳米材料组装体并将其应用于癌细胞进行检测。
本发明的技术方案：
表1 DNA的编号、序列及长度
| 编号 | 序列(5’-3’) | 长度 |
| ASY1 | TAGGAATAGT TATAAAAAAA AAAAA | 25 |
| ASY2 | TTATAACTAT TCCTAAAAA A AAAAA | 25 |
| ASY3 | AAAAAAAAAA | 10 |
注：本发明所使用的DNA均购自中国上海生工生物工程有限公司，并通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯化。
一种基于自组装材料对活细胞癌细胞表面增强拉曼检测的方法，包括金纳米棒探针及金纳米粒子探针制备, 金纳米棒探针和金纳米粒子探针的自组装，癌细胞的培养，表面增强拉曼检测癌细胞；工艺步骤为：
（1）金纳米棒探针及金纳米粒子探针的制备
金纳米粒子和巯基修饰的DNA进行偶联形成金纳米粒子探针；
采用不同的方法对金纳米棒的全身、端面及侧面修饰DNA形成全身修饰；侧面修饰、端面封闭；端面修饰、侧面封闭三种不同类型的金纳米棒探针：
（2）金纳米棒探针和金纳米粒子探针自组装
对步骤（1）制备好的金纳米棒探针和金纳米粒子探针进行自组装形成三种不同的自组装结构：金纳米粒子围绕金纳米棒组装形成卫星式组装结构；金纳米粒子围绕金纳米棒侧面组装；金纳米粒子和金纳米棒端面组装；
（3）Hela细胞的培养
利用培养基对Hela细胞进行培养；
（4）表面增强拉曼检测癌细胞
将步骤（2）制备好的三种自组装材料分别加入到步骤（3）培养的Hela细胞中进行表面增强拉曼检测。
所述的基于自组装材料对活细胞癌细胞表面增强拉曼检测的方法，金纳米粒子探针及金纳米棒探针制备：
1）金纳米粒子探针制备
洁净的三角烧瓶中加入95mL的超纯水，而后向水中加入5mL的浓度为2g/L的氯金酸，加热，煮沸，紧接着加入2.5mL 质量浓度1%的柠檬酸三钠溶液，边加热边搅拌，溶液颜色从淡黄色变成红色，反应持续6-8min以使柠檬酸三钠完全沉降，最后，溶液冷却至室温，用超纯水稀释到100mL，4℃保藏，即制得粒径18nm级的金纳米粒子；
将5mL的金纳米粒子10000rpm离心10min用0.5mL的超纯水分散，10000rpm离心10min弃上清，用1mL的超纯水分散，4℃保藏、待用；
取步骤制备的金纳米粒子80μL加入8μL 100μM的ASY1，混匀，室温静置反应12h后，加入2.1μL的2M的NaCl溶液至反应体系中NaCl浓度达到50mM，混匀，室温静置反应12h；
所述ASY1为：5’-TAGGAATAGT TATAAAAAAA AAAAA-3’；
将步骤中反应溶液在10000rpm离心10min，弃上清，后用80μL超纯水分散沉淀，后用超纯水清洗一次，4℃保藏、待用，得金纳米粒子探针；
2)金纳米棒探针制备
晶种合成：28℃下0.1mL的2g/L的三水合四氯金酸加入到1mL 的0.2M的十六烷基三甲基溴化铵溶液中，溶液颜色由无色变成黄褐色，然后加入0.12mL新配制的0.01M硼氢化钠溶液，快速搅拌2min，溶液颜色即由黄褐色变为浅棕色；
金纳米棒生长：金种子溶液合成好以后，进行金纳米棒的生长，5mL的2g/L的三水合四氯金酸加入到5mL、0.2M十六烷基三甲基溴化铵溶液中，加入4mL的超纯水，混匀，0.125 mL的 0.01M硝酸银溶液加入到上述混合体系中，混匀，随后将65μL、0.1M抗坏血酸溶液加入上述体系中，28℃下搅拌反应2min，溶液由褐色变成无色，最后，加入0.05mL的晶种溶液轻柔搅拌混匀20s，28℃反应4h，制得金纳米棒；
将5mL金纳米棒10000rpm离心10min用0.5mL的超纯水分散，10000rpm离心10min弃上清，用0.5mL的0.005M 十六烷基三甲基溴化铵CTAB溶液分散，4℃保藏、待用，用于修饰；
全身修饰：
取上述待用的金纳米棒10μL加入4μL的100μM的ASY2，混匀，室温振摇反应12h，6000rpm离心10min，弃上清，用10μL的超纯水分散沉淀，超纯水洗一次，4℃保藏、得全身修饰的金纳米棒探针；
所述ASY2为：5’-TTATAACTAT TCCTAAAAAA AAAAA-3’；
侧面修饰、端面封闭：
取上述待用的金纳米棒10μL加入1μL的10μM的辅助ASY3振摇反应12h，封闭端面，后加入4μL的100μM的ASY2修饰侧面，混匀，室温振摇反应12h，6000rpm离心6min，弃上清，用10μL的超纯水沉淀，超纯水洗一次，4℃保藏、得侧面修饰、端面封闭的金纳米棒探针；
所述ASY3为：5’-AAAAAAAAAA-3’；
端面修饰、侧面封闭：
取上述待用的金纳米棒10μL加入1μL的10μM的ASY2，混匀，室温振摇反应12h，后加入4μL的100μM的辅助ASY3封闭侧面，混匀，室温振摇反应12h，6000rpm离心6min，弃上清，用10μL的超纯水分散，超纯水洗一次，4℃保藏、得端面修饰、侧面封闭的金纳米棒探针；
对照组
取上述待用的金纳米棒10μL加入4μL的100μM的辅助ASY3振摇反应12h，6000rpm离心6min，弃上清，用10μL的超纯水分散，超纯水洗一次，4℃保藏、得金纳米棒-ASY3复合物。
所述的基于自组装材料对活细胞癌细胞表面增强拉曼检测的方法，金纳米棒探针和金纳米粒子探针的自组装
金纳米粒子围绕金纳米棒组装形成卫星式组装结构
取制得的全身修饰的金纳米棒探针2μL和金纳米粒子探针10μL，加入12μL pH7.5的含0.01%的十二烷基磺酸钠SDS、20mM KCl的0.01M Tris-HCl杂交缓冲液，混匀，室温振摇反应12h；
金纳米粒子围绕金纳米棒侧面组装
取制得的侧面修饰、端面封闭的金纳米棒探针2μL和金纳米粒子探针9μL，加入11μL pH7.5的含0.01%的SDS、20mM KCl的0.01M Tris-HCl杂交缓冲液，混匀，室温振摇反应12h；
金纳米粒子和金纳米棒端面组装
取制得的端面修饰、侧面封闭的金纳米棒探针3μL和金纳米粒子探针3μL，加入6μL pH7.5的含0.01%的SDS、20mM KCl的0.01M Tris-HCl杂交缓冲液，混匀，室温振摇反应12h；
对照组装
取制得的金纳米粒子探针5μL和辅助ASY3全身修饰的金纳米棒5μL，加入10μL pH7.5的含0.01%的SDS，20mM KCl 的0.01M Tris-HCl杂交缓冲液，混匀，室温振摇反应12h。
所述的基于自组装材料对活细胞癌细胞表面增强拉曼检测方法，表面增强拉曼检测癌细胞：将制备好的三种自组装材料及对照组装用超纯水稀释3倍，分别取10μL的三种组装材料及对照组装分别加入到100μL的Hela细胞培养液中，37℃、5%的CO2恒温培养箱培养12h，弃上层培养液，对细胞进行拉曼测定，25℃表面拉曼增强仪测定信号。
本发明的有益效果：表面增强拉曼散射（Surface Enhanced Raman cattering，SERS）是拉曼散射的一种，它可以被简短地描述为当分子吸附在特别制备的金属表面时，它的拉曼信号强度要比简单计算的预期值高出105-106倍的这种现象。这就使得单分子检测成为了可能。本发明制备出组装结构均一、可控并且具有SERS活性的纳米材料组装体并将其应用于癌细胞进行检测。
附图说明
图1 典型的金纳米棒和金纳米粒子的组装结构图。A）金纳米粒子绕金纳米棒全身自组装；B) 金纳米粒子和金纳米棒侧面自组装；C) 金纳米粒子和金纳米棒端面自组装；D) 对照组装。
图2 Hela细胞在加入自组装材料培养12h的光学显微镜照片。A) 全身自组装纳米材料；B) 侧面自组装纳米材料；C) 端面自组装纳米材料。
图3 Hela活细胞的表面增强拉曼图。
具体实施方式
实施例1
金纳米粒子和金纳米棒探针制备
与本申请人申请的专利：一种具有表面增强拉曼活性的自组装材料的制备方法，申请号101010605799.9的制备金纳米粒子和金纳米棒探针的步骤类似进行制备本专利所要求的金纳米棒和金纳米粒子的探针。
1）金纳米粒子探针制备
洁净的三角烧瓶中加入95mL的水，而后向水中加入5mL的浓度为2g/L的氯金酸，加热，煮沸，紧接着加入2.5mL 质量浓度1%的柠檬酸三钠溶液，边加热边搅拌，溶液颜色从淡黄色变成红色，反应持续6-8min以使柠檬酸三钠完全沉降，最后，溶液冷却至室温，稀释到100mL，4℃保藏，即制得粒径18nm级的金纳米粒子。
将上述制备的5mL的金纳米粒子10000rpm离心10min用0.5mL的超纯水分散，10000rpm离心10min弃上清，用1mL的超纯水分散，4℃保藏、待用。
取上述制备好的金纳米粒子80μL加入8μL100μM的ASY1，混匀，室温静置反应12h后，加入2.1μL的2M的NaCl溶液至反应体系中NaCl浓度达到50mM，混匀，室温静置反应12h。
将上述步骤中反应溶液在10000rpm离心10min，弃上清，后用80μL超纯水分散沉淀，后用超纯水清洗一次，4℃保藏、待用。
2)金纳米棒探针制备
晶种合成：28.0℃下0.1mL的2g/L的三水合四氯金酸加入到1mL 的0.2M的十六烷基三甲基溴化铵溶液中，溶液颜色由无色变成黄褐色，然后加入0.12mL新配制的0.01M硼氢化钠溶液，快速搅拌2min，溶液颜色即由黄褐色变为浅棕色；
金纳米棒生长：金种子溶液合成好以后，进行金纳米棒的生长，5mL的2g/L的三水合四氯金酸加入到5mL、0.2M十六烷基三甲基溴化铵溶液中，加入4mL的水，混匀，0.125 mL的 0.01M硝酸银溶液加入到上述混合体系中，混匀，随后将65μL、0.1M抗坏血酸溶液加入上述体系中，28℃下搅拌反应2min，溶液由褐色变成无色，最后，加入0.05mL的晶种溶液轻柔搅拌混匀20s，28℃反应4h，制得金纳米棒。
将上述制备的5mL金纳米棒10000rpm离心10min用0.5mL的超纯水分散，10000rpm离心10min弃上清，用0.5mL的0.005M CTAB分散，4℃保藏、待用。
全身修饰：
取上述制备好的金纳米棒10μL加入4μL的100μM的ASY2，混匀，室温振摇反应12h，6000转每min离心10min，弃上清，用10μL的超纯水分散沉淀，超纯水洗一次，4℃保藏、待用。
侧面修饰、端面封闭：
取上述制备好的金纳米棒10μL加入1μL的10μM的辅助ASY3振摇反应12h，封闭端面，后加入4μL的100μM的ASY2修饰侧面，混匀，室温振摇反应12h，6000转每min离心6min，弃上清，用10μL的超纯水沉淀，超纯水洗一次，4℃保藏、待用。
端面修饰、侧面封闭：
取上述制备好的金纳米棒10μL加入1μL的10μM的ASY2，混匀，室温振摇反应12h，后加入4μL的100μM的辅助ASY3封闭侧面，混匀，室温振摇反应12h，6000转每min离心6min，弃上清，用10μL的超纯水分散，超纯水洗一次，4℃保藏、待用。
对照实验
取上述制备好的金纳米棒10μL加入4μL的100μM的辅助ASY3振摇反应12h，6000转每min离心6min，弃上清，用10μL的超纯水分散金纳米棒-ASY3复合物，超纯水洗一次，4℃保藏、待用。
实施例3 金纳米棒探针和金纳米粒子探针自组装
金纳米粒子围绕金纳米棒组装形成卫星式组装结构
取修饰好的全身修饰的金纳米棒2μL和修饰好的金纳米粒子10μL，加入12μL pH7.5的0.01M的Tris-HCl，0.01%的SDS，20mM的KCl杂交缓冲液，混匀，室温振摇反应12h。
金纳米粒子围绕金纳米棒侧面组装
取修饰好的侧面修饰、端面封闭的金纳米棒2μL和修饰好的金纳米粒子9μL，加入11μL pH 7.5的0.01M的Tris-HCl，0.01%的SDS，20mM的KCl杂交缓冲液，混匀，室温振摇反应12h。
金纳米粒子和金纳米棒端面组装
取修饰好的端面修饰、侧面封闭的金纳米棒3μL和修饰好的金纳米粒子3μL，加入6μL pH 7.5的0.01M的Tris-HCl，0.01%的SDS，20mM的KCl杂交缓冲液，混匀，室温振摇反应12h。
对照组装
中金纳米粒子5μL和辅助ASY3全身修饰的金纳米棒5μL，加入10μL pH7.5的0.01M的Tris-HCl，0.01%的SDS，20mM的KCl杂交缓冲液，混匀，室温振摇反应12h。
实施例4 Hela细胞培养
本专利采用的癌细胞是Hela细胞。Hela细胞从培养瓶到96孔板的处理过程：
去除培养瓶中的旧培养基，每个培养瓶加入2 mL pH 7.4 0.01M的磷酸盐缓冲液，左右轻微晃动培养瓶，然后去除磷酸盐缓冲液。
然后向每个培养瓶中加入1mL 0.25%的胰蛋白酶消化液，消化3min。
将加入的胰蛋白酶消化液去除。
加入2 mL的 DMEM培养基（上海沪峰生物科技有限公司提供），轻轻吹打几次，直至培养瓶壁上的细胞都分散到培养基中。
将上述制备好的细胞培养液加入到细胞培养板中，每孔加入100μL。
然后将上述细胞培养板放置在培养条件37℃、5%的CO2恒温培养箱培养12 h。
实施例5 表面增强检测癌细胞
将实施例3制备好的三种自组装材料及对照组装用水稀释3倍，分别取10μL的三种组装材料及对照组装分别加入到每孔含有100μL的Hela细胞培养液的96孔板中，（每个孔中含有约10万个细胞），37℃、5%的CO2恒温培养箱培养12 h，弃上层培养液，对细胞进行拉曼测定，25℃表面拉曼增强仪器测定信号。
Claims (3)
1.一种基于自组装材料对活癌细胞表面增强拉曼检测的方法，其特征在于：金纳米棒探针及金纳米粒子探针制备, 金纳米棒探针和金纳米粒子探针的自组装，癌细胞的培养，表面增强拉曼检测癌细胞；工艺步骤为：
（1）金纳米棒探针及金纳米粒子探针的制备
金纳米粒子和巯基修饰的DNA进行偶联形成金纳米粒子探针；
采用不同的方法对金纳米棒的全身、侧面及端面修饰DNA形成全身修饰；侧面修饰、端面封闭；端面修饰、侧面封闭三种不同类型的金纳米棒探针：
（2）金纳米棒探针和金纳米粒子探针自组装
对步骤（1）制备好的金纳米棒探针和金纳米粒子探针进行自组装形成三种不同的自组装结构：金纳米粒子围绕金纳米棒组装形成卫星式组装结构；金纳米粒子围绕金纳米棒侧面组装；金纳米粒子和金纳米棒端面组装；
（3）Hela细胞的培养
利用培养基对Hela细胞进行培养；
（4）表面增强拉曼检测癌细胞
将制备好的三种自组装材料及对照组装用超纯水稀释3倍，分别取10μL的三种组装材料及对照组装分别加入到100μL的Hela细胞培养液中，37℃、5%的CO2恒温培养箱培养12h，弃上层培养液，对细胞进行拉曼测定，25℃表面拉曼增强仪测定信号。
2.根据权利要求1所述的基于自组装材料对活癌细胞表面增强拉曼检测的方法，其特征在于金纳米粒子探针及金纳米棒探针制备：
1）金纳米粒子探针制备
洁净的三角烧瓶中加入95mL的超纯水，而后向水中加入5mL的浓度为2g/L的氯金酸，加热，煮沸，紧接着加入2.5mL 质量浓度1%的柠檬酸三钠溶液，边加热边搅拌，溶液颜色从淡黄色变成红色，反应持续6-8min以使柠檬酸三钠完全沉降，最后，溶液冷却至室温，用超纯水稀释到100mL，4℃保藏，即制得粒径18nm级的金纳米粒子；
将5mL的金纳米粒子10000rpm离心10min用0.5mL的超纯水分散，10000rpm离心10min弃上清，用1mL的超纯水分散，4℃保藏、待用；
取步骤制备的金纳米粒子80μL加入8μL 100μM的ASY1，混匀，室温静置反应12h后，加入2.1μL的2M的NaCl溶液至反应体系中NaCl浓度达到50mM，混匀，室温静置反应12h；
所述ASY1为：5’-TAGGAATAGT TATAAAAAAA AAAAA-3’；
将步骤中反应溶液在10000rpm离心10min，弃上清，后用80μL超纯水分散沉淀，后用超纯水清洗一次，4℃保藏、待用，得金纳米粒子探针；
2)金纳米棒探针制备
晶种合成：28℃下0.1mL的2g/L的三水合四氯金酸加入到1mL 的0.2M的十六烷基三甲基溴化铵溶液中，溶液颜色由无色变成黄褐色，然后加入0.12mL新配制的0.01M硼氢化钠溶液，快速搅拌2min，溶液颜色即由黄褐色变为浅棕色；
金纳米棒生长：金种子溶液合成好以后，进行金纳米棒的生长，5mL的2g/L的三水合四氯金酸加入到5mL、0.2M十六烷基三甲基溴化铵溶液中，加入4mL的超纯水，混匀，0.125 mL的 0.01M硝酸银溶液加入到上述混合体系中，混匀，随后将65μL、0.1M抗坏血酸溶液加入上述体系中，28℃下搅拌反应2min，溶液由褐色变成无色，最后，加入0.05mL的晶种溶液轻柔搅拌混匀20s，28℃反应4h，制得金纳米棒；
将5mL金纳米棒10000rpm离心10min用0.5mL的超纯水分散，10000rpm离心10min弃上清，用0.5mL的0.005M 十六烷基三甲基溴化铵溶液分散，4℃保藏、待用，用于修饰；
全身修饰：
取上述待用的金纳米棒10μL加入4μL的100μM的ASY2，混匀，室温振摇反应12h，6000rpm离心10min，弃上清，用10μL的超纯水分散沉淀，超纯水洗一次，4℃保藏、得全身修饰的金纳米棒探针；
所述ASY2为：5’-TTATAACTAT TCCTAAAAAA AAAAA-3’；
侧面修饰、端面封闭：
取上述待用的金纳米棒10μL加入1μL的10μM的辅助ASY3振摇反应12h，封闭端面，后加入4μL的100μM的ASY2修饰侧面，混匀，室温振摇反应12h，6000rpm离心6min，弃上清，用10μL的超纯水沉淀，超纯水洗一次，4℃保藏、得侧面修饰、端面封闭的金纳米棒探针；
所述ASY3为：5’-AAAAAAAAAA-3’；
端面修饰、侧面封闭：
取上述待用的金纳米棒10μL加入1μL的10μM的ASY2，混匀，室温振摇反应12h，后加入4μL的100μM的辅助ASY3封闭侧面，混匀，室温振摇反应12h，6000rpm离心6min，弃上清，用10μL的超纯水分散，超纯水洗一次，4℃保藏、得端面修饰、侧面封闭的金纳米棒探针；
对照组
取上述待用的金纳米棒10μL加入4μL的100μM的辅助ASY3振摇反应12h，6000rpm离心6min，弃上清，用10μL的超纯水分散，超纯水洗一次，4℃保藏、得金纳米棒-ASY3复合物。
3.根据权利要求2所述的基于自组装材料对活癌细胞表面增强拉曼检测的方法，其特征是金纳米棒探针和金纳米粒子探针的自组装
金纳米粒子围绕金纳米棒组装形成卫星式组装结构
取制得的全身修饰的金纳米棒探针2μL和金纳米粒子探针10μL，加入12μL pH7.5的含0.01%的十二烷基磺酸钠SDS、20mM KCl的0.01M Tris-HCl杂交缓冲液，混匀，室温振摇反应12h；
金纳米粒子围绕金纳米棒侧面组装
取制得的侧面修饰、端面封闭的金纳米棒探针2μL和金纳米粒子探针9μL，加入11μL pH7.5的含0.01%的SDS、20mM KCl的0.01M Tris-HCl杂交缓冲液，混匀，室温振摇反应12h；
金纳米粒子和金纳米棒端面组装
取制得的端面修饰、侧面封闭的金纳米棒探针3μL和金纳米粒子探针3μL，加入6μL pH7.5的含0.01%的SDS、20mM KCl的0.01M Tris-HCl杂交缓冲液，混匀，室温振摇反应12h；
对照组组装
取制得的金纳米粒子探针5μL和辅助ASY3全身修饰的金纳米棒5μL，加入10μL pH7.5的含0.01%的SDS，20mM KCl 的0.01M Tris-HCl杂交缓冲液，混匀，室温振摇反应12h。
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