CN116926169B - 一种结合dna滚环扩增技术的比色液晶微滴的生物传感器及传感系统 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种基于液晶微滴的生物传感器及生物传感系统。本发明基于液晶分子、表面活性剂的自组装过程将信号分子如酶、染料包裹在所形成的液晶微滴中，结合离子型表面活性剂之间存在的静电作用，扰动液晶微液滴稳定性，可释放出液滴中的信号分子。本发明还提供一种目标物与适体特异性结合引发DNA原位滚环扩增反应的生物传感系统。通过核酸扩增反应实现目标物信号放大，利用DNA、离子型表面活性剂、液晶三者之间的结合关系以及辣根过氧化酶对3,3',5,5'‑四甲基联苯胺显色剂的显色反应，构建了灵敏度高、特异性良好的液晶微滴比色检测方法。

Description

一种结合DNA滚环扩增技术的比色液晶微滴的生物传感器及 传感系统

技术领域

本发明属于液晶传感器技术领域，具体涉及一种基于液晶微滴的生物传感器及基于该传感器的酶催化显色检测方法，还提供了一种基于适配体特异性识别及DNA滚环扩增技术的生物传感系统及检测方法。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

液晶生物传感器是一种前沿的生物传感技术，其具有构造简单、成本低、能耗低、无需标记、样品用量少、灵敏度高等优点，在生命科学、临床医学和食品安全领域展现了广阔的应用前景，逐渐引起国内外研究者的广泛关注。液晶生物传感器在小分子物质如葡萄糖、蛋白质、核酸等生物分子检测中的应用愈加广泛，具有广阔的市场化前景。液晶界面的外部刺激会引起液晶取向的变化，这些变化可以被放大并转换成特定的光学信号输出，利用这种变化可以传导信息，从而构建液晶生物传感器。在已有的液晶生物传感器中，其检测原理主要是依赖于偏光显微镜获取不同排列取向的液晶的光学图像，并对图像进行分析。

由油、水、表面活性剂组成的微液滴具有特殊的物理化学特性，如制备简单、热力学稳定等特点。刺激响应型的微液滴预先将信号分子包覆，在外界化学或物理刺激下，释放信号分子，能够实现快速化检测。当水作为客体引入向列相液晶时会形成油包水乳液。由于液晶相之间的界面相互作用可以阻止水相的接触，从而形成稳定的液晶微滴。除此之外，表面活性剂可以影响液晶微滴的界面张力，从而使得体系内信号分子释放。因此，基于液晶微滴平台开发可视化检测方法对于实现分析物快速检测有重要的研究意义。

滚环扩增技术是一种常见的等温核酸扩增技术，可以将与挂锁DNA互补的DNA或RNA短链扩增为成千上万碱基对的长链，此长链包含成百上千个重复的模板互补片段。滚环扩增技术现在广泛用于目标物的识别和捕获，具有较高的检测灵敏度和特异性。适配体是人工合成的核酸分子，可以和目标物高特异性和高亲和性结合，具有合成简单、成本低、特异性高的优点。目标物与其相应的适配体特异性识别后可以使适配体与其互补DNA分离，继而发生原位滚环扩增反应。基于这一策略，适配体已被应用于各种领域及各种目标物的检测，例如酶、蛋白质和小分子等。

发明人发现：液晶微滴作为生物传感平台的研究应用尚未被开发，并且已有研究表明一系列的外界刺激可以触发包裹在液晶微滴中的信号分子的释放，从而实现比色检测。本发明可以结合滚环扩增技术提供一种通用的高灵敏检测方法。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种基于液晶微滴平台构建生物传感器的方法。该方法可在液晶微滴形成过程中将酶等信号分子包裹在微液滴里面。再利用离子型表面活性剂与微液滴表面的静电作用，释放出微液滴中的信号分子酶，继而发生酶催化显色反应实现比色检测。

基于上述技术效果，本发明提供以下技术方案：

本发明的第一个方面，提供一种基于液晶微滴的生物传感器，将具有催化功能的酶包覆于含有表面活性剂的液晶微滴中，再引入相反电荷的表面活性剂，通过静电作用引起两相界面表面张力的变化，使得微液滴中信号分子释放，进而引发显色反应实现比色检测。

进一步的，本发明以辣根过氧化物酶(HRP)为信号分子，将包覆了HRP的液晶微滴对CTAB的响应进行了研究，并对界面电荷相互作用下液晶微滴释放的性能进行了研究，证实了上述基于界面变化释放酶的传感器是可行的，这种基于比色的方式获得检测结果的检测方法可以大大简化信号的检测步骤。

进一步的，本发明提供了基于上述生物传感器的检测方法。

另外，为了获得一种具有良好靶向性和检测目标的检测平台，本发明将上述基于液晶微滴的生物传感器与适体识别及滚环扩增进行了结合，因此，本发明第三方面，提供一种基于适配体特异性识别的生物传感系统，所述生物传感系统中包括第一方面所述基于液晶微滴的生物传感器，还包括核酸产物扩增模块；

所述核酸产物扩增模块中包括一种预组装磁珠，所述磁珠负载引物及适配体的杂交链；另外，所述核酸产物扩增模块还具有挂锁DNA、DNA连接酶、DNA聚合酶及核酸底物。

本发明通过核酸扩增反应将目标物的信号放大，利用DNA、离子型表面活性剂、液晶三者之间的结合关系以及辣根过氧化酶对TMB的显色反应，构建了灵敏度高、特异性良好的液晶微滴比色传感平台。基于上述生物传感系统的检测目标可以推广到各种已知适配体的目标物检测。

进一步的，本发明还提供了基于所述生物传感系统的检测方法。

以上一个或多个技术方案的有益效果是：

1、本发明的一个实施方式中，提供一种结合液晶分散的微液滴刺激响应进行信号检测的生物传感器，基于上述传感器，所通过光信号检测即可获得检测结果，基于酶标仪等光信号检测工具可以实现多个检测结果的同时检测，大大提高了检测效率。

2、基于上述液晶传感器，为了进一步提高特异性和检测灵敏度，本发明进一步引入了适体-目标物识别及滚环扩增；其中，适体-目标物识别具有良好的特异性、靶向误差小，所述滚环扩增反应，对反应信号进行放大，提高了灵敏度高；检测方法中涉及的辣根过氧化物酶、3,3',5,5'-四甲基联苯胺显色剂、液晶、表面活性剂等试剂，皆为市面商用试剂，且性质稳定、成本低、实用性强，易于推广。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1为含辣根过氧化物酶(HRP)的液晶分散的微滴的表征及其对CTAB的响应图片；

其中，图1(A)为偏光显微镜下微滴的形态；

图1(B)为微液滴的DLS测量；

图1(C)为该方法对不同浓度CTAB的响应照片；

图1(D)为反应溶液(C)对应的在450nm处的吸光强度。

图2为界面电荷相互作用下液晶微滴释放的表征数据图片；

为不同类型表面活性剂对液晶微液滴检测平台的响应，包括阳离子表面活性剂(CTAB和DTAB)、阴离子表面活性剂(SDS和SMP)和非离子表面活性剂(DGP和GML)；表面活性剂的浓度为0.1mM。

图3为实施例1中基于原位滚环扩增反应的液晶微滴比色传感平台检测黄曲霉素的示意图。

图4为实施例1中AFB1的测量浓度图；

其中，图4(A)为吸光度强度与AFB1浓度的相关性；附图:传感平台对不同浓度AFB1的响应照片(从左至右分别为0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12pg/mL)；

图4(B)为吸光度强度与AFB1浓度呈线性关系。

图5为罗丹明B释放到水相中的光信号图谱；

其中，图5(A)为荧光吸收图谱，图5(B)为吸光度图谱。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

术语说明：

室温：具有本领域技术人员公知的含义，一般是指25±2℃。

CTAB：十六烷基三甲基溴化铵CAS:57-09-0

SDS：十二烷基硫酸钠CAS：151-21-3

HRP：辣根过氧化物酶

TMB:3,3',5,5'-四甲基联苯胺盐酸盐CAS:64285-73-0

MBs：磁珠

AFB1：黄曲霉素

本发明第一方面，提供一种基于液晶微滴的生物传感器，所述生物传感器中至少具有液晶分散体系及表面活性剂B，所述液晶分散体系中含有液晶微滴，所述液晶微滴包裹酶及表面活性剂A，并且表面活性剂A和表面活性剂B为相反离子型的表面活性剂。

本发明第一方面提供的生物传感器，利用液晶微滴中的表面活性剂A与体系中表面活性剂B的相反电荷，通过静电作用引起两相界面表面张力的变化，使得液晶微滴中信号分子释放，进而引发显色反应实现比色检测。

上述方案中，所述表面活性及A及表面活性剂B为一对相反离子型的表面活性剂，即其中一个为阳离子表面活性剂，另一个为阴离子表面活性剂；其中，所述阳离子表面活性剂为包括但不限于十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、十八烷基三甲基溴铵(OTAB)、十二烷基三甲基溴化铵(DTAB)中的一种；所述阴离子表面活性剂为包括但不限于十二烷基硫酸钠(SDS)、偏磷酸钠(SMP)中的一种。

上述优选的具体方案中的一种具体的实施方式中，所述表面活性剂A为SDS，表面活性剂B为CTAB；

又一种实施方式中，所述表面活性剂A为SMP，所述表面活性剂B为CTAB；

又一种实施方式中，所述表面活性剂A为SDS，所述表面活性剂B为DTAB。

上述第一方面所述的生物传感器，所述液晶微滴中包裹的酶为检测反应中的催化酶，为包括但不限于辣根过氧化物酶(HRP)、碱式磷酸酶(AP)、β-半乳糖苷酶(β-Gal)中的一种。

另外，上述传感器中所述液晶分散体系及液晶微滴中的液晶不做特殊的限制性规定，可用5CB、E7等。

优选的方案中，所述液晶微滴的制备方式如下：加热液晶至相变温度范围内，将表面活性剂A及酶混合后滴入上述温度范围的液晶中，通过涡旋及超声得到分散在液晶分散体系中的液晶微滴。

另外优选的实施方式中，所述表面活性剂B中具有酶的催化底物，或所述液晶分散体系中还具有染料或显色剂；所述酶在表面活性剂B的作用下释放，将催化底物催化成显色底物，所述显色底物在显色剂的作用下改变液晶分散体系的吸光度。

上述第一方面一种具体的实施方式中，所述酶为HRP、所述表面活性剂A为SDS，所述表面活性剂B为CTAB，所述显色剂为3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)，所述液晶为5CB；所述液晶微滴的制备方法如下：将液晶加热至相变温度以上，将HRP溶解在15～20mM浓度的SDS溶液中，制得终浓度为0.008～0.012mg/mL的HRP溶液；将所述HRP溶液加入液晶中涡旋2～5min，超声8～12min，得到分散在液相中的液晶微滴，所述HRP溶液与液晶的体积比为1：8～10。

本发明第二方面，提供一种酶催化反应的检测方法，所述方法基于第一方面所述基于液晶微滴的生物传感器实现，所述检测方法包括以下步骤：将催化反应的酶包裹在液晶微滴中，向液体分散体系内加入表面活性剂B触发酶的释放，并对液晶分散体系的吸光度进行检测。

本发明第三方面，提供一种基于适配体特异性识别的生物传感系统，所述生物传感系统中包括第一方面所述基于液晶微滴的生物传感器，还包括核酸产物扩增模块；

所述核酸产物扩增模块中包括一种预组装磁珠，所述磁珠负载引物及适配体的杂交链；另外，所述核酸产物扩增模块还具有挂锁DNA、DNA连接酶、DNA聚合酶及核酸底物。

进一步的，所述磁珠为链霉亲和素功能化的磁珠，所述预组装磁珠的制备方式如下：

将引物与链霉亲和素功能化的磁珠在30～40℃条件下共同孵育18～22min；通过磁选分离孵育后的磁珠再加入适配体溶液中孵育35～45min中得到所述预组装磁珠。

上述生物传感系统中，所述适配体、引物及挂锁DNA的序列依据检测目标而设计，本发明提供的一种具体的实施方式中，所述检测目标为黄曲霉素，在应用于黄曲霉素检测的生物传感系统中，所述适配体、引物及挂锁DNA的序列如下表所示：

表1

应当说明的是，上述表1中所述引物序列至少包括A6-TCA CAC TGT GGG CCT AGGACG C部分，上述引物序列的5’端或3’端还可以连接其他核苷酸序列，所述连接的其他核苷酸序列不与适配体、挂锁DNA、检测干扰物质适配，连接后的引物还可作为RCA扩增模板。

本发明第四方面，提供一种基于适配体特异性识别的检测方法，所述检测方法基于第三方面所述传感系统实现，包括如下步骤：将检测目标与预组装磁珠混合孵育一段时候，并通过磁分离；向分离后的磁珠中加入挂锁DNA及连接酶孵育一段时间后继续加入DNA聚合酶及核酸底物孵育一段时间获得核酸扩增产物，将所述核酸扩增产物与表面活性剂B混合后加入液晶分散体系中，并对液晶分散体系的吸光度进行检测。

本发明提供的一种具体的实施方式中，所述目标物为黄曲霉素，具体的，本发明还提供一种黄曲霉素的检测方法，所述检测方法中适配体、引物及挂锁DNA的序列如表1所示，具体的检测步骤如下：将待测物与预组装的磁珠混合孵育25～35min，通过磁选分离磁珠并清洗，向清洗后的磁珠中加入去离子水、挂锁DNA、连接酶反应缓冲液、T4 DNA连接酶，15～17℃孵育0.5～1.5h后收集磁珠；继续加入水、DNA聚合酶反应缓冲液、dNTPs和DNA聚合酶，在28～32℃下孵育70～90min；升温至60～70℃反应8～12min终止核酸物质扩增，将反应体系中的核酸扩增产物与CTAB混合加入液晶微滴溶液中，释放出的HRP将TMB氧化，发生显色反应，使用酶标仪在450nm处测定吸光度，确定目标物浓度。

进一步的，所述CTAB溶液适宜浓度在10～100μM。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。以下实施例中的液晶，选购自安耐吉化学技术(上海)有限公司。

实施例1

本实施例中，提供一种用于黄曲霉素(AFB1)检测的生物传感系统，所述生物传感系统的检测原理示意图如图4所示。

所述检测方法包括以下几部分：

所用液晶微滴采用以下方法制备：

A.将液晶加热至相变温度以上。

B.将HRP溶解在18mM浓度的SDS溶液中，制得终浓度为0.01mg/mL的HRP溶液。

C.将10μL上述的混合液滴入90μL的液晶中，涡旋3min，超声10min，得到分散在液相中的液晶微滴。

上述传感器对黄曲霉素的检测实例如下：

A、0.1mg/mL链霉亲和素功能化的磁珠用PBS缓冲液(10mM,pH 7.4)清洗三次。

B、0.12μM引物与A.的磁珠在37℃下孵育20min，并通过磁选分离预组装的磁珠。

C、将B得到的磁珠与黄曲霉素适配体的混合液孵育30分钟得到杂交产物。磁力架将磁珠分离，并用PBS溶液清洗3次，去除游离适配体和引物，从而得到功能化的磁珠。

D、将待测黄曲霉素与C的适体-引物杂交产物孵育30min，用上述清洗方法将磁珠清洗三次，以此去除适配体与目标物的复合物。

E、在D中加入15μL去离子水、2μL挂锁DNA、2μL10×T4连接酶反应缓冲液，T4 DNA连接酶1μL，在16℃孵育1h，用上述方法清洗。

F、在E中加入30.4μL的超纯水、4μL的10×phi29 DNA聚合酶反应缓冲液、5μL的核苷酸溶液和0.6μL的phi29 DNA聚合酶，在30℃下孵育80min。

G、将F的反应体系在65℃下孵育10min，终止RCA反应。

将得到的G的产物与CTAB混合加入液晶微滴中，进行显色反应，测定吸光度，确定目标物浓度。

图4为AFB1的该方法下的可测量浓度范围。从图4中可以看出，基于实施例1中的检测方法，可以实现pg级别的黄曲霉素含量检测，证明该方法具有良好的检测灵敏度。

上述检测方法中所涉及到的黄曲霉素的寡核酸链如下：

表1

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东省分析测试中心

<120> 一种结合DNA滚环扩增技术的比色液晶微滴的生物传感器及传感系统

<130> 2010

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

aaaaaatcac actgtgggcc taggacgc 28

<210> 2

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gttgggcacg tgttgtctct ctgtgtctcg tgcccttcgc taggcccaca 50

<210> 3

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ccacagtgtg actaggccca cataatctag gcccacagcg tcctaggc 48

Claims (9)

1.一种基于适配体特异性识别的生物传感器，其特征在于，包括基于液晶微滴的生物传感器，还包括核酸产物扩增模块；

所述基于液晶微滴的生物传感器中至少具有液晶分散体系及表面活性剂B，所述液晶分散体系中含有液晶微滴，所述液晶微滴包裹酶及表面活性剂A，并且表面活性剂A和表面活性剂B为相反离子型的表面活性剂；

所述核酸产物扩增模块中包括一种预组装磁珠，所述磁珠负载引物及适配体的杂交链；另外，所述核酸产物扩增模块还具有挂锁DNA、DNA连接酶、DNA聚合酶及核酸底物；

所述表面活性剂A为SDS，表面活性剂B为CTAB；

或，所述表面活性剂A为SMP，所述表面活性剂B为CTAB；

或，所述表面活性剂A为SDS，所述表面活性剂B为DTAB；

所述液晶微滴中包裹的酶为检测反应中的催化酶，选自辣根过氧化物酶。

2.如权利要求1所述基于适配体特异性识别的生物传感器，其特征在于，所述液晶分散体系及液晶微滴中的液晶选自5CB、E7中的一种或其组合。

3.如权利要求1所述基于适配体特异性识别的生物传感器，其特征在于，所述液晶微滴的制备方式如下：加热液晶至相变温度范围内，将表面活性剂A及酶混合后滴入上述温度范围的液晶中，通过涡旋及超声得到分散在液晶分散体系中的液晶微滴；

或，所述表面活性剂B中具有酶的催化底物，或所述液晶分散体系中还具有染料或显色剂；所述酶在表面活性剂B的作用下释放，将催化底物催化成显色底物，所述显色底物在显色剂的作用下改变液晶分散体系的吸光度。

4.如权利要求1所述基于适配体特异性识别的生物传感器，其特征在于，所述磁珠为链霉亲和素功能化的磁珠，所述预组装磁珠的制备方式如下：

将引物与链霉亲和素功能化的磁珠在30～40℃条件下共同孵育18～22min；通过磁选分离孵育后的磁珠再加入适配体溶液中孵育35～45min中得到所述预组装磁珠。

5.如权利要求1所述基于适配体特异性识别的生物传感器，其特征在于，所述适配体、引物及挂锁DNA的序列依据检测目标而设计，检测目标为黄曲霉素时，所述适配体、引物及挂锁DNA的序列如下：

引物：Biotin-A₆-TCA CAC TGT GGG CCT AGG ACG C；

适配体：GTT GGG CAC GTG TTG TCT CTC TGT GTC TCG TGC CCT TCG CTA GGC CCACA；

挂锁DNA：Phosphate-CCA CAG TGT GAC TAG GCC CAC ATA ATC TAG GCC CAC AGC GTCCTA GGC。

6.如权利要求1-5任一项所述基于适配体特异性识别的生物传感器，其特征在于，所述酶为HRP、所述表面活性剂A为SDS，所述表面活性剂B为CTAB，所述显色剂为3,3',5,5'-四甲基联苯胺，所述液晶为5CB；

所述液晶微滴的制备方法如下：将液晶加热至相变温度以上，将HRP溶解在15～20mM浓度的SDS溶液中，制得终浓度为0.008～0.012mg/mL的HRP溶液；将所述HRP溶液加入液晶中涡旋2～5min，超声8～12min，得到分散在液相中的液晶微滴，所述HRP溶液与液晶的体积比为1：8～10。

7.一种基于适配体特异性识别的检测方法，其特征在于，所述检测方法基于权利要求1所述生物传感器实现，包括如下步骤：将检测目标与预组装磁珠混合孵育一段时候，并通过磁分离；向分离后的磁珠中加入挂锁DNA及连接酶孵育一段时间后继续加入DNA聚合酶及核酸底物孵育一段时间获得核酸扩增产物，将所述核酸扩增产物与表面活性剂B混合后加入液晶分散体系中，并对液晶分散体系的吸光度进行检测。

8.如权利要求7所述基于适配体特异性识别的检测方法，其特征在于，所述检测方法为一种黄曲霉素的检测方法，具体的检测步骤如下：将待测物与预组装的磁珠混合孵育25～35min，通过磁选分离磁珠并清洗，向清洗后的磁珠中加入去离子水、挂锁DNA、连接酶反应缓冲液、T4 DNA连接酶，15～17℃孵育0.5～1.5h后收集磁珠；经过3次水洗-磁分离过程后，继续加入水、DNA聚合酶反应缓冲液、dNTPs和DNA聚合酶的混合液，在28～32℃下孵育70～90min；升温至60～70℃反应8～12min终止核酸物质扩增，将反应体系中的核酸扩增产物与CTAB混合加入液晶微滴溶液中，释放出的HRP将TMB氧化，发生显色反应，使用酶标仪在450nm处测定吸光度，确定目标物浓度。

9.如权利要求8所述的基于适配体特异性识别的检测方法，其特征在于，所述CTAB的溶液适宜浓度在10～200μM。