KR102003589B1 - 생화학 분자 검출센서 및 다파장 형광을 이용한 생화학 분자 검출방법 - Google Patents

생화학 분자 검출센서 및 다파장 형광을 이용한 생화학 분자 검출방법 Download PDF

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Abstract

생화학 분자 검출센서가 개시된다. 생화학 분자 검출센서는 기판; 상기 기판에 화학적으로 결합되고, 생화학 분자와 선택적으로 결합할 수 있으며, 제1 파장의 형광을 발생하는 형광 염색약이 인터칼레이팅되어 있는 하나 이상의 이중나선 DNA를 포함하는 제1 압타머 복합체; 및 상기 생화학 분자와 선택적으로 결합될 수 있고, 상기 제1 파장과 다른 제2 파장의 형광을 발생하는 하나 이상의 제2 압타머 복합체를 포함하고, 상기 제1 압타머 복합체 및 상기 제2 압타머 복합체와 반응하는 상기 생화학 분자의 양이 증가할수록 상기 제1 파장의 형광은 줄어들고, 상기 제2 파장의 형광은 증가할 수 있다.

Description

생화학 분자 검출센서 및 다파장 형광을 이용한 생화학 분자 검출방법{BID MOLECULE DETECTION SENSOR AND METHOD FOR DETECTING SPECIFIC MOLECULE USING MULTI-WAVELENGTH FLUORESCENCE}
본 발명은 생화학 분자를 검출할 수 있고 미지의 생화학 분자의 농도를 정량할 수 있는 생화학 분자 검출센서에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 미지의 생화학 분자의 농도를 정량할 수 있고, 생화학 분자의 검출결과의 정확도를 향상시킬 수 있는 생화학 분자 검출센서 및 다파장 형광을 이용한 생화학 분자 검출방법에 관한 것이다.
종래의 바이오분자 형광 검출 기술은 효소결합면역흡착측정법(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)이나 효소결합압타머측정법(Enzyme-Linked Aptamer Assay)이 표준적으로 사용되었다. 종래의 형광 검출 기술은 한 파장의 형광체를 바이오리셉터에 표지한 후 타겟 바이오분자가 포함된 샘플을 첨가함에 따라 한 파장의 형광 세기만을 측정하여 분석하는 방법으로서, 표지된 형광체와 유사한 파장의 배경 잡음이나 타겟 바이오분자 외에 다른 분자가 비특이적으로 결합됨으로써 발생하는 오류에 따라 검출 정확도가 낮아지는 문제점이 있다.
또한, 종래 기술은 한 파장의 형광체가 표지된 바이오리셉터를 타겟 바이오분자와 결합시키는 여러 단계의 과정에서 매 단계마다 철저한 세척이 동반되더라도 일부 잔류하는 중간 바이오리셉터들로 인해서 검출 결과의 오류가 발생하고 유사 파장대의 배경잡음으로 인한 검출 결과의 오류 발생으로 검출의 정확도가 떨어진다는 문제점이 있다.
이와 같은 문제점을 해결하기 위해 타겟 바이오분자와 바이오리셉터 간의 직접적 작용을 통한 검출법에 대한 보고들이 발표되어왔지만 이들 또한 한 플랫폼 내에서 비특이적 결합 및 배경잡음에 기인하는 오류를 감소시킬 수 없어 검출의 정확도 향상이 어렵다는 문제점이 있다.
본 발명이 해결하고자 하는 기술적 과제는, 미지의 생화학 분자의 농도를 정량할 수 있고, 생화학 분자의 검출결과의 정확도를 향상시킬 수 있는 생화학 분자 검출센서 및 다파장 형광을 이용한 생화학 분자 검출방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 실시예에 따른 생화학 분자 검출 센서는, 기판; 상기 기판에 화학적으로 결합되고, 생화학 분자와 선택적으로 결합할 수 있으며, 제1 파장의 형광을 발생하는 형광 염색약이 인터칼레이팅되어 있는 하나 이상의 이중나선 DNA를 포함하는 제1 압타머 복합체; 및 상기 생화학 분자와 선택적으로 결합될 수 있고, 상기 제1 파장과 다른 제2 파장의 형광을 발생하는 하나 이상의 제2 압타머 복합체를 포함하고, 상기 제1 압타머 복합체 및 상기 제2 압타머 복합체와 반응하는 상기 생화학 분자의 양에 따라 상기 제1 파장의 형광 및 상기 제2 파장의 형광이 변경된다.
상기 이중나선 DNA는, 상기 생화학 분자와 선택적으로 결합할 수 있는 제1 염기 서열을 가지는 제1 핵산 가닥; 및 상기 제1 핵산 가닥과 상기 제1 염기 서열에 대해 상보적으로 결합하는 제2 염기 서열을 가지는 제2 핵산 가닥을 포함하고, 상기 형광 염색약은 상기 제1 핵산가닥과 상기 제2 핵산가닥 사이에 인터칼레이팅(intercalating)된다.
상기 형광 염색약은, 사이버 그린 Ⅰ(SYBR Green Ⅰ, SG), 티아졸 오렌지(Thiazole Orange) 및 에디듐 브로마이드(Ethidium Bromide) 중 하나 이상을 포함한다.
상기 제2 압타머 복합체는, 상기 생화학 분자와 선택적으로 결합할 수 있는 상기 제1 염기 서열을 가지는 제3 핵산 가닥; 및 상기 제3 핵산 가닥과 결합되어 있고 상기 제1 파장과 다른 상기 제2 파장의 형광을 발생하는 형광체를 포함한다.
상기 제1 핵산 가닥은 상기 기판과 화학적으로 결합하는 아민(Amine)기, 카르복실(Carboxyl)기, 말레이미드(Maleimide)기 또는 티올(Thiol)기로 표지되어 있다.
상기 형광체는, 양자점, 형광 염색약 및 금속 나노클러스터 중 하나 이상을 포함한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 다파장 형광을 이용한 생화학 분자 검출방법은, a) 기판에 화학적으로 결합되어 있고 생화학 분자와 선택적으로 결합할 수 있으며 제1 파장의 형광을 발생하는 형광 염색약이 인터칼레이팅되어 있는 하나 이상의 이중나선 DNA를 포함하는 제1 압타머 복합체 상에 상기 생화학 분자 및 상기 생화학 분자와 선택적으로 결합될 수 있고 상기 제1 파장과 다른 제2 파장의 형광을 발생하는 하나 이상의 제2 압타머 복합체를 포함하는 시약을 도포하는 단계; b) 상기 생화학 분자와 결합되지 않은 상기 제2 압타머 복합체를 제거하는 단계; 및 c) 상기 제1 파장의 형광의 세기와 상기 제2 파장의 형광의 세기를 측정하는 단계를 포함한다.
상기 이중나선 DNA는, 상기 생화학 분자와 선택적으로 결합할 수 있는 제1 염기 서열을 가지는 제1 핵산 가닥; 및 상기 제1 핵산 가닥과 상기 제1 염기 서열에 대해 상보적으로 결합하는 제2 염기 서열 영역을 가지는 제2 핵산 가닥을 포함하고, 상기 형광 염색약은 상기 제1 핵산가닥과 상기 제2 핵산가닥 사이에 인터칼레이팅(intercalating)된다.
상기 제2 압타머 복합체는, 상기 생화학 분자와 선택적으로 결합할 수 있는 상기 제1 염기 서열을 가지는 제3 핵산 가닥; 및 상기 제3 핵산 가닥과 결합되어 있고 상기 제1 파장과 다른 상기 제2 파장의 형광을 발생하는 형광체를 포함한다.
상기 생화학 분자의 농도를 달리하여 상기 a) 내지 c) 단계를 반복적으로 수행하는 단계; 및 상기 생화학 분자의 농도에 따른 상기 제1 파장의 형광의 세기와 상기 제2 파장의 형광의 세기에 대한 분석함수를 도출하는 단계를 더 포함한다.
상기 제1 형광의 세기의 증감 여부 및 상기 제2 형광의 발생 여부를 이용하여 상기 생화학 분자를 검출하는 단계를 더 포함한다.
상기 제1 형광의 세기의 증감 여부 및 상기 제2 형광의 증감 여부를 이용하여 상기 생화학 분자를 검출하는 단계를 더 포함한다.
상기 c) 단계는 카메라를 이용한 이미지 촬영에 의해 수행될 수 있다.
상기와 같은 본 발명은 미지의 생화학 분자의 농도를 정량할 수 있다.
본 발명은 두 가지 파장의 형광을 이용하여 생화학 분자를 검출함으로써 특정 생화학 분자의 검출 결과의 정확도 및 신뢰성을 향상시킬 수 있다.
도 1은 본 발명의 실시예에 따른 생화학 분자 검출센서의 개념도이다.
도 2는 본 발명의 실시예에 따른 생화학 분자 검출센서에 생화학 분자와 제2 압타머 복합체를 투입한 후의 반응 상태를 설명하기 위한 개념도이다.
도 3은 생화학 분자의 농도에 따른 형광 염색약의 형광 세기를 나타낸 그래프이다.
도 4는 생화학 분자의 농도에 따른 형광체의 형광 세기를 나타낸 그래프이다.
도 5는 파장에 대한 형광 염색약과 형광체의 형광 세기를 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발명의 실시예에 따른 다파장 형광을 이용한 생화학 분자 검출방법의 흐름도이다.
도 7은 본 발명의 다른 실시예에 따른 다파장 형광을 이용한 생화학 분자 검출방법의 흐름도이다.
도 8a는 ATP를 생성하는 세포에 투입되는 약물(5-FU)의 농도에 따른 ATP의 농도와 사이버 그린Ⅰ의 형광 세기 비율을 측정한 그래프이다.
도 8b는 ATP를 생성하는 세포에 투입되는 약물(5-FU)의 농도에 따른 ATP의 농도와 은 나노클러스터의 형광 세기 비율을 측정한 그래프이다.
도 8c는 투입되는 약물(5-FU)의 농도에 따른 은 나노클러스터의 형광 세기 비율에 대한 사이버 그린Ⅰ의 형광 세기 비율의 비를 측정한 그래프이다.
도 9a는 ATP를 생성하는 세포에 투입되는 약물(Gemcitabin)의 농도에 따른 ATP의 농도와 사이버 그린Ⅰ의 형광 세기 비율을 측정한 그래프이다.
도 9b는 ATP를 생성하는 세포에 투입되는 약물(Gemcitabin)의 농도에 따른 ATP의 농도와 은 나노클러스터의 형광 세기 비율을 측정한 그래프이다.
도 9c는 투입되는 약물(Gemcitabin)의 농도에 따른 은 나노클러스터의 형광 세기 비율에 대한 사이버 그린Ⅰ의 형광 세기 비율의 비를 측정한 그래프이다.
도 10은 본 발명에 따른 생화학 분자 검출센서 및 스마트폰 카메라를 이용하여 두 가지 형광 파장대서 타겟 바이오 분자의 농도에 따른 정량화 데이터를 제작한 것이다.
본 발명은 다양한 변경을 가할 수 있고 여러가지 실시예를 가질 수 있는바, 특정 실시예들을 도면에 예시하고 상세한 설명에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명에 따른 바람직한 일실시예를 상세히 설명한다. 도면상에서 동일 부호는 동일한 요소를 지칭한다.
도 1은 본 발명의 실시예에 따른 생화학 분자 검출센서의 개념도이고, 도 2는 본 발명의 실시예에 따른 생화학 분자 검출센서에 생화학 분자와 제2 압타머 복합체 투입한 후의 반응 상태를 설명하기 위한 개념도이고, 도 3은 생화학 분자의 농도에 따른 형광 염색약의 형광 세기를 나타낸 그래프이고, 도 4는 생화학 분자의 농도에 따른 형광체의 형광 세기를 나타낸 그래프이고, 도 5는 파장에 대한 형광 염색약과 형광체의 형광 세기를 나타낸 그래프이다.
도 1을 참조하면 본 발명의 실시예에 따른 생화학 분자 검출센서(100)는 기판(10), 하나 이상의 이중나선 DNA를 포함하는 제1 압타머 복합체 및 제2 압타머 복합체를 포함할 수 있다.
기판(10)은 유리, 폴리머 또는 종이 등으로 이루어질 수 있고, 기판(10)의 표면은 기능화될 수 있다. 일 예로 기판(10) 표면은 2wt%의 3-아미노프로필트리에톡시실란(aminopropyltriethoxysilane, APTES) 용액과 2wt%의 글루타르알데히드 용액을 (Glutaraldehyde) 용액을 차례로 이용하여 기능화될 수 있다. 기판(10) 표면의 기능화는 기판(10)과 제1 압타머 복합체의 이중나선 DNA간의 화학적 결합이 이루어지도록 하기 위함이다. 이중나선 DNA는 기판(10) 상에 고정되고, 생화학 분자(70)와 선택적으로 결합할 수 있다.
하나 이상의 제1 압타머 복합체는 기판(10)에 화학적으로 결합되고, 생화학 분자와 선택적으로 결합할 수 있다. 이를 위하여 제1 압타머 복합체는 이중나선 DNA를 포함할 수 있다. 이중나선 DNA는 제1 핵산 가닥(20) 및 제2 핵산 가닥(30)을 포함할 수 있고, 이중나선 DNA에는 제1 파장의 형광을 발생하는 형광 염색약(40)이 인터칼레이팅(intercalating)되어 있다.
제1 핵산 가닥(20)은 생화학 분자(70)와 선택적으로 결합할 수 있는 제1 염기 서열을 가질 수 있다. 제2 핵산 가닥(30)은 제1 핵산 가닥(20)과 제1 염기 서열에 대해 상보적이고 제1 염기 서열과 상보 가닥(complementary strand)을 형성하는 제2 염기 서열을 가질 수 있다. 생화학 분자(70)로는 ATP 분자가 사용될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, 생화학 분자(70) 변경에 따라 제1 염기 서열은 변경된 생화학 분자와 결합될 수 있도록 변경될 수 있다.
제1 핵산 가닥(20)은 기능기 예를 들면, 아민(Amine)기, 카르복실(Carboxyl)기, 말레이미드(Maleimide)기 또는 티올(Thiol)기로 표지되어 있을 수 있으며, 제1 핵산 가닥(20)을 기능기로 표지하는 것은 기능화된 기판(10)과 화학적 결합이 이루어지도록 하기 위함이다.
제1 핵산 가닥(20)과 제2 핵산 가닥(30)이 혼성화 결합됨으로써 이중나선 DNA가 형성될 수 있고, 동일한 몰농도(예를 들면 1uM)의 제1 핵산 가닥(20)과 제2 핵산 가닥(30)을 혼합하고, 약 93℃에서 약 3분간 중탕한 뒤 약 50분 동안 상온에서 냉각함으로써 제1 핵산 가닥(20)과 제2 핵산 가닥(30)이 혼성화 결합된 이중나선 DNA(20, 30)을 형성할 수 있다.
형광 염색약(40)은 제1 파장의 형광을 발생할 수 있고, 제1 핵산 가닥(20)과 제2 핵산 가닥(30) 사이에 인터칼레이팅될 수 있다. 일 예로 형광 염색약(40)에 이중나선 DNA를 노출시킴으로써 이중나선 DNA에 형광 염색약(40)이 인터칼레이팅될 수 있다. 형광 염색약(40)으로는 사이버 그린 Ⅰ(Sybr Green Ⅰ, SG), 티아졸 오렌지(Thiazole Orange) 및 에디듐 브로마이드(Ethidium Bromide) 중 하나 이상이 사용될 수 있다. 형광 염색약(40)이 사이버 그린 Ⅰ인 경우에는 상기 제1 파장은 약 520nm일 수 있다. 형광 염색약(40)은 이중나선 DNA에 인터칼레이팅되어 있는 경우에는 형광을 발생하지만, 형광 염색약(40)이 이중나선 DNA로부터 분리되는 경우에는 형광 염색약(40)에서 형광이 발생하지 않는다.
이중나선 DNA에 생화학 분자(70)가 결합되는 경우 형광 염색약(40)은 이중 나선 DNA로부터 분리되어 이중나선 DNA에서 발생하는 형광의 세기가 감소될 수 있다. 이는 이중나선 DNA에 인터칼레이팅되어 있던 형광 염색약(40)이 분리되면 이중나선 DNA에서 형광을 발생하는 형광 염색약(40)의 수가 줄어들어 발생하는 형광의 세기도 감소하기 때문이다. 형광 염색약(40)으로부터 발생하는 형광의 세기의 감소가 확인되면 생화학 분자가 검출되었다고 판단할 수 있다.
하나 이상의 제2 압타머 복합체는 생화학 분자와 선택적으로 결합될 수 있고, 상기 제1 파장과 다른 제2 파장의 형광을 발생할 수 있다. 제2 압타머 복합체는 제3 핵산 가닥(50) 및 형광체(60)를 포함할 수 있다.
도 2를 참조하면, 제3 핵산 가닥(50)은 생화학 분자(70)와 선택적으로 결합할 수 있는 상기 제1 염기 서열을 가질 수 있다.
형광체(60)는 제3 핵산 가닥(50)과 결합되어 있고, 형광 염색약(40)에서 발생하는 형광의 제1 파장과는 다른 제2 파장의 형광을 발생할 수 있다. 일 예로 형광체(60)는 양자점, 형광 염색약 및 금속 나노클러스터 중 하나 이상을 포함할 수 있으나 형광을 발생하는 물질은 형광체(60)로 사용될 수 있다. 일 예로 금속 나노클러스터로는 은 나노클러스터(Ag nanocluster)가 사용될 수 있다. 은 나노클러스터에서 발생하는 형광의 파장은 약 650nm일 수 있다. 이러한 복합체는 생화학 분자(70)와 함께 생화학 분자 검출센서(100)에 투입될 수 있다.
복합체가 생화학 분자(70)와 함께 생화학 분자 검출센서(100)에 투입되는 경우, 생화학 분자(70)는 제1 핵산 가닥(20)과 결합되게 되고, 제1 핵산 가닥(20)과 혼성화 결합을 이루던 제2 핵산 가닥(30)이 분리되게 된다. 또한, 생화학 분자(70)는 제3 핵산 가닥(50)과 결합하게 되어 제1 핵산 가닥(20), 생화학 분자(70), 제3 핵산 가닥(50) 및 형광체(60)의 연결구조가 형성되게 된다. 이와 같은 반응에 의하여 형광 염색약(40)으로부터 발생하는 형광의 세기는 줄어들고, 형광체(60)로부터 발생하는 형광이 검출될 수 있다. 따라서 형광 염색약(40)으로부터 발생하는 형광의 세기가 감소하고, 형광체(60)로부터 형광이 발생함이 검출되는 경우에는 생화학 분자가 검출되었다고 판단할 수 있다.
투입되는 생화학 분자(70)와 복합체의 농도는 증가될 수 있고, 투입되는 생화학 분자(70)의 농도와 복합체의 농도가 증가함에 따라 이중나선 DNA에서 발생하는 형광의 세기는 줄어들게 되며, 형광체(60)로부터 발생하는 형광의 세기는 증가되게 된다.
도 3 및 도 4를 참조하면, 생화학 분자의 농도가 증가할수록 형광 염색약(Sybr Green Ⅰ)의 형광 세기는 줄어들고, 형광체(Ag Nanocluster)의 형광 세기는 증가됨을 확인할 수 있다. 도 5를 참조하면, 생화학 분자의 농도가 증가할수록 약 520nm의 파장을 가지는 형광 염색약(Sybr Green Ⅰ, A)의 형광 세기는 줄어들고, 약 650nm의 파장을 가지는 형광체(Ag Nanocluster, B)의 형광 세기는 증가됨을 확인할 수 있다.
이와 같은 본 발명의 실시예에 따른 생화학 분자 검출센서(100)는 두 가지 파장의 형광을 이용하여 생화학 분자의 검출 여부를 확인할 수 있다. 또한, 본 발명의 실시예에 따른 하나의 형광 파장을 이용하여 생화학 분자의 검출여부를 판단하는 것에 비하여 두 가지 파장의 형광을 이용하기 때문에 생화학 분자의 검출 여부를 더욱 정확히 파악할 수 있으며, 이에 대하여는 아래에서 상세히 설명하기로 한다.
도 6은 본 발명의 실시예에 따른 다파장 형광을 이용한 생화학 분자 검출방법의 흐름도이다.
도 6을 참조하면, 본 발명의 실시예에 따른 다파장 형광을 이용한 생화학 분자 검출방법은 기판에 화학적으로 결합되어 있고 생화학 분자와 선택적으로 결합할 수 있으며 제1 파장의 형광을 발생하는 형광 염색약이 인터칼레이팅되어 있는 하나 이상의 이중나선 DNA를 포함하는 제1 압타머 복합체 상에 상기 생화학 분자 및 상기 생화학 분자와 선택적으로 결합될 수 있고 상기 제1 파장과 다른 제2 파장의 형광을 발생하는 하나 이상의 제2 압타머 복합체를 도포하는 단계(S100), 상기 생화학 분자와 결합되지 않은 상기 제2 압타머 복합체를 제거하는 단계(S200), 상기 제1 파장의 형광의 세기와 상기 제2 파장의 형광의 세기를 측정하는 단계(S300), 상기 생화학 분자의 농도를 달리하여 상기 S100 단계 내지 S300 단계를 반복적으로 수행하는 단계(S400) 및 상기 생화학 분자의 농도에 따른 상기 제1 파장의 형광의 세기와 상기 제2 파장의 형광의 세기에 대한 분석함수를 도출하는 단계(S500)을 포함할 수 있다.
다파장 형광을 이용하여 생화학 분자를 검출하기 위하여, 기판에 화학적으로 결합되어 있고 생화학 분자와 선택적으로 결합할 수 있으며 제1 파장의 형광을 발생하는 형광 염색약이 인터칼레이팅되어 있는 하나 이상의 이중나선 DNA를 포함하는 제1 압타머 복합체 상에 상기 생화학 분자 및 상기 생화학 분자와 선택적으로 결합될 수 있고 상기 제1 파장과 다른 제2 파장의 형광을 발생하는 하나 이상의 제2 압타머 복합체를 도포한다(S100). 일 예로 생화학 분자와 제2 압타머를 포함하는 시약을 통하여 도포될 수 있다. 여기서의 도포는 제1 압타머 복합체를 생화학 분자 및 제2 압타머 복합체에 노출시키거나 제1 압타머 복합체에 생화학 분자 및 제2 압타머 복합체를 투입시키는 것을 의미할 수 있다.
생화학 분자(70)와 제2 압타머 복합체를 투입하면 생화학 분자 검출센서(100)의 제1 핵산 가닥(20)에 생화학 분자(70)가 결합되게 되고 형광 염색약(40)이 생화학 분자 검출센서(100)의 이중나선 DNA로부터 분리되어 이중나선 DNA에서 발생하는 형광의 세기가 감소될 수 있다. 또한, 제1 핵산 가닥(20)에 생화학 분자(70)가 결합되는 경우에는 형광체(60)는 제1 핵산 가닥(20)과 연결될 수 있고, 형광체(60)로부터 형광이 발생될 수 있다. 하나 이상의 복합체의 농도는 생화학 분자와 충분히 반응이 일어날 수 있는 농도로 투입되는 것이 바람직하다.
생화학 분자 검출센서(100)의 제1 핵산 가닥(20), 생화학 분자(70) 및 복합체의 반응이 완료되면 상기 생화학 분자와 결합되지 않은 상기 제2 압타머 복합체를 제거한다(S200). 제거는 세척 과정을 통하여 수행될 수 있으며 세척은 이온수를 이용하여 수행될 수 있고, 세척을 통하여 반응하지 않고 남은 물질들을 깨끗히 씻어낼 수 있다.
생화학 분자와 결합되지 않은 제2 압타머 복합체가 제거되면, 생화학 분자 검출센서(100)의 제1 압타머 복합체에서 발생하는 제1 파장을 가지는 제1 형광의 세기와 제2 압타머 복합체에서 발생하는 상기 제1 파장과 다른 제2 파장을 가지는 제2 형광의 세기를 측정한다(S300).
본 발명의 실시예에 따른 다파장 형광을 이용한 생화학 분자 검출방법은 생화학 분자의 농도에 따른 정량화 분석함수를 도출하기 위하여, 생화학 분자의 농도를 달리하여 상기 S100 단계 내지 S300 단계를 반복적으로 수행할 수 있다(S400). 이와 같은 과정을 통하여 생화학 분자의 농도에 따른 제1 압타머 복합체에서 발생하는 제1 파장을 가지는 제1 형광의 세기에 대한 데이터와 생화학 분자의 농도에 따른 제2 압타머 복합체에서 발생하는 제2 파장을 가지는 제2 형광의 세기에 대한 정량화 분석함수를 도출이 가능하다. 도출된 정량화 분석함수에 따른 그래프는 각각 도 3 및 도 4에 도시되어 있다. 정량화 분석함수를 이용하는 경우에는 미지의 농도를 가지는 생화학 분자의 농도를 정량화 그래프에 매칭시킴으로써 생화학 분자의 농도를 파악할 수 있다. 일 예로 미지의 농도를 가지는 ATP 분자를 생화학 분자 검출센서(100)에 하나 이상의 복합체와 함께 투입하여 측정된 제1 형광의 세기를 ATP 분자의 농도에 따른 제1 형광의 세기에 대한 정량화 분석함수에 따른 그래프에 매칭시킴으로써 미지의 농도를 가지는 ATP 분자의 농도를 파악할 수 있다. 또한, 위와 같은 방식으로 측정된 제2 형광의 세기를 이용하여 ATP의 미지의 농도를 파악할 수 있다. 이와 같이 본 발명의 실시예에 따른 다파장 형광을 이용한 생화학 분자 검출방법을 이용하게 되면 미지의 농도를 가지는 생화학 분자의 농도의 정량화가 가능하다.
도 7은 본 발명의 다른 실시예에 따른 다파장 형광을 이용한 생화학 분자 검출방법의 흐름도이다.
본 발명의 다른 실시예에 따른 본 발명의 실시예에 따른 다파장 형광을 이용한 생화학 분자 검출방법은 기판에 화학적으로 결합되어 있고 생화학 분자와 선택적으로 결합할 수 있으며 제1 파장의 형광을 발생하는 형광 염색약이 인터칼레이팅되어 있는 하나 이상의 이중나선 DNA를 포함하는 제1 압타머 복합체 상에 상기 생화학 분자 및 상기 생화학 분자와 선택적으로 결합될 수 있고 상기 제1 파장과 다른 제2 파장의 형광을 발생하는 하나 이상의 제2 압타머 복합체를 도포하는 단계(S100), 상기 생화학 분자와 결합되지 않은 상기 제2 압타머 복합체를 제거하는 단계(S200), 상기 제1 파장의 형광의 세기와 상기 제2 파장의 형광의 세기를 측정하는 단계(S300) 및 상기 제1 형광의 세기의 증감 여부 및 상기 제2 형광의 증감 여부 이용하여 상기 생화학 분자의 검출하는 단계(S600)를 포함할 수 있다. 위에서 설명한 내용과 중복된 내용의 설명은 생략하기로 한다. 제2 형광의 증감 여부는 제2 형광이 발생하지 않다가 발생한 경우 또는 발생되고 있던 제2 형광의 세기가 감소되는 경우를 의미할 수 있다.
생화학 분자 검출센서에 생화학 분자와 하나 이상의 제2 압타머 복합체가 투입되어 생화학 분자와의 반응이 이루어지는 경우에는 제1 형광의 세기는 감소하게 되고, 제2 형광이 발생하게 된다. 반면, 생화학 분자와의 반응이 이루어지지 않는 경우에는 제1 형과의 세기는 변화가 없고 제2 형광은 발생하지 않는다. 그러나, 생화학 분자와 반응한 경우에 제1 형광의 세기가 감소하지 않는 경우가 발생할 수 있고, 제2 형광이 발생하지 않는 경우가 있을 수 있다. 또한 생화학 분자와 반응하지 않은 경우에도 제1 형광의 세기가 감소하는 경우가 발생할 수 있고, 제2 형광이 발생하는 경우가 있을 수 있다. 이러한 오류는 세척에 의하여도 일부 잔류하는 다른 물질, 생화학 분자와 유사한 물질에 의한 비특이적 결합, 형광체의 기판 상에 흡착, 제1 형광 또는 제2 형광과 유사한 파장대의 배경잡음 등 다양한 원인에 의하여 발생되는 오류이다.
이러한 오류를 해결하고 생화학 분자의 검출 여부의 정확성을 향상시키기 위하여 상기 제1 형광의 세기의 증감 여부 및 상기 제2 형광의 증감 여부를 이용하여 상기 생화학 분자의 검출하며 검출하기 위한 방법은 아래와 같다.
생화학 분자 검출센서에 생화학 분자와 하나 이상의 복합체가 투입되는 경우에는 다음과 같은 결과가 측정될 수 있다. 설명의 편의를 위하여 제1 형광의 세기가 증감되는지 여부와 제2 형광의 발생되는지 여부를 기준으로 설명하기로 한다.
제1 형광의 세기는 감소하고 제2 형광이 발생되는 경우(제1 결과): 이 경우는 생화학 분자가 검출되는 경우이므로 이 경우를 진 긍정(True Positive, TP)으로 정의한다. 진 긍정은 정상적으로 생화학 분자의 검출되는 경우이다.
제1 형광의 세기가 감소하지 않고 제2 형광이 발생하지 않는 경우(제2 결과): 이 경우는 생화학 분자가 없다는 것을 의미하며 이 경우를 진 부정(True Negative, TN)으로 정의한다. 진 부정은 정상적으로 생화학 분자가 검출되지 않는 경우이다.
제1 형광의 세기는 감소하나 제2 형광이 발생하지 않는 경우(제3 결과): 이 경우는 정상적으로 생화학 분자 검출센서가 작동하지 않는 경우이므로 이 경우를 긍정 오류(False Positive, FP)로 정의한다.
제1 형광의 세기가 감소하지 않고 제2 형광이 발생하는 경우(제4 결과): 이 경우는 정상적으로 생화학 분자 검출센서가 작동하지 않는 경우이므로 이 경우를 부정 오류(False Negative, FN)로 정의한다. 이와 같은 결과를 표로 정리하면 아래 [표 1]과 같다.
제1 형광의 세기 감소 여부 제2 형광 발생 여부 정의
예 예 진 긍정(True Positive, TP)
예 아니오 긍정 오류(False Positive, FP)
아니오 예 부정 오류(False Negative, FN)
아니오 아니오 진 부정(True Negative, TN)
일반적으로 하나의 형광의 검출 여부만으로 생화학 분자의 검출을 판단하는 경우에는 긍정 오류의 경우에도 진 긍정으로 판단하고, 부정 오류의 경우에도 진 부정으로 판단하기 때문에 생화학 분자의 검출결과의 정확성이 떨이지지만, 본 발명의 실시예에 따른 다파장 형광을 이용한 생화학 분자 검출방법은 서로 다른 파장을 갖는 두가지의 형광을 이용하기 때문에, 오류가 발생한 상태를 정확히 파악할 수 있어 생화학 분자 검출 시 생화학 분자의 검출능력을 향상시킬 수 있다.
도 8a는 ATP를 생성하는 세포에 투입되는 약물(5-FU)의 농도에 따른 ATP의 농도와 사이버 그린Ⅰ의 형광 세기 비율을 측정한 그래프이고, 도 8b는 ATP를 생성하는 세포에 투입되는 약물(5-FU)의 농도에 따른 ATP의 농도와 은 나노클러스터의 형광 세기 비율을 측정한 그래프이고, 도 8c는 투입되는 약물(5-FU)의 농도에 따른 은 나노클러스터의 형광 세기 비율에 대한 사이버 그린Ⅰ의 형광 세기 비율의 비를 측정한 그래프이다.
도 8a를 참조하면, ATP를 생성하는 세포를 죽일 수 있는 약물(5-FU)의 농도가 증가할수록 세포에서 발생하는 ATP의 농도가 적어짐을 확인할 수 있고, ATP의 농도가 적어짐에 따라 사이버 그린Ⅰ의 형광 세기 비율의 값은 증가되는 것을 확인할 수 있다. 사이버 그린Ⅰ의 형광 세기 비율은 약물(5-FU)이 투입되기 전의 사이버 그린Ⅰ의 형광 세기에 대하여 투입된 약물(5-FU)의 농도에 대한 사이버 그린Ⅰ의 형광 세기의 비로 측정되었다.
도 8b를 참조하면, ATP를 생성하는 세포를 죽일 수 있는 약물(5-FU)의 농도가 증가할수록 ATP의 농도가 적어짐을 확인할 수 있고, ATP의 농도가 적어짐에 따라 은 나노클러스터의 형광 세기 비율의 값도 감소되는 것을 확인할 수 있다. 은 나노클러스터의 형광 세기 비율은 약물(5-FU)이 투입되기 전의 은 나노클러스터의 형광 세기에 대하여 투입된 약물(5-FU)의 농도에 대한 은 나노클러스터의 형광 세기의 비로 측정되었다.
도 8c를 참조하면, 약물(5-FU)의 농도에 따라 측정된 은 나노클러스터의 형광 세기 비율에 대한 사이버 그린Ⅰ의 형광 세기 비율의 비(●)가 1에 근접한 것을 확인할 수 있고, 사이버 그린Ⅰ의 형광 세기의 변화에 대한 은 나노클러스터의 형광 세기 변화가 서로 대응하는 만큼 변화함을 확인할 수 있다.
이는 본 발명의 실시예에 따른 생화학 분자 검출센서는 생화학 분자와 결합이 정상적으로 이루어지고 오류가 발생하는 것이 낮다는 것을 의미하며 생화학 분자의 검출 정확성이 우수하다는 것을 나타내는 결과이다.
도 9a는 ATP를 생성하는 세포에 투입되는 약물(Gemcitabin)의 농도에 따른 ATP의 농도와 사이버 그린Ⅰ의 형광 세기 비율을 측정한 그래프이고, 도 9b는 ATP를 생성하는 세포에 투입되는 약물(Gemcitabin)의 농도에 따른 ATP의 농도와 은 나노클러스터의 형광 세기 비율을 측정한 그래프이고, 도 9c는 투입되는 약물(Gemcitabin)의 농도에 따른 은 나노클러스터의 형광 세기 비율에 대한 사이버 그린Ⅰ의 형광 세기 비율의 비를 측정한 그래프이다.
도 9a 내지 도 9c는 도 8a 내지 도 8b와 동일한 실험을 통하여 획득한 결과로서 약물이 변화된 경우에도 도 8a 내지 도 8c와 동일한 결과를 얻을 수 있음을 확인할 수 있다.
한편, 본 발명에서 제1 파장의 형광의 세기와 제2 파장의 형광의 세기 및 발생 여부를 측정하는 단계는 카메라에 의한 이미지 촬영에 의해서도 가능할 수 있다. 카메라에 의한 이미지 촬영은 스마트폰 카메라를 이용해서도 가능하다. 스마트폰 카메라를 이용해 이미지를 촬영하고 촬영된 이미지에 기초하여 데이터의 정량화도 동일하게 가능할 수 있다.
도 10은 본 발명에 따른 생화학 분자 검출센서를 이용해 두 가지 형광 파장대(A 형광 파장, B 형광 파장)에서 타겟 바이오 분자(에스타리디올)의 농도에 따른 정량화 데이터를 제작한 것이다. 도 10의 경우 스마트폰 카메라를 이용해 이미지를 촬영하여 정량화한 데이터를 도시한다.
스마트폰은 삼성 갤럭시 S4를 이용하였으며, 제 1 압타머 복합체는 아민(amine) 작용기가 tag된 에스트라디올 DNA 압타머 가 시퀀스, 상보 DNA, Sybr green I이 이용되었고, 제 2 압타머 복합체는 아민(amine) 작용기가 tag된 에스트라디올 DNA 압타머　나　시퀀스, 50nm carboxylate YO fluorescent polystyrene bead가 이용되었으며, 기판은 Al2O3(30nm)/Ag(120nm)가 증착된 슬라이드 글래스가 이용되었다. 기판의 Al2O3 표면에 OH 작용기를 생성하고, APTES처리하여 아민 작용기를 생성하였으며, Glutaraldehyde 처리하여 알데하이드 작용기를 생성하였고, 잉크젯 프린터를 통한 제 1압타머 복합체의 마이크로 스파팅(2X2, 지름 100마이크론)을 하였다.　
표 2는 휴대용 스마트폰을 이용하는 경우와 ELISA를 이용한 경우의 검출 정확도 수치 비교이다. 표 2에서 보는 것처럼, 본 발명을 적용함으로써 휴대폰으로도 ELISA 보다 뛰어난 건 아니지만 그에 비교할만한 검출 정확도를 얻을 수 있었다.
검출방법 민감도(%) 특이도(%) 정확도(Area Under ROC Curve) 표준편차
ELISA 88.9 100 0.956 0.048
스마트폰을 이용한 이중 정량화 77.8 80 0.922 0.064
이상에서 본 발명에 따른 실시예들이 설명되었으나, 이는 예시적인 것에 불과하며, 당해 분야에서 통상적 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 범위의 실시예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서, 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 다음의 특허청구범위에 의해서 정해져야 할 것이다.
100: 생화학 분자 검출센서 10: 기판
20: 제1 핵산 가닥 30: 제2 핵산 가닥
40: 형광 염색약 50: 제3 핵산 가닥
60: 형광체 70: 생화학 분자

Claims (13)

  1. 기판;
    상기 기판에 화학적으로 결합되고, 생화학 분자와 선택적으로 결합할 수 있는 제1 염기 서열을 가지는 제1 핵산 가닥 및 상기 제1 핵산 가닥과 상기 제1 염기 서열에 대해 상보적으로 결합하는 제2 염기 서열을 가지는 제2 핵산 가닥을 포함하고, 제1 파장의 형광을 발생하는 형광 염색약이 상기 제1 핵산가닥과 상기 제2 핵산가닥 사이에 인터칼레이팅(intercalating)된, 하나 이상의 이중나선 DNA를 포함하는 제1 압타머 복합체; 및
    상기 생화학 분자와 선택적으로 결합될 수 있는 상기 제1 염기 서열을 가지는 제3 핵산 가닥 및 상기 제3 핵산 가닥과 결합되어 있고 상기 제1 파장과 다른 제2 파장의 형광을 발생하는 형광체를 포함하는, 하나 이상의 제2 압타머 복합체를 포함하고,
    상기 제1 압타머 복합체 및 상기 제2 압타머 복합체와 반응하는 상기 생화학 분자의 양에 따라 상기 제1 파장의 형광 및 상기 제2 파장의 형광이 변경되되,
    생화학 분자의 부재 시 제 1 파장의 형광의 세기가 감소하지 아니하고 제 2 파장의 형광이 발생하지 않으며,
    생화학 분자의 존재 시, 상기 제1 압타머 복합체의 상기 이중나선 DNA가 생화학 분자와 결합된 제1 핵산가닥과 제2 핵산 가닥의 두 개의 단일 핵산 가닥으로 분리되어 형광 염색약에 의해 발생하는 제1 파장의 형광 세기가 감소하고, 상기 제2 압타머 복합체의 제3 핵산 가닥이 제1 핵산 가닥에 결합된 생화학 분자와 결합해 상기 제2 압타머 복합체의 상기 형광체에 의해 발생하는 제2 파장의 형광 세기가 증가하고,
    상기 제 1 파장의 형광 및 상기 제 2 파장의 형광의 세기 변화를 동시에 측정하여 정확한 생화학 분자의 존재 여부에 대한 검출이 가능한,
    생화학 분자 검출센서.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서,
    상기 형광 염색약은,
    사이버 그린 Ⅰ(SYBR Green Ⅰ, SG), 티아졸 오렌지(Thiazole Orange) 및 에디듐 브로마이드(Ethidium Bromide) 중 하나 이상을 포함하는,
    생화학 분자 검출센서.
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서,
    상기 제1 핵산 가닥은 상기 기판과 화학적으로 결합하는 아민(Amine)기, 카르복실(Carboxyl)기, 말레이미드(Maleimide)기 또는 티올(Thiol)기로 표지되어 있는,
    생화학 분자 검출센서.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 형광체는,
    양자점, 형광 염색약 및 금속 나노클러스터 중 하나 이상을 포함하는,
    생화학 분자 검출센서.
  7. a) 기판에 화학적으로 결합되어 있고 생화학 분자와 선택적으로 결합할 수 있는 제1 염기 서열을 가지는 제1 핵산 가닥 및 상기 제1 핵산 가닥과 상기 제1 염기 서열에 대해 상보적으로 결합하는 제2 염기 서열을 가지는 제2 핵산 가닥을 포함하고 제1 파장의 형광을 발생하는 형광 염색약이 상기 제1 핵산가닥과 상기 제2 핵산가닥 사이에 인터칼레이팅되어 있는 하나 이상의 이중나선 DNA를 포함하는 제1 압타머 복합체 상에, 상기 생화학 분자 및 상기 생화학 분자와 선택적으로 결합될 수 있는 상기 제1 염기 서열을 가지는 제3 핵산 가닥 및 상기 제3 핵산 가닥과 결합되어 있고 상기 제1 파장과 다른 제2 파장의 형광을 발생하는 형광체를 포함하는 하나 이상의 제2 압타머 복합체를 포함하는 시약을 도포하는 단계;
    b) 상기 생화학 분자와 결합되지 않은 상기 제2 압타머 복합체를 제거하는 단계; 및
    c) 상기 제1 파장의 형광의 세기와 상기 제2 파장의 형광의 세기를 측정하는 단계를 포함하고,
    상기 제1 압타머 복합체 및 상기 제2 압타머 복합체와 반응하는 상기 생화학 분자의 양에 따라 상기 제1 파장의 형광 및 상기 제2 파장의 형광이 변경되되,
    생화학 분자의 부재 시 제 1 파장의 형광의 세기가 감소하지 아니하고 제 2 파장의 형광이 발생하지 않으며,
    생화학 분자의 존재 시, 상기 제1 압타머 복합체의 상기 이중나선 DNA가 생화학 분자와 결합된 제1 핵산가닥과 제2 핵산 가닥의 두 개의 단일 핵산 가닥으로 분리되어 형광 염색약에 의해 발생하는 제1 파장의 형광 세기가 감소하고, 상기 제2 압타머 복합체의 제3 핵산 가닥이 제1 핵산 가닥에 결합된 생화학 분자와 결합해 상기 제2 압타머 복합체의 상기 형광체에 의해 발생하는 제2 파장의 형광 세기가 증가하고,
    상기 제 1 파장의 형광 및 상기 제 2 파장의 형광의 세기 변화를 동시에 측정하여 정확한 생화학 분자의 존재 여부에 대한 검출이 가능한,
    다파장 형광을 이용한 생화학 분자 검출방법.
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 제7항에 있어서,
    상기 생화학 분자의 농도를 달리하여 상기 a) 내지 c) 단계를 반복적으로 수행하는 단계; 및
    상기 생화학 분자의 농도에 따른 상기 제1 파장의 형광의 세기와 상기 제2 파장의 형광의 세기에 대한 분석함수를 도출하는 단계를 더 포함하는,
    다파장 형광을 이용한 생화학 분자 검출방법.
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 제7항에 있어서,
    상기 c) 단계는 카메라를 이용한 이미지 촬영에 의해 수행되는,
    다파장 형광을 이용한 생화학 분자 검출방법.
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