JP6448826B1

JP6448826B1 - エクソソームの製造方法及びその製造方法によって得られるエクソソーム

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Publication number: JP6448826B1
Application number: JP2018005638A
Authority: JP
Inventors: ふみ加納; 昌之村田; 雄輝園田
Original assignee: Tokyo Institute of Technology NUC
Current assignee: Tokyo Institute of Technology NUC
Priority date: 2018-01-17
Filing date: 2018-01-17
Publication date: 2019-01-09
Anticipated expiration: 2038-01-17
Also published as: JP2019122309A; US20200347360A1; WO2019142853A1; US11773377B2

Abstract

【課題】本発明の目的は、任意のタンパク質、脂質、糖質、又は核酸をエクソソームに含有させる方法を提供することである。【解決手段】前記課題は、本発明の（ａ）細胞を含む培地に穿孔活性を持つ生物毒素を添加し、インキュベートする工程、（ｂ）ＡＴＰを添加し、インキュベートする工程、及び（ｃ）カルシウムイオンを含む培地を添加し、インキュベートする工程、を含む、エクソソームの製造方法によって解決することができる。【選択図】なし

Description

本発明は、エクソソームの製造方法及びその製造方法によって得られるエクソソームに関する。本発明によれば、所望の成分をエクソソームに含有させることができる。

細胞から細胞外に分泌される細胞外小胞として、マイクロベシクル、アポトーシス小体、及びエクソソームが知られている。これらの細胞外小胞のうちエクソソームは、表面に細胞膜由来、あるいはエンドソーム膜由来のタンパク質や脂質を有し、内部に細胞質由来の核酸及びタンパク質を含み、そして細胞間の情報伝達の機能を担っていることが報告されている（非特許文献１）。
また、がん細胞又は疾患状態の細胞から分泌されたエクソソームは、がん又は疾患に特徴的なマーカーを含んでいる可能性があるため、そのようなエクソソームを用いた疾患の診断方法の開発が進められている（非特許文献２）。

「ジャーナル・オブ・エクストラセルラー・ベジクルズ（Journal of Extracellular Vesicles）」（米国）２０１５年、第４巻、Ａｒｔｉｃｌｅ：２７０６６「ＪＡＭＡオンコロジー（JAMA Oncology）」（米国）２０１６年、第２巻、ｐ８８２−８８９「トレンズ・イン・バイオテクノロジー（Trends in Biotechnology）」（米国）２０１７年、第７巻、ｐ６６５−６７６「ＢＭＢレポーツ（ＢＭＢ Reports）」（韓国）２０１６年、第４９巻、ｐ５８５−５８６「サイエンティフィック・レポーツ（Scientific Reports）」（英国）２０１７年、第７巻、Article number：15167 「プロスワン（PLoS ONE）」（米国）２０１２年、第７巻、ｅ４４１２７

また、エクソソームをドラッグデリバリーに用いるために、エクソソームを改変するための技術として、細胞外へ分泌されたエクソソームへのex vitroローディング法、及び遺伝子改変した細胞からエクソソームを取り出すin vitroローディング法が報告されている（非特許文献３）。例えば、エクソソームに任意のタンパク質をパッケージングするin vitroローディング法として、エクソソーム膜を標的とするペプチドに任意のタンパク質を結合させる方法が開示されている（非特許文献４）。しかしながら、この非特許文献４に記載の方法は、タンパク質を融合タンパク質としてエクソソームに含有させる方法であり、タンパク質をそのままエクソソームに含有させる方法ではなかった。また、ex vitroローディング法は操作が煩雑で、ローディングする物質の化学的性質によってローディングの効率が大きく異なることから、任意のタンパク質、脂質、糖質、又は核酸などをエクソソームに含有させるのは容易ではなかった。
従って、本発明の目的は、任意のタンパク質、脂質、糖質、又は核酸をエクソソームに含有させる方法を提供することである。

本発明者は、任意のタンパク質、脂質、糖質、又は核酸をエクソソームに含有させる方法について、鋭意研究した結果、驚くべきことに、セミインタクト細胞リシール技術を用いてエクソソームを製造することにより、タンパク質、脂質、糖質、又は核酸をエクソソームに含有できることを見出した。
本発明は、こうした知見に基づくものである。
従って、本発明は、
［１］（ａ）細胞を含む培地に穿孔活性を持つ生物毒素を添加し、インキュベートする工程、（ｂ）ＡＴＰを添加し、インキュベートする工程、及び（ｃ）カルシウムイオンを含む培地を添加し、インキュベートする工程、を含む、エクソソームの製造方法、
［２］（ｄ）培地からエクソソームを精製する工程、を更に含む［１］に記載のエクソソームの製造方法、
［３］工程（ｂ）において、細胞質を添加する、［１］又は［２］に記載のエクソソームの製造方法、
［４］前記穿孔活性を持つ生物毒素が、コレステロール依存性細胞溶解毒素（例えばストレプトリジンＯ、リステリオリジンＯ、スイリシン、ケイニリシン、イクイシミリシン、ニューモリシン、パーフリンゴリシンＯ、テタノリシンＯ、ミチリシン、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｍｉｔｉｓ由来ヒト血小板凝集因子、レクチノリシン、シュードニューモリシン、バジノリシン、セリゲリオリシンＯ、イバノリシンＯ、アルベオリシンＯ、アンスラリシンＯ、ピオリシンＯ、又はインターメディリシン）、ブドウ球菌α毒素、及びウェルシュ菌θ毒素からなる群から選択される、［１］〜［３］のいずれかに記載のエクソソームの製造方法、
［５］前記工程（ｃ）において、細胞に、小胞体ストレス、老化誘導、低酸素ストレス、放射線暴露、又はシスプラチン処理を付与する、［１］〜［４］のいずれかに記載のエクソソームの製造方法、
［６］前記工程（ｂ）において、外来成分を添加する、［１］〜［５］のいずれかに記載のエクソソームの製造方法、
［７］前記外来成分が、タンパク質、核酸、低分子化合物、脂質、糖質、蛍光色素、可溶性ポリマー、又は磁気ビーズである、［６］に記載のエクソソームの製造方法
［８］［１］〜［７］のいずれかに記載のエクソソームの製造方法によって得られる、エクソソーム、及び
［９］蛍光標識分子を含むエクソソーム（但し、エクソソーム膜を標的とするペプチドと融合した蛍光標識分子を除く）、
に関する。
セミインタクト細胞リシール技術は、細胞膜を穿孔し、細胞質内に特定の物質を導入する技術として知られている（非特許文献５及び６）が、セミインタクト細胞リシール技術により、効率良くエクソソームが製造できることは、驚くべきことである。
本明細書において、セミインタクト細胞リシール技術で得られた細胞を「リシール細胞」と称することがある。

本発明のエクソソームの製造方法によれば、任意のタンパク質、脂質、糖質、又は核酸をエクソソームに含有させることができる。また、大量のエクソソームを製造することができる。本発明の製造方法によって得られたエクソソームは、ドラッグデリバリーに用いることができる。

本発明のエクソソームの製造方法の概要を示した図である。ＨｅＬａ細胞を用いて、リシール細胞から得られたエクソソーム（小胞体ストレス有り、又は無し）の粒子径分布及び粒子数、又はインタクト細胞から得られたエクソソーム（小胞体ストレス有り、又は無し）の粒子径分布及び粒子数を示したグラフである。蛍光標識デキストランを含むリシール細胞のＣＤ６３を、抗体を用いて蛍光抗体法により検出したＮ−ＳＴＲＯＲＭによる顕微鏡写真である。コントロールは、インタクト細胞の顕微鏡写真である。蛍光標識デキストランを含むリシール細胞のＣＤ６３を、抗体を用いて蛍光抗体法により検出したＮ−ＳＴＲＯＲＭによる顕微鏡写真である。コントロールは、インタクト細胞の顕微鏡写真である。本発明の製造方法で得られたエクソソームの、ＦＩＴＣ、ＣＤ６３、ＴＳＧ１０１、及びＨＳＰ７０Ａをウエスタンブロッティングで解析した写真である。

［１］エクソソームの製造方法
本発明のエクソソームの製造方法は、（ａ）細胞を含む培地に穿孔活性を持つ生物毒素を添加し、インキュベートする工程（以下、工程（ａ）と称することがある）、（ｂ）ＡＴＰを添加し、インキュベートする工程（以下、工程（ｂ）と称することがある）、及び（ｃ）カルシウムイオンを含む培地を添加し、インキュベートする工程（以下、工程（ｃ）と称することがある）、を含む。また、本発明のエクソソームの製造方法は、更に（ｄ）培地からエクソソームを精製する工程（以下、工程（ｄ）と称することがある）を含むことができる。

《工程（ａ）》
前記工程（ａ）においては、細胞を含む培地に穿孔活性を持つ生物毒素を添加し、インキュベートする。本工程は、リシール細胞を作製するために、穿孔活性を持つ生物毒素により、細胞を穿孔する工程である。

（穿孔活性を持つ生物毒素）
穿孔活性を持つ生物毒素としては、特に限定されるものではないが、コレステロール依存性細胞溶解毒素、ブドウ球菌α毒素、又はウェルシュ菌θ毒素が挙げられるが、コレステロール依存性細胞溶解毒素が好ましい。コレステロール依存性細胞溶解毒素としては、ストレプトリジンＯ、リステリオリジンＯ、スイリシン、ケイニリシン、イクイシミリシン、ニューモリシン、パーフリンゴリシンＯ、テタノリシンＯ、ミチリシン、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｍｉｔｉｓ由来ヒト血小板凝集因子、レクチノリシン、シュードニューモリシン、バジノリシン、セリゲリオリシンＯ、イバノリシンＯ、アルベオリシンＯ、アンスラリシンＯ、ピオリシンＯ、又はインターメディリシンが挙げられるが、ストレプトリジンＯ、又はリステリオリシンＯが好ましい。
穿孔活性を有する生物毒素は、界面活性剤などによる細胞への穿孔と比較して穏やかであり、カルシウムイオンによるリシールが効果的に実施できる。

（コレステロール依存性細胞溶解毒素）
コレステロール依存性細胞溶解毒素は、細胞膜のコレステロールを受容体とする毒素であり、細胞を穿孔することができる。
例えば、ストレプトリジンＯ（ＳＬＯ）は、連鎖球菌が菌体外に産生するコレステロール結合細菌毒素であり、６０，４００の分子量を有するタンパク質である。ＳＬＯは、細胞膜のコレステロールに選択的に結合し、多量体の環状複合体を形成することで３０ｎｍ程度の孔を細胞膜に形成することができる。また、形成された孔は、融合することなどにより２００ｎｍ程度まで大きくなることもある。形成された孔は、カルシウムイオン依存的に閉じる。また、ＳＬＯは、酸素感受性であり、酸素存在下に長時間さらされることにより失活させることができる。
穿孔活性を有する生物毒素の培地中の濃度は、細胞に孔が生じる限りにおいて、特に限定されるものではないが、例えば０．００１〜１，０００μｇ／ｍＬであり、好ましくは０．０１〜１００μｇ／ｍＬであり、より好ましくは０．０５〜１０μｇ／ｍＬであり、最も好ましくは０．０８３〜０．１２５μｇ／ｍＬである。当業者は、それぞれ生物毒素の穿孔活性及び細胞への毒性の強弱に応じて、生物毒素の濃度を適宜調整して用いることができる。

工程（ａ）において使用する培地は、特に限定されず、使用する細胞に応じて適宜選択することができるが、例えばＰＢＳ、ＤＭＥＭ、ＥＭＥＭ、Ｇ−ＭＥＭ、ＭＥＭａｌｐｈａ、Ｈａｍ’ｓＦ−１２、Ｈａｍ’ｓＦ−１２Ｋ、ＩＭＤＭ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ８、ＨＢＳＳ、又はＲＰＭＩ−１６４０（ＲＰＭＩ−１６４０）が挙げられる。培地に血清を添加すると生物毒素が血清成分に吸着し、作用が弱まることがあるため、無血清培地が好ましい。

前記生物毒素を添加した後に、１〜１０分氷上で静置することが好ましい。例えばＳＬＯはコレステロールに結合し、２５℃以上で穿孔活性を持つため、添加したＳＬＯを氷上で細胞になじませるためである。他の生物毒素も、細菌由来のものが多く、細菌の増殖温度で穿孔活性を示すものが多い。また、氷上でＳＬＯなどの生物毒素を細胞膜に結合させ、その後に細胞に結合していないＳＬＯなどの生物毒素を洗い流すことが好ましい。その後、温度を上げＳＬＯなどの生物毒素を活性化させることによって、開孔からＳＬＯが細胞質内に入ることを防止し、細胞内のオルガネラへのダメージを防ぐことができる。
生物毒素によるインキュベーションは、限定されるものではないが、２５℃以上で行うことが好ましく、より好ましくは３０℃以上であり、更に好ましくは３５℃以上である。インキュベーション温度の上限は、生物毒素が失活しない限り、特に限定されるものではないが、例えば５０℃以下であり、好ましくは４５℃以下であり、より好ましくは４０℃以下である。
インキュベーション時間も、細胞に孔が形成され、そして細胞に悪影響が無い限りにおいて、特に限定されるものではないが、例えば１〜６０分であり、好ましくは２〜３０分であり、より好ましくは５〜２０分であり、最も好ましくは８〜１５分である。

本発明において用いる細胞としては、特に限定されるものではないが、生物から分離された初代培養細胞、又は継代培養細胞を用いることができる。細胞の由来も、特に限定されるものではなく、哺乳類としては、例えばヒト、サル、イヌ、ネコ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ウマ、ウサギ、モルモット、ラット、及びマウスを挙げることができる。また、鳥類としては、ニワトリ、ウズラ、アヒル、ガチョウ、ダチョウ、及びホロホロチョウを挙げることができ、爬虫類としては、ワニ、カメ、及びトカゲを挙げることができ、両生類としては、カエル、及びイモリを挙げることができ、魚類としては、テラピア、タイ、ヒラメ、サメ、及びサケを挙げることができる。更に、無脊椎動物としては、カニ、貝類、クラゲ、及びエビを挙げることができる。更に昆虫細胞を用いることもできる。コレステロール依存性細胞溶解毒素を用いる場合、細胞膜にコレステロールを発現している細胞が好ましい。

《工程（ｂ）》
工程（ｂ）においては、ＡＴＰを添加し、インキュベートする。本工程は、工程（ａ）おいて形成された孔を介して、細胞外の成分を細胞内へ移行させる工程である。すなわち、細胞外の液体を、細胞質に流入させる工程である。
また、前記培地がカルシウムイオンを含んでいる場合は、カルシウムイオンにより穿孔活性を持つ生物毒素によって形成された孔が閉孔することがある。従って、培地にカルシウムキレート剤を添加することが好ましい。キレート剤としては、カルシウムをキレートできる限りにおいて、限定されるものではないが、ＥＧＴＡ（Ethylene Glycol Tetraacetic Acid）ＥＤＴＡ（Ethylene Diamine Tetraacetic Acid）、ＮＴＡ（Nitrilo Triacetic Acid）、ＤＴＰＡ（Diethylene Triamine Pentaacetic Acid）、ＨＥＤＴＡ（Hydroxyethyl Ethylene Diamine Triacetic Acid）、ＴＴＨＡ（Triethylene Tetramine Hexaacetic Acid）、ＰＤＴＡ（1,3-Propanediamine Tetraacetic Acid）、ＤＰＴＡ−ＯＨ（1,3-Diamino-2-hydroxypropane Tetraacetic Acid）、ＨＩＤＡ（Hydroxyethyl Imino Diacetic Acid）、ＤＨＥＧ（Dihydroxyethyl Glycine）、ＧＥＤＴＡ（Glycol Ether Diamine Tetraacetic Acid）、ＣＭＧＡ（Dicarboxymethyl Glutamic Acid）、又はＥＤＤＳ（(S,S)-Ethylene Diamine Disuccinic Acid）が挙げられる。
カルシウムキレート剤の濃度も、その効果が得られる限りにおいて限定されるものではないが、例えば０．１〜５ｍＭであり、より好ましくは０．５〜３ｍＭである。

工程（ｂ）においては、カリウムイオン濃度を上昇させるために、トランスポートバッファーを添加してもよい。トランスポートバッファーに前記カルシウムキレート剤を添加してもよい、トランスポートバッファーとしては、例えば２５ｍＭＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．４）、０．１１５ＭＣＨ_３ＣＯＯＫ、２．５ｍＭＭｇＣｌ_２の組成のトランスポートバッファーが挙げられる。
培地中のカリウムイオン濃度も、本発明の効果が得られる限りにおいて限定されるものではないが、好ましくは１〜１，０００ｍＭであり、より好ましくは１０〜５００ｍＭであり更に好ましくは５０〜３００ｍＭである。

《ＡＴＰ》
ＡＴＰはミトコンドリアの活性、膜融合、膜の修復、及びストレス応答などに作用する。ＡＴＰの濃度は、発明の効果が得られる限りにおいて限定されるものではないが、好ましくは０．１〜１００ｍＭであり、より好ましくは０．５〜５０ｍＭであり、より好ましくは１〜１０ｍＭである。

《外来成分》
本発明において、前記細胞外の成分（細胞外の液体）に外来成分を添加してもよい。本明細書において、「外来成分」とは、本発明のエクソソームの製造方法に用いる細胞の細胞質に含まれている成分以外の成分を意味する。従って、外来成分としては、用いる細胞以外の細胞の細胞質成分、タンパク質、核酸、低分子化合物、脂質、糖質、蛍光色素、可溶性ポリマー、又は磁気ビーズが挙げられる。外来成分として、ドラッグデリバリーで輸送する成分を添加してもよい。すなわち、ドラッグデリバリーで輸送する成分として、タンパク質、核酸、低分子化合物、脂質、又は糖質などを添加することにより、製造されたエクソソームにそれらの成分を含有させることができる。例えば、細胞質成分を添加することによりリシール効率が上昇する。また、リシール後の細胞の生存率が向上する。従って、エクソソームの効率的な産生のために、外来成分として細胞質成分を添加することが好ましい。
前記外来成分の分子量は、エクソソームに取り込まれる限りにおいて限定されるものではないが、上限は５００万であり、好ましくは５０万であり、より好ましくは１０万であり、更に好ましくは６万であり、最も好ましくは３，０００である。分子量の下限は限定されるものではないが、低分子１分子、例えばアミノ酸１分子でもよい。

前記タンパク質としては、蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ、ＤｓＲｅｄ、又は改変ＧＦＰ、ＤｓＲｅｄ（例えば、Ｓｉｒｉｕｓ、ＥＢＦＰ、ＳＢＰ２、ＥＢＰ２、Ａｚｕｒｉｔｅ、ｍＫａｌａｍａ１、ＴａｇＢＦＰ、ｍＢｌｕｅｂｅｒｒｙ、ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ、ＥＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ｍＣｅｒｕｌｅａｎ、ＴａｇＣＦＰ、ＡｍＣｙａｎ、ｍＴＰ１、ＭｉＣｙ（ＭｉｄｏｒｉｉｓｈｉＣｙａｎ）、ＴｕｒｂｏＧＦＰ、ＣＦＰ、ＡｃＧＦＰ、ＴａｇＧＦＰ、ＡＧ（Ａｚａｍｉ−Ｇｒｅｅｎ）、ｍＡＧ１、ＺｓＧｒｅｅｎ、ＥｍＧＦＰ（Ｅｍｅｒａｌｄ）、ＥＧＦＰ、ＧＰ２、Ｔ−Ｓａｐｐｈｉｒｅ、ＨｙＰｅｒ、ＴａｇＹＦＰ、ｍＡｍｅｔｒｉｎｅ、ＥＹＦＰ、ＹＦＰ、Ｖｅｎｕｓ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、ＰｈｉＹＦＰ、ＰｈｉＹＦＰ−ｍ、ｔｕｒｂｏＹＦＰ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ、ｍＢａｎａｎａ、ｍＫＯ１、ＫＯ（ＫｕｓａｂｉｒａＯｒａｎｇｅ）、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＯｒａｎｇｅ２、ｍＫＯ２、Ｋｅｉｍａ５７０、ＴｕｒｂｏＲＦＰ、ＤｓＲｅｄ−Ｅｘｐｒｅｓｓ、ＤｓＲｅｄ２、ＴａｇＲＦＰ、ＴａｇＲＦＰ−Ｔ、ＤｓＲｅｄ−Ｍｏｎｏｍｅｒ、ｍＡｐｐｌｅ、ＡｓＲｅｄ２、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ＴｕｒｂｏＦＰ６０２、ｍＲＰ１、ＪＲｅｄ、ＫｉｌｌｅｒＲｅｄ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ＫｅｉｍａＲｅｄ、ＨｃＲｅｄ、ｍＲａｓｂｅｒｒｙ、ｍＫａｔｅ２、ＴａｇＦＰ６３５、ｍＰｌｕｍ、ｅｇＦＰ６５０、Ｎｅｐｔｕｎｅ、又はｍＮｅｐｔｕｎｅ））、抗体、機能性ペプチド、又は合成ペプチドが挙げられる。
前記核酸としては、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ、例えばメッセンジャーＲＮＡ、トランスファーＲＮＡ、又はリボゾームＲＮＡ）、又は機能性核酸（例えば、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｌｉｎｃＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、アンチセンスＤＮＡ、リボザイム、ＤＮＡエンザイム、モレキュラー・ビーコン、リボスイッチ、Ｕ１アダプター、人工染色体、人工ＤＮＡ、又はアプタマー）が挙げられる。
前記低分子化合物としては、ケミカルファイルに登録されている種々の公知化合物（ペプチドを含む）、コンビナトリアル・ケミストリー技術（Ｔｅｒｒｅｔｔら，Ｊ．Ｓｔｅｅｌｅ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，第５１巻，第８１３５−８１７３頁，１９９５年）によって得られた化合物が挙げられる。
前記蛍光色素としては、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、オレゴングリーン、トーキョーグリーン、カルボキシフルオレセイン、又はカルボキシフルオレセインジアセテートが挙げられる。

工程（ｂ）におけるインキュベーションの温度は、細胞外の成分が細胞内へ移行できる限りにおいて特に限定されるものではないが、例えば４℃〜５０℃であり、好ましくは１５〜４５℃であり、より好ましくは２５〜４２℃であり、最も好ましくは３０〜４０℃である。
インキュベーション時間も、細胞外の成分が細胞内へ移行できる限りにおいて特に限定されるものではないが、例えば１〜１２０分であり、好ましくは３〜６０分であり、より好ましくは５〜４０分であり、最も好ましくは１０〜３０分である。

《工程（ｃ）》
工程（ｃ）においては、カルシウムイオンを含む培地を添加し、インキュベートする。本工程は、カルシウムイオンによって、細胞に形成された孔を塞ぐ工程である。すなわち、セミインタクト細胞をリシールする工程である。
添加するカルシウムイオンとしては、限定されるものではなく、カルシウム塩を用いることができる。具体的には、例えばＣａＣｌ_２を用いることができる。カルシウムイオン濃度は、細胞がリシールされる限りにおいて、特に限定されるものではないが、例えば０．１〜１０ｍＭであり、好ましくは０．２〜５ｍＭであり、より好ましくは０．３〜２ｍＭである。
工程（ｃ）におけるインキュベーションの温度は、細胞の孔が塞がれる限りにおいて特に限定されるものではないが、例えば２５℃〜５０℃であり、好ましくは３０〜４５℃であり、より好ましくは３５〜４０℃である。
インキュベーション時間も、細胞の孔が塞がれる限りにおいて特に限定されるものではないが、例えば１〜３０分であり、好ましくは２〜１５分であり、より好ましくは３〜１０分である。

工程（ｃ）においては、工程（ａ）〜工程（ｃ）のストレス緩和のために、例えば３７℃、５％ＣＯ_２存在下で、２時間程度、培養することが好ましい。前記培養温度、ＣＯ_２濃度、及び培養時間は、用いる細胞等によって、適宜調整することができる。
更に、工程（ｃ）においては、エクソソームの効率的な生成のために、細胞の培養を行うことが好ましい。例えば、培養温度は、好ましくは２５〜４０℃程度であり、培養時間は、好ましくは１〜９６時間であり、より好ましくは１２〜７２時間であり、更に好ましくは２４〜６０時間である。培養温度、培養時間、ＣＯ_２濃度などの培養条件は、細胞の種類、又は細胞の状態などに応じて、適宜変更することができる。
また、培養に用いる培地も細胞の種類等に応じて適宜選択することができるが、ウシなどの血清由来のエクソソームの混入を防ぐために、血清フリーの培地を使用することが好ましい。

エクソソームの生成のための培養時に、細胞にストレスを付与することにより、エクソソームの産生量を増加させることができる。本発明の製造方法においては、工程（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ）によって、細胞に穿孔し、細胞外の液を流入させ、孔を塞ぐセミインタクト細胞リシール法（以下、リシール法と称することがある）を実施している。このリシール法による細胞へのストレスにより、リシール法を実施していない細胞と比較して、エクソソームの生成を増加させることができる。
このリシール法による細胞へのストレスに加えて、前記培養時に細胞にストレスを付与することにより、エクソソームの産生量を増加させることができる。細胞へのストレスとしては、エクソソームの産生量が増加する限りにおいて、特に限定されるものではないが、例えば小胞体ストレス、老化誘導、低酸素ストレス、放射線暴露、又はシスプラチン処理が挙げられる。
前記小胞体ストレス（ＥＲストレス）とは、正常な高次構造に折り畳まれなかったタンパク質（変性タンパク質；unfolded protein）が小胞体に蓄積し、それにより細胞への悪影響（ストレス）が生じることである。具体的には、ツニカマイシン（Tunicamycin）、タプシガルギン（Thapsigargin）、又はジチオスレトール（DTT）を培地に添加することにより、小胞体ストレスを細胞に付与することができる。ツニカマイシン、タプシガルギン、又はジチオスレトールの添加量は、特に限定されるものではなく、細胞の種類等に従って、適宜決定することができるが、例えばツニカマイシンは、５μｇ／ｍＬの濃度で培地に添加することによって小胞体ストレスを付与できる。

前記老化ストレスとは、細胞の老化を誘導するストレスである。具体的には、プロジェリンの発現、細胞周期の停止、がん化（Ras過剰発現）、シスプラチンなどの老化誘導剤による処理、高継代回数、放射線曝露、酸化ストレス、ERストレス、又は熱ショックによって、老化を誘導することができる。

前記低酸素ストレスとは、細胞を低酸素状態に置くことによって生じるストレスである。通常、細胞培養においては、２０％の酸素濃度で培養するが、例えば０．０５％〜５％、より好ましくは０．１〜１％の酸素濃度で培養することによって、低酸素ストレスを細胞に付与することができる。低酸素ストレスを付与できる酸素濃度は、細胞の種類又は細胞の状態に応じて、適宜変更することができる。

《工程（ｄ）》
工程（ｄ）においては、培地からエクソソームを精製する。前記工程（ａ）〜（ｃ）によって、細胞外の培地中にエクソソームが分泌される。本工程においては、分泌されたエクソソームを濃縮などの方法により精製する。
得られたエクソソームの大部分は、５０〜１５０ｎｍの直径の粒子であり、１．１１〜１．１９ｇ／ｍＬの密度を有している。このようなエクソソームの物性を利用して、エクソソームを精製することができる。
具体的な精製方法として、超遠心法、密度こう配遠心法、ポリマー沈殿法、フローサイトメーター法、カラム、又は限外濾過法が挙げられる。
超遠心法としては、得られた培養上清から、低速遠心（例えば、２，０００ｘｇ）により細胞のデブリスなどを除去する。得られた上清を、０．２２μｍ程度のフィルターを通過させ、１μｍ程度の粒径のマイクロベシクルを除去する。得られた上清を、例えば１００，０００ｘｇで超遠心し、エクソソームを回収する。回収したエクソソームは、再び１００，０００ｘｇで超遠心し、再精製してもよい。
密度こう配遠心としては、ショ糖密度こう配遠心法によって行ってもよく、市販の密度こう配遠心に用いる試薬を用いて行ってもよい。超遠心法と同じように、上清から低速遠心によって細胞のデブリスを除去し、密度こう配遠心を実施することができる。
ポリマー沈殿としては、ポリエチレングリコール（PEG）などを添加して溶解度を下げ、エクソソームを沈殿させることができる。市販のキットとして、Ｔｏｔａｌｅｘｏｓｏｍｅｉｓｏｌａｔｉｏｎｋｉｔ，Ｅｘｏｑｕｉｃｋを用いてもよい。液体の試薬とサンプルを混合し、２０，０００ｘｇ以下で遠心し、沈殿を懸濁することでエクソソームを回収することができる。
フローサイトメーターとしては、ＰＫＨ２６などの膜染色試薬を用いてエクソソームを非特異的に染色するか、蛍光抗体法でエクソソームの表面抗原を特異的に染色し、フローサイトメーターでエクソソームを回収することができる。更に、ＦＩＴＣ、又は蛍光タンパク質を含んだエクソソームをフローサイトメーターで回収することができる。
カラムとしては、分子量で分離する限外濾過法、サイズ排除クロマトグラフィーカラム、又はエクソソームに対する抗体を固相化したアフィニティーカラムを用いることができる。
限外濾過法としては、５０〜１５０ｎｍの粒子を分離できるフィルターを用いることによって、エクソソームを精製することができる。例えば、０．２２μｍのフィルターを用いることにより、１μｍ程度の粒径のマイクロベシクルを除去し、２２０ｎｍ未満のエクソソームを得ることができる。

［２］エクソソーム
本発明のエクソソームは、前記エクソソームの製造方法によって得ることができる。本発明のエクソソームの製造方法によって得られたエクソソームは、細胞外の液が細胞質内に流入し、そしてエクソソームに細胞外の液が含まれるため、リシール法を用いずに得られたエクソソームとはその組成が異なる。例えば、穿孔活性を持つ生物毒素により、細胞膜を穿孔するが、若干の生物毒素が細胞内に流入し、エクソソームに含まれることがある。また、ＣＤ６３の発現量、ＨＰＳ７０の発現量、及び／又はＴＳＧ１０１の発現量が、リシール法を用いずに得られたエクソソームと異なることがある。また、本発明のエクソソームは、コレステロールの含有量が、通常のエクソソームと異なる可能性がある。更に、工程（ｂ）において、外来成分を添加することによって、エクソソームが外来成分を含むことがある。

《作用》
本発明の製造方法により得られるエクソソームには、外来成分を含有させることができる。そのメカニズムは、詳細に調べられているわけではないが、以下のように推定される。しかしながら、本発明は以下の推定によって限定されるものではない。
例えば、細胞質成分に可溶するＨＳＰファミリーやＧＡＰＤＨなどのタンパク質は拡散によって取り込まれると考えられる。更に、外来成分であるデキストラン、ＢＳＡなどの生理的に不活性な物質も拡散によってエクソソームに取り込まれると考えられる。
穿孔活性を持つ生物毒素によって形成される孔は３０ｎｍ程度であるが、融合によって２００ｎｍ程度の孔が形成されることもある。従って、孔を通過できる外来成分であれば、拡散などによって細胞質内に導入され、エクソソームに含有されることができると推定される。

以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。

《実施例１》
本実施例では、本発明の製造方法で、ＨｅＬａ細胞を用いてエクソソームを作製し、粒子径分布及び粒子数を測定した。
ＨｅＬａ細胞を１０％ＦＣＳ含有Ｄ−ＭＥＭ培地で、１００％コンフルエントになるまで培養し、ＰＢＳにより洗浄した。無血清Ｄ−ＭＥＭでＳＬＯを１０，０００倍に希釈し、０．１μｇ／ｍＬのＳＬＯを含むＤ−ＭＥＭを、１ｍＬ細胞に添加し、氷上で５分間静置した。ＰＢＳにより洗浄後、２ｍＭのＥＧＴＡを含むＴｒａｎｓｐｏｒｔｂｕｆｆｅｒ（２５ｍＭＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．４）、０．１１５ＭＣＨ_３ＣＯＯＫ、２．５ｍＭＭｇＣｌ_２）を１ｍＬ加えた後、３７℃で１０分間静置した。

次に、Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｂｕｆｆｅｒにより洗浄後、タンパク質濃度が３ｍｇ／ｍＬのＬ５１７８Ｙ細胞質（１ｍＭＡＴＰ、１ｍＭＧＴＰ、１ｍｇ／ｍＬのＧｌｕｃｏｓｅ、０．０５ｍｇ／ｍＬのｃｒｅａｔｉｎｅｋｉｎａｓｅ、２．６２ｍｇ／ｍＬのｃｒｅａｔｉｎｅｐｈｏｓｐｈａｔｅ、０．２５Ｍのｓｕｃｒｏｓｅ）を１ｍＬ添加し、３７℃で２０分間作用させた。

次に、１ｍＭのＣａＣｌ_２を添加し、３７℃で５分間作用させることにより、リシールした。リシール細胞作製時のストレス緩和のために３７℃、５％ＣＯ_２存在下で、２時間培養し、培地交換を行った。
５ｍＬの牛由来エクソソームを含まない１０％ＦＣＳ含有Ｄ−ＭＥＭを用い、３７℃で１２時間培養した。このとき、小胞体ストレスを付与するため、５μｇ／ｍＬとなるようにツニカマイシンを、培地に添加した。小胞体ストレスなしのコントロールとして、同量のＤＭＳＯを培地に添加した。

得られた培養上清から、遠心分離によりエクソソームを回収した。５ｍＬの培養上清を、２，０００ｘｇで１０分間、遠心分離し、細胞デブリスを除去した。得られた上清を、０．２２μｍのフィルターでろ過し、１μｍ程度のマイクロベジクルを除去した。得られた上清を１００，０００ｘｇで７０分間、遠心し、上清を捨てた。１２ｍＬのＰＢＳで再懸濁し、１００，０００ｘｇで７０分間、再度遠心した。沈殿を５０μＬのＰＢＳに懸濁し、エクソソームを回収した。
得られたエクソソームの粒子径分布と粒子数とを、ｑＮａｎｏ（Izon社）を用いて測定した。結果を図２に示す。

《比較例１》
本比較例では、リシール法を行わずに、ＨｅＬａ細胞からエクソソームを回収し、粒子径分布及び粒子数を測定した。
本発明の工程（ａ）〜（ｃ）を実施していないＨｅＬａ細胞を、１ｍＬの牛由来エクソソームを含まない１０％ＦＣＳ含有Ｄ−ＭＥＭで、３７℃で１２時間培養した。このとき、小胞体ストレスを付与するため、５μｇ／ｍＬとなるようにＴｕｎｉｃａｍｙｃｉｎを、培地に添加した。小胞体ストレスなしのコントロールとして、同量のＤＭＳＯを培地に添加した。
次に、前記実施例１と同様に、遠心分離によってエクソソームを回収した。得られたエクソソームの粒子径分布と粒子数とを、ｑＮａｎｏ（Izon社）を用いて測定した。結果を図２に示す。

図２に示すように、実施例１において得られたエクソソームにおいて、ＥＲストレス曝露群（ツニカマイシン添加）は、対照群（ＤＭＳＯ添加）と比較してエクソソーム数が増加していた。すなわち、ＥＲストレスにより、エクソソーム分泌応答が起こることが分かった。
また、比較例１において得られたエクソソーム数と比較して、実施例１で得られたエクソソーム数が増加していた。従って、本発明の製造方法により、エクソソーム数が増加すると考えられた。

《実施例２及び比較例２》
本実施例では、エクソソームに蛍光標識デキストランを取り込ませ、超解像顕微鏡により、膜タンパク質を解析した。
Ｌ５１７８Ｙ細胞質に、ＣＦ５６８が付加されたデキストラン（分子量１０，０００）を添加したことを除いては、実施例１の操作を繰り返して、リシール細胞を作製した。リシール細胞作製時のストレス緩和のために、３７℃、５％ＣＯ_２存在下で、２時間培養した。得られた細胞を固定し、ＣＤ６３抗体を用いて蛍光抗体法を行った。また、比較例２として、ＳＬＯ処理をしていないＨｅＬａ細胞についても、ＣＤ６３抗体を用いて蛍光抗体法を行った。
超解像顕微鏡Ｎ−ＳＴＯＲＭ（ニコン社）で観察したところ、リシール細胞では、１０ｋＤａＣＦ５６８標識デキストラン（緑）はＣＤ６３（赤）に取り囲まれている様子が観察できた（図３、「＋ＳＬＯ」（インセットは四角部分の拡大図）および図４、「＋ＳＬＯ」）。それに対し、ＳＬＯ処理していないインタクト細胞では、ＣＦ５６８標識デキストランは近傍でＣＤ６３のシグナルと一部重なることはあるものの（図４、「−ＳＬＯ」）、囲まれることはなかった（図３、「−ＳＬＯ」）。リシール細胞ではＣＦ５６８標識デキストランが細胞質中にあり、それがエクソソーム内へと移行し、その結果ＣＤ６３に囲まれたデキストランの像が得られたと考えられる（図４（Ｂ）、３（緑）：ＣＦ５６８標識デキストランを含む細胞質、４（赤）：ＣＤ６３）。インタクト細胞ではＣＦ５６８標識デキストランは細胞質には存在せず、同様な構造が観察されなかった（図４（Ａ）、１（青）：細胞質、２（赤）：ＣＤ６３）。
このことから、細胞質成分がＩＬＶに取り込まれることがわかった。

《実施例３及び比較例３》
本実施例及び比較例では、エクソソームに含まれるタンパク質であるＣＤ６３、ＥＳＣＲＴ関連膜タンパク質ＴＳＧ１０１、ＨＳＰ７０Ａをウエスタンブロッティングで解析した。コントロールとして、ＥＲに局在するＣａｌｎｅｘｉｎを検出した。また、外来成分であるＦＩＴＣについても、ウエスタンブロッティングで解析した。
Ｌ５１７８Ｙ細胞質にＦＩＴＣが付加されたＢＳＡ（ＢＳＡ−ＦＩＴＣ）を添加したこと、及びＦＢＳを含まない無血清Ｄ−ＭＥＭでの培養を４８時間としたことを除いては、実施例１の操作を繰り返し、エクソソームを回収した。ＢＳＡ−ＦＩＴＣはリシール操作により細胞質へと導入できたことを蛍光顕微鏡観察により確認した（図５、「ＢＳＡ−ＦＩＴＣ標識リシール細胞」）。また、比較例１の操作を繰り返し、エクソソームを回収した。
インタクト細胞、リシール細胞、又はそれらの細胞から得られたエクソソームをＲＩＰＡｂｕｆｆｅｒで溶解後、６×Ｓａｍｐｌｅｂｕｆｆｅｒを混合し、１００℃で５分間煮沸した。続いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりタンパク質を泳動分離した。次に、セミドライブロッティング法によりゲル中のタンパク質を予め親水化させたＰＶＤＦメンブレンへ転写した。このメンブレンを５％ＢＳＡでブロッキング後、エクソソームマーカータンパク質、ネガティブコントロールであるＣａｌｎｅｘｉｎ、又はＦＩＴＣに対する１次抗体を反応させ、そして２次抗体を反応させた。
ＡｍｅｒｓｈａｍＩｍａｇｅｒ６００を用いてメンブレン上のターゲットバンドを検出した結果、図５に示すように、細胞ライセートおよびエクソソームとも、リシール細胞（実施例３）にのみＢＳＡ−ＦＩＴＣのバンドが検出された（図５、左下図、赤四角で囲まれたバンド）。このことはＢＳＡ−ＦＩＴＣは細胞内のみならず、エクソソームにまで取り込まれ、リシール細胞で貨物が改変されたエクソソームが分泌されることを意味する。また、エクソソームマーカーに対する抗体を用いたＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇの結果では、エクソソームマーカーであるＣＤ６３、ＨＳＰ７０、及びＴＳＧ１０１は、インタクト細胞（比較例３）及びリシール細胞（実施例３）いずれから調製されたエクソソームでも検出された（図５、右下図、α−ＣＤ６３、α−ＨＳＰ７０、α−ＴＳＧ１０１）。ネガティブコントロールであるＣａｌｎｅｘｉｎはいずれの場合も細胞ライセートにはあるが、エクソソームには存在しなかった（図５、右下図、α−Ｃａｌｎｅｘｉｎ）。以上のことから、リシール細胞由来のエクソソームはインタクト細胞と同様エクソソームマーカーを含むものであり、細胞膜がちぎれて出来た小胞や細胞のデブリが主成分ではないことが確認できた。

本発明の製造方法によって得られたエクソソームは、任意のタンパク質、脂質、糖質、又は核酸をエクソソームに含有することができる。従って、本発明の製造方法によって得られたエクソソームは、例えばドラッグデリバリーに用いることができる。

Claims

（ａ）細胞を含む培地に穿孔活性を持つ生物毒素を添加し、インキュベートする工程、（ｂ）ＡＴＰを添加し、インキュベートする工程、及び
（ｃ）カルシウムイオンを含む培地を添加し、インキュベートする工程、
を含む、エクソソームの製造方法。
（ｄ）培地からエクソソームを精製する工程、
を更に含む請求項１に記載のエクソソームの製造方法。
工程（ｂ）において、細胞質を添加する、請求項１又は２に記載のエクソソームの製造方法。
前記穿孔活性を持つ生物毒素が、コレステロール依存性細胞溶解毒素（例えばストレプトリジンＯ、リステリオリジンＯ、スイリシン、ケイニリシン、イクイシミリシン、ニューモリシン、パーフリンゴリシンＯ、テタノリシンＯ、ミチリシン、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｍｉｔｉｓ由来ヒト血小板凝集因子、レクチノリシン、シュードニューモリシン、バジノリシン、セリゲリオリシンＯ、イバノリシンＯ、アルベオリシンＯ、アンスラリシンＯ、ピオリシンＯ、又はインターメディリシン）、ブドウ球菌α毒素、及びウェルシュ菌θ毒素からなる群から選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載のエクソソームの製造方法。
前記工程（ｃ）において、細胞に、小胞体ストレス、老化誘導、低酸素ストレス、放射線暴露、又はシスプラチン処理を付与する、請求項１〜４のいずれか一項に記載のエクソソームの製造方法。
前記工程（ｂ）において、外来成分を添加する、請求項１〜５のいずれか一項に記載のエクソソームの製造方法。
前記外来成分が、タンパク質、核酸、低分子化合物、脂質、糖質、蛍光色素、可溶性ポリマー、又は磁気ビーズである、請求項６に記載のエクソソームの製造方法。
請求項１〜７のいずれか一項に記載のエクソソームの製造方法によって得られる、エクソソーム。