CN109444102B - 一种检测赭曲霉毒素a的荧光生物传感器及其制备方法和应用 - Google Patents
一种检测赭曲霉毒素a的荧光生物传感器及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及生物传感器技术领域，特别涉及基于滚环扩增介导催化发夹自组装和内切酶反馈放大方法检测赭曲霉毒素A的荧光生物传感器。该发明的检测方式是荧光法检测，利用荧光仪。在检测之前，先将挂锁探针和连接探针形成环形模板探针。然后将目标物加入到复合探针I、复合探针II和HP2、HP3的均相溶液，在37℃孵育120 min，目标物与适配体序列绑定。在phi29 DNA聚合酶和核酸内切酶IV作用下完成多倍数反馈放大过程，从而实现信号的放大。然后用荧光仪设置激发波长为399 nm，检测610 nm处荧光强度，检测范围为560 nm‑640 nm。同时本发明还提供了该生物传感器的制备方法，该方法反应条件温和，易于操作。
Description
技术领域
本发明涉及生物传感器技术领域，特别涉及基于滚环扩增介导催化发夹自组装和内切酶反馈放大方法检测赭曲霉毒素A的荧光生物传感器，还涉及其制备方法。
背景技术
赭曲霉毒素（Ochratoxins，OT）是由曲霉菌、青霉菌等菌属产生的一类低分子量的次级代谢产物，属于真菌毒素组的天然污染物。其在农作物生产、加工、储存等过程中均能存在，其中，赭曲霉毒素A（Ochratoxin A，OTA）是毒性最强、分布最广的一类，20世纪60年代在南非的玉米粉中被发现。多项研究表明，OTA具有肾毒性、肝毒性、胚胎毒性、致畸形、神经毒性、免疫毒性、遗传毒性和致癌性。国际癌症研究机构（IARC）根据几项动物研究中发现的大量致癌性证据，将OTA列为可能的人类致癌物（2B类）。此外，联合国粮农组织（FAO）估计，世界上约有25%的谷物受到霉菌毒素的污染。
由于OTA具有痕量、剧毒、污染情形较复杂等特点，使实际检测存在较大难度，建立灵敏、高效的检测方法对于研究OTA的污染状况、有效降低其危害及制定各种实际样品中OTA的限量标准具有重要意义。
传统的检测OTA的方法主要有：光学分析法、电泳法、色谱法。但存在以下缺点：检测精度相对较低；检测时间较长，操作复杂；检测仪器昂贵，成本高。
发明内容
为了解决以上现有技术中检测赭曲霉毒素A（OTA）的方法特异性和灵敏度都比较低、检测周期长的问题，本发明提供了一种特异性和灵敏度高、检测速度快的基于滚环扩增介导催化发夹自组装和内切酶反馈放大方法检测赭曲霉毒素A的荧光生物传感器。同时还提供了该荧光生物传感器的制备方法。
一种检测赭曲霉毒素A的荧光生物传感器，包括OTA适配体、目标物、复合探针I、复合探针II、HP2、HP3、phi29 DNA 聚合酶、核酸内切酶IV、dNTP以及缓冲液；
所述复合探针I为OTA适配体、拱形探针与环形模板杂交而成；
所述复合探针II为环形模板与HP1杂交而成；
所述的环形模板探针由挂锁探针与连接探针形成；
所述的挂锁探针序列如SEQ No.1所示；
所述的连接探针序列如SEQ No.2所示；
所述的OTA适配体序列如SEQ No.3所示；
所述的拱形探针序列如SEQ No.4所示
所述的HP1序列如SEQ No.5所示；
所述的HP2序列如SEQ No.6所示；
所述的HP3序列如SEQ No.7所示。
所述的挂锁探针的5'端磷酸化。
所述的环形模板探针的制备工艺为：
S1 挂锁探针、连接探针在10×T4 DNA连接酶反应缓冲液中变性；所述的缓冲液为50 mM Tris-HCl，10 mM MgCl2，10 mM DTT，1 mM OTA，pH7.5；
S2加入3 μL 400 U/μL T4 DNA连接酶，并在20 ℃孵育2 h；
S3在65 ℃热处理10分钟使T4 DNA连接酶失活，同时使连接反应液终止；
S4加入核酸外切酶Ⅰ、核酸外切酶Ⅲ，在37 ℃水浴反应1 h，然后热处理使外切酶失活， 4 ℃保存待用。
所述复合探针I的制备工艺为：将灭菌水、环形模板、 arch probe、OTA aptamer、PBS缓冲液，在37℃孵育，使环形模板与探针链充分杂交，制备成复合探针I。
所述复合探针II的制备工艺为：环形模板、HP1、PBS缓冲液，在37℃孵育，使环形模板与探针链充分杂交，制备成复合探针II。
上述生物传感器的制备方法，包括以下步骤：
（1）NMM溶液配制；所述的NMM为N-methyl mesoporphyrin IX的缩写，称取NMM粉末0.0009 g，溶于90 μL二甲基亚砜中，于-20 ℃保存；
（2）将目标物与复合探针I、复合探针II、HP2、HP3、NMM溶液、phi29 DNA 聚合酶、核酸内切酶IV、dNTP加入缓冲液中，混合均匀；37 ℃，孵育120 min；
（3）荧光检测；激发波长设置为399 nm，发射波长为610 nm，检测范围560 nm-640nm，读取荧光信号变化。
所述的步骤（2）的缓冲液为50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 10 mM (NH4)2SO4, 4mM DTT, pH 7.5。
该发明的检测方式是荧光法检测，利用荧光仪。在检测之前，先将挂锁探针和连接探针形成环形模板探针。然后将目标物加入到复合探针I、复合探针II和HP2、HP3的均相溶液，在37 ℃孵育120 min，目标物与适配体序列绑定。在phi29 DNA 聚合酶和核酸内切酶IV作用下完成多倍数反馈放大过程，从而实现信号的放大。然后用荧光仪设置激发波长为399nm，检测610 nm处荧光强度，检测范围为560 nm-640 nm。
本发明基于核酸适配体探针与目标物赭曲霉毒素A的特异性识别，phi29 DNA聚合酶展示了两种不同功能：外切酶活性及聚合复制延伸活性。该传感器具有检测速度快，检测限低，特异性高等优点，可以弥补OTA现有检测方法的缺陷与不足，实现对其快速，准确的定量检测。
本发明中一共用到了7条DNA链，其序列分别是：
OTA适配体（S1）: GATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATCGGACA
TTTTTT-Inverted dT
拱形探针（S2）: GATATCAGCGATGGCCGATGCTTTTTTTCACCCGATC
挂锁探针padlock probe: P-CTGATATCCGTCCCTTTGGGTAGGGAGAGACTGGACGT
CCCTTTGGGTAGGGAGAGACTGGACCATCG
连接探针: ACGGATATCAGCGATGGTCCAGT
HP1: GATATCAGCGATGGGTAXCGGCTTGAGATGTTAGGGACGAGTGCGCACTCCAC
AAGGCACTCGTCCCTGGGTGGGT-inverted dT
HP2: GGGTGGGTCTTGTGGAGTGCGCTTGAGATGTTGCACTCGTCCCTAACATCTC
AAGCCGTTACTTTTTT-inverted dT
HP3: GGGTGGGTAGGGACGAGTGCCTTGTGGAGTGCGCACGTGCAACATCTCAA
GCGCACTCCACAAGGGGTGGGT-inverted dT
其中斜体的部分则是不同探针与环形模板的杂交序列，3’端修饰的Inverted dT即反向dT用于抑制降解作用。在padlock probe中的p表示一个5’磷酸基团的修饰，用于在T4 DNA连接酶的作用下，与3’端的羟基形成磷酸二酯键，构成环形模板。发夹探针（HP1、HP2、HP3）中下划线表示自杂交形成发夹的茎端，加粗部分代表能够形成G四联体的两段序列，在反应体系中通过邻近，使两段序列靠近形成G四联体。此外，HP1中X表示无嘌呤无嘧啶位点（AP位点）。
本发明中OTA的检测是在均相溶液中实现的，通过phi29 DNA 聚合酶、核酸内切酶IV的配合实现双重信号放大，从而实现OTA的高灵敏检测，并获得较低的检测下限。
（二）均相中发生的反应主要有：环形模板及复合物探针的制备；适配体与目标物OTA的识别过程；滚环扩增介导催化发夹自组装及内切酶反馈信号放大反应。
（1）环形模板及复合探针的制备。线性挂锁探针与连接探针结合，在T4 DNA连接酶的作用下，形成环形模板-连接引物的复合体，当有核酸外切酶I和外切酶III存在时，对引物进行消化，从而形成环形模板备用。arch probe能够与制备好的环状模板通过碱基互补配对，结合aptamer形成复合探针I；而HP1能够与制备好的环状模板结合形成复合探针II（CT-HP1）。
（2）目标物OTA的识别。当有目标物存在时，目标物能够与aptamer结合，使archprobe的3’端暴露，同时phi29 DNA聚合酶能够水解游离的不匹配碱基，使不成熟引物转化成成熟引物。
（3）滚环扩增介导催化发夹自组装及内切酶反馈信号放大反应。上述反应产生的RCA前体能够进行滚环扩增反应，产生的RCA产物中包括一段能够打开复合探针I中HP1的序列形成复合体；再加入HP2，HP3，形成Y字形三通路结构，其中HP1中3’末端序列和HP3中5’末端序列相邻能够形成G四联体结构，HP2中5’末端序列和HP3中3’末端序列相邻能够形成G四联体结构，NMM嵌入其中使荧光信号增强。
HP1中的AP位点嵌入到HP1-HP2形成的双链中，在核酸内切酶IV的作用下，切断AP位点，同时产生未成熟引物-环状模板前体。此时，phi29 DNA聚合酶能够水解游离的不匹配碱基，使不成熟引物转化成成熟引物，触发新一轮的滚环扩增，实现多倍数放大循环的反馈滚环扩增。
本发明的有益效果：
1、特异性识别
利用适配体与赭曲霉毒素A特异性识别作用、phi29 DNA聚合酶的3’-5’外切酶活性实现反馈放大以及核酸内切酶IV的辅助作用实现了对目标物的高特异性检测；
2、 灵敏度高
利用了核酸内切酶IV的切割位点（AP位点），实现定位切割，释放转化更多引物进入到新一轮的RCA反应中；RCA产物能够打开发夹，从而实现催化发夹自组装放大过程，形成三通路结构，末端序列富含碱基G，能够形成G-四联体，嵌入NMM使其荧光增强；利用phi29DNA聚合酶的聚合作用和3’-5’外切酶活性，在实现滚环扩增放大作用的同时实现反馈再放大以及核酸内切酶放大，实现了荧光信号放大，提高了检测的灵敏度，实现对目标物赭曲霉毒素A的超灵敏性检测；
3、反应温和、速度快
该传感器的反应条件温和，反应速度快；由于使用荧光法，其检测方法操作简便、检测周期短；检测原理的主要过程均是在均相中实现的，提高了反应速度，降低了操作的复杂程度，实现了目标物的快速、简单检测；制备方法简单，性能稳定；
4、 重复性好，适合工业化
荧光检测的重复性好，适用于与食品安全相关的赭曲霉毒素A的检测和生物传感器产业化的实际应用；制作该生物传感器的工艺成本低，适用于产业化中价廉的要求。
附图说明
图1为该试验的原理图；
图2为实施例2的检测结果图；
图3为实施例3的检测结果图；
图4为实施例4的检测结果图；
图5为实施例5的检测结果图。
图6为实施例6中检测OTA的标准曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明。
实施例1 环形模板及复合探针的制备
配制含50 mM Tris-HCl，10 mM MgCl2，10 mM DTT和1 mM OTA的T4 DNA连接酶反应缓冲液。配制含10 mM Na2HPO4, 10 mM NaH2PO4, 140 mM NaCl, 1 mM KCl, 1 mM MgCl2,1 mM CaCl2, pH=7.4的PBS缓冲液。
（1）将42 μL灭菌水，6 μL线性模板（100 μM），6 μL连接探针（100 μM）和6 μL 10×的T4 DNA连接酶缓冲液混匀，95℃变性5 min，然后慢慢冷却至室温完成杂交，然后在反应体系里添加3 μL T4 DNA连接酶（60 U/μL），将其在16℃下反应20小时；之后，反应体系在65℃温度条件下水浴15分钟，灭活体系中的T4 DNA连接酶。
（2）向上述反应体系中加入1 μL核酸外切酶Ⅰ（20 U/μL）和2 μL的核酸外切酶Ⅲ（100 U/μL）37℃下反应2 h；再将反应体系85℃水浴加热10 min，得环形模板，4℃条件下保藏备用。
（3）将10 μL灭菌水，25 μL环形模板（10 μM），2.5 μL arch probe（100 μM），2.5 μL OTA aptamer（100 μM）, 10 μL 5×PBS缓冲液加入到EP管中，在37℃孵育40 min，使环形模板与探针链充分杂交，制备成复合探针I；以相同方法，将6 μL环形模板（10 μM），6 μLHP1（10 μM）12 μL 5×PBS缓冲液加入到EP管中，在37℃孵育40 min制备成复合探针II。
实施例2 荧光强度随核酸内切酶IV浓度的变化
一种本发明所述荧光生物传感器的制备方法，包括以下步骤：
（1）将3 μL复合探针I（0.1 μM）、3 μL复合探针II（0.5 μM）、3 μL HP2（0.5 μM）、3μL HP3（0.5 μM）、3 μL phi29 DNA聚合酶（1 U/μL）、3 μL核酸内切酶IV（浓度分别为0.1 U/μL、0.2 U/μL 、0.25 U/μL、0.5 U/μL、0.75 U/μL、1 U/μL）、3 μL NMM（2.4 μM）、2 μL dNTP（1 mM）、在3 μL缓冲液（50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 10 mM (NH4)2SO4, 4 mM DTT, pH7.5）中混合后分别加入OTA（100 ng/μL），混匀后37℃恒温反应120 min；
（3）将步骤（2）所得溶液加水稀释至100 μL，将然后进行荧光检测；激发波长设置为399 nm，发射波长为610 nm，检测范围560 nm-640 nm，读取荧光信号变化。
检测结果见图2，从图中可以看出，随着核酸内切酶IV量的增加，荧光强度不断增强，在核酸内切酶IV量达到0.5 U/μL之后，荧光强度基本不变。
上述过程中用到的溶液的制备方法：
超纯水均需进行高温灭菌处理。具体方法是，将超纯水分别放置在锥形瓶中，然后用锡箔纸和报纸进行封口。在高压灭菌锅中在120 ℃的温度下灭菌20 min。10×缓冲液（buffer）是随聚合酶一起购置，可直接使用。
实施例3 荧光强度随phi29 DNA聚合酶浓度的变化
一种本发明所述荧光生物传感器的制备方法，包括以下步骤：
（1）将3 μL复合探针I（0.1 μM）、3 μL复合探针II（0.5 μM）、3 μL HP2（0.5 μM）、3μL HP3（0.5 μM）、3 μL phi29 DNA聚合酶（浓度分别为0.1 U/μL、0.2 U/μL、0.5 U/μL、1 U/μL、1.5 U/μL、2 U/μL）、3 μL核酸内切酶IV（0.5 U/μL）、3 μL NMM（2.4 μM）、2 μL dNTP（1mM）、在3 μL缓冲液（50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 10 mM (NH4)2SO4, 4 mM DTT, pH7.5）中混合后分别加入OTA（100 ng/μL），混匀后37℃恒温反应120 min；
（3）将步骤（2）所得溶液加水稀释至100 μL，将然后进行荧光检测；激发波长设置为399 nm，发射波长为610 nm，检测范围560 nm-640 nm，读取荧光信号变化。
检测结果见图3，从图中可以看出，随着phi29 DNA聚合酶量的增加，荧光强度不断增强，在phi29 DNA聚合酶量达到1 U/μL之后，荧光强度基本不变。
上述过程中用到的溶液的制备方法：
超纯水均需进行高温灭菌处理。具体方法是，将超纯水分别放置在锥形瓶中，然后用锡箔纸和报纸进行封口。在高压灭菌锅中在120 ℃的温度下灭菌20 min。10×缓冲液（buffer）是随聚合酶一起购置，可直接使用。
实施例4 荧光强度随NMM浓度的变化
一种本发明所述荧光生物传感器的制备方法，包括以下步骤：
（1）将3 μL复合探针I（0.1 μM）、3 μL复合探针II（0.5 μM）、3 μL HP2（0.5 μM）、3μL HP3（0.5 μM）、3 μL phi29 DNA聚合酶（1 U/μL）、3 μL核酸内切酶IV（0.5 U/μL）、3 μLNMM（浓度分别为0.6 μM 、1.2 μM 、1.8 μM 、2.4 μM、3.0 μM、 3.6 μM）、2 μL dNTP（1 mM）、在3 μL缓冲液（50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 10 mM (NH4)2SO4, 4 mM DTT, pH 7.5）中混合后分别加入OTA（100 ng/μL），混匀后37℃恒温反应120 min；
（3）将步骤（2）所得溶液加水稀释至100 μL，将然后进行荧光检测；激发波长设置为399 nm，发射波长为610 nm，检测范围560 nm-640 nm，读取荧光信号变化。
检测结果见图4，从图中可以看出，随着NMM量的增加，荧光强度不断增强，在NMM量达到2.4 μM之后，荧光强度基本不变。
上述过程中用到的溶液的制备方法：
超纯水均需进行高温灭菌处理。具体方法是，将超纯水分别放置在锥形瓶中，然后用锡箔纸和报纸进行封口。在高压灭菌锅中在120 ℃的温度下灭菌20 min。10×缓冲液（buffer）是随聚合酶一起购置，可直接使用。
实施例5 荧光强度随反应时间的变化
一种本发明所述荧光生物传感器的制备方法，包括以下步骤：
（1）将3 μL复合探针I（0.1 μM）、3 μL复合探针II（0.5 μM）、3 μL HP2（0.5 μM）、3μL HP3（0.5 μM）、3 μL phi29 DNA聚合酶（1 U/μL）、3 μL核酸内切酶IV（0.5 U/μL）、3 μLNMM（2.4 μM）、2 μL dNTP（1 mM）、在3 μL缓冲液（50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 10 mM(NH4)2SO4, 4 mM DTT, pH 7.5）中混合后分别加入OTA（100 ng/μL），混匀后37℃恒温反应时间分别为30 min、60 min、90 min、120 min、150 min。
（3）将步骤（2）所得溶液加水稀释至100 μL，将然后进行荧光检测；激发波长设置为399 nm，发射波长为610 nm，检测范围560 nm-640 nm，读取荧光信号变化。
检测结果见图5，从图中可以看出，随着反应时间的增加，荧光强度不断增强，在反应时间达到120 min之后，荧光强度基本不变。
上述过程中用到的溶液的制备方法：
超纯水均需进行高温灭菌处理。具体方法是，将超纯水分别放置在锥形瓶中，然后用锡箔纸和报纸进行封口。在高压灭菌锅中在120 ℃的温度下灭菌20 min。10×缓冲液（buffer）是随聚合酶一起购置，可直接使用。
实施例6 对OTA的检测
一种本发明所述荧光生物传感器的制备方法，包括以下步骤：
（1）将3 μL复合探针I（0.1 μM）、3 μL复合探针II（0.5 μM）、3 μL HP2（0.5 μM）、3μL HP3（0.5 μM）、3 μL phi29 DNA聚合酶（1 U/μL）、3 μL核酸内切酶IV（0.5 U/μL）、3 μLNMM（2.4 μM）、2 μL dNTP（1 mM）、在3 μL缓冲液（50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 10 mM(NH4)2SO4, 4 mM DTT, pH 7.5）中混合后分别加入不同浓度的OTA（0.01 ng/μL、0.1 ng/μL、1 ng/μL、10 ng/μL、100 ng/μL），混匀后37℃恒温反应120 min。
（3）将步骤（2）所得溶液加水稀释至100 μL，将然后进行荧光检测；激发波长设置为399 nm，发射波长为610 nm，检测范围560 nm-640 nm，读取荧光信号变化。检测结果见图6。
上述过程中用到的溶液的制备方法：
超纯水均需进行高温灭菌处理。具体方法是，将超纯水分别放置在锥形瓶中，然后用锡箔纸和报纸进行封口。在高压灭菌锅中在120 ℃的温度下灭菌20 min。10×缓冲液（buffer）是随聚合酶一起购置，可直接使用。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受实施例的限制，其它任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、组合、替代、简化均应为等效替换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 济南大学
<120>一种检测赭曲霉毒素A的荧光生物传感器及其制备方法和应用
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 68
<212> DNA
<213> 人工序列(artiartificial sequence)
<400> 1
ctgatatccg tccctttggg tagggagaga ctggacgtcc ctttgggtag ggagagactg 60
gaccatcg 68
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213>人工序列(artiartificial sequence)
<400> 2
acggatatca gcgatggtcc agt 23
<210> 3
<211> 42
<212> DNA
<213>人工序列(artiartificial sequence)
<400> 3
gatcgggtgt gggtggcgta aagggagcat cggacatttt tt 42
<210> 4
<211> 37
<212> DNA
<213>人工序列(artiartificial sequence)
<400> 4
gatatcagcg atggccgatg ctttttttca cccgatc 37
<210> 5
<211> 75
<212> DNA
<213>人工序列(artiartificial sequence)
<400> 5
gatatcagcg atgggtacgg cttgagatgt tagggacgag tgcgcactcc acaaggcact 60
cgtccctggg tgggt 75
<210> 6
<211> 68
<212> DNA
<213>人工序列(artiartificial sequence)
<400> 6
gggtgggtct tgtggagtgc gcttgagatg ttgcactcgt ccctaacatc tcaagccgtt 60
actttttt 68
<210> 7
<211> 72
<212> DNA
<213>人工序列(artiartificial sequence)
<400> 7
gggtgggtag ggacgagtgc cttgtggagt gcgcacgtgc aacatctcaa gcgcactcca 60
caaggggtgg gt 72
Claims (8)
1.一种检测赭曲霉毒素A的荧光生物传感器，其特征在于，包括OTA适配体、目标物、复合探针I、复合探针II、HP2、HP3、phi29 DNA 聚合酶、核酸内切酶IV、dNTP以及缓冲液；
所述复合探针I为OTA适配体、拱形探针与环形模板杂交而成；
所述复合探针II为环形模板与HP1杂交而成；
所述的环形模板探针由挂锁探针与连接探针形成；
所述的挂锁探针序列如SEQ No.1所示；
所述的连接探针序列如SEQ No.2所示；
所述的OTA适配体序列如SEQ No.3所示；
所述的拱形探针序列如SEQ No.4所示
所述的HP1序列如SEQ No.5所示；
所述的HP2序列如SEQ No.6所示；
所述的HP3序列如SEQ No.7所示。
2.根据权利要求1所述的荧光生物传感器，其特征在于，所述的挂锁探针的5'端磷酸化。
3.根据权利要求1所述的荧光生物传感器，其特征在于，所述的环形模板探针的制备工艺为：
S1 挂锁探针、连接探针在10×T4 DNA连接酶反应缓冲液中变性；所述的缓冲液为50mM Tris-HCl，10 mM MgCl2，10 mM DTT，1 mM OTA，pH7.5；
S2加入3 μL 400 U/μL T4 DNA连接酶，并在20 ℃孵育2 h；
S3在65 ℃热处理10分钟使T4 DNA连接酶失活，同时使连接反应液终止；
S4加入核酸外切酶Ⅰ、核酸外切酶Ⅲ，在37 ℃水浴反应1 h，然后热处理使外切酶失活，4 ℃保存待用。
4.根据权利要求1所述的荧光生物传感器，其特征在于，所述复合探针I的制备工艺为：将灭菌水、环形模板、 拱形探针、OTA适配体、PBS缓冲液，在37℃孵育，使环形模板与探针链充分杂交，制备成复合探针I。
5.根据权利要求1所述的荧光生物传感器，其特征在于，所述复合探针II的制备工艺为：环形模板、HP1、PBS缓冲液，在37℃孵育，使环形模板与探针链充分杂交，制备成复合探针II。
6.一种权利要求1-5任一所述的生物传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）NMM溶液配制；所述的NMM为N-methyl mesoporphyrin IX的缩写，称取NMM粉末0.0009 g，溶于90 μL二甲基亚砜中，于-20 ℃保存；
（2）将目标物与复合探针I、复合探针II、HP2、HP3、NMM溶液、phi29 DNA 聚合酶、核酸内切酶IV、dNTP加入缓冲液中，混合均匀；37 ℃，孵育120 min；
（3）荧光检测；激发波长设置为399 nm，发射波长为610 nm，检测范围560 nm-640 nm，读取荧光信号变化。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤（2）的缓冲液为50 mMTris-HCl, 10 mM MgCl2, 10 mM (NH4)2SO4, 4 mM DTT, pH 7.5。
8.一种权利要求1所述的荧光生物传感器在检测农作物生产、加工、储存过程中的赭曲霉毒素A上的应用。
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