CN110592181A - 一种基于sers检测赭曲霉毒素a的方法 - Google Patents

一种基于sers检测赭曲霉毒素a的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于SERS检测赭曲霉毒素A的方法。其包括将sDNA固定在AuNanostar@4‑MBA@Au核壳纳米金星表面作为SERS捕获探针的制备，并将发夹DNA固定在磁珠表面。利用OTA和OTA适配体的高亲和力，以及Exo III循环放大作用，使得大量的AuNanostar@4‑MBA@Au核壳纳米金星SERS捕获探针连接至磁珠表面。从而检测得到的SERS的强度与OTA的浓度有着密切关系，即开发了“开启”模式的SERS适配体传感器用于超敏感OTA检测。本发明提供的检测方法对赭曲霉毒素的检测具有成本低廉，增强型，检测灵敏度高，检测线低，抗干扰性好的特点。

Description

一种基于SERS检测赭曲霉毒素A的方法
技术领域
本发明属于分析检测技术领域，具体涉及一种基于SERS检测赭曲霉毒素A的方法，应用于毒素检测领域。
背景技术
赭曲霉毒素A（OTA）是一种真菌毒素，作为曲霉菌和青霉菌等丝状真菌的次级代谢产物，作为食品危害物质引起了越来越多的关注。OTA常见于谷物和其他食品储存过程中，因为它们具有致癌，致畸，致突变和免疫抑制特性，所以过量摄入OTA可能会导致急性或慢性疾病发作甚至死亡。因此，迫切需要开发一种简单，灵敏的方法来测定受污食品中的OTA。
近年来，OTA检测技术发展迅速，包括高效液相色谱(HPLC)、质谱(MS)、HPLC-MS/MS、荧光、电化学、表面增强拉曼光谱法（SERS）等，其中SERS方法由于检测灵敏度高，得到了广泛的应用。但是，大部分SERS传感器用于检测OTA都是“关闭”模式，检测过程可能存在假阳性反应。因此，有必要研制一种用于OTA超灵敏检测的“开启”模式SERS传感器。
在此，基于AuNS@4-MBA@Au SERS探针与Exo III辅助循环扩增相结合，构建了一种新型的“开启”模式SERS适配体传感器用于超灵敏OTA检测。在OTA存在下，从dsDNA（OTA-适体/cDNA）释放cDNA。释放的cDNA可以与磁珠表面的发夹DNA杂交形成dsDNA，其被Exo III消化释放cDNA，释放的cDNA可以进一步与发夹DNA杂交以实现循环扩增，导致在磁珠表面留下大量短ssDNA。磁珠表面留下大量短ssDNA可以与AuNS@4-MBA@Au表面的sDNA一起孵育形成磁珠/dsDNA/AuNanostar@4-MBA@Au组件，从而在磁珠表面产生强烈的SERS信号。开发的SERS适配体传感器为食品检测提供了一种很有前景的工具。
发明内容
本发明目的在于提供一种基于SERS检测赭曲霉毒素A的方法。本发明的传感器结构简单、灵敏度高、选择性好，为食品安全方面提供了一种高灵敏、低成本检测赭曲霉毒素A的方法。
为了实现本发明目的，本发明利用OTA适配体的特殊碱基对能够与OTA特异性结合，再利用Exo III的辅助循环扩增作用，以及AuNanostar@4-MBA@Au高灵敏高稳定的SERS信号强度，实现对赭曲霉毒素A进行高灵敏分析检测。具体方法包括以下步骤：在OTA存在下，由于OTA和OTA适配体的更高亲和力，cDNA将从dsDNA（5uL, 2uM OTA-适配体和5uL, 2uMcDNA杂交形成）释放出来；释放的cDNA与磁珠/发夹DNA一起孵育形成dsDNA，在Exo III作用下该dsDNA中发夹DNA的3'末端将被剪切，导致cDNA释放，并进一步与发夹DNA杂交以实现循环扩增，导致在磁珠表面留下大量短的ssDNA，制得磁珠/ssDNA；磁珠/ssDNA与AuNanostar@4-MBA@Au/sDNA孵育形成磁/dsDNA/AuNanostar@4-MBA@Au组件；最后，取磁珠/dsDNA/AuNanostar@4-MBA@Au组件溶液滴在硅片上，烘干即可检测其SERS信号。
一种AuNanostar@4-MBA@Au/sDNA SERS捕获探针的制备方法，包括以下步骤：
（1）金种的合成：往25mL的圆底烧瓶中依次加入5 mL, 0.1 M曲拉通、5 mL, 0.5 mM氯金酸溶液，300r/min搅拌混匀，然后提高转速至800r/min加入冰水新制的0.6 mL, 0.01 M硼氢化钠，反应2min，静置1h后制得金种溶液；
（2）AuNanostar的生长：往25mL的圆底烧瓶中依次加入10 mL, 0.1 M曲拉通、10 mL,0.5 mM氯金酸溶液，300r/min搅拌混匀，接着，提高转速至800r/min，依次加入步骤（1）制备得到的金种12 μL，0.5 mL, 1 mM硝酸银和0.6 mL, 0.0788 M抗坏血酸溶液，反应1min，静置1h后得到AuNanostar；
（3）通过Au-S键将1mL，2mM 4-MBA拉曼信号分子共价键合至上述AuNanostar表面，400r/min反应30min，制得AuNanostar@4-MBA；
（4）往25mL的圆底烧瓶中依次加入1mL,2v/v%吐温-20，2.5mL,0.5 mM氯金酸和步骤（3）制备得到的AuNanostar@4-MBA 1mL，300r/min搅拌混匀，提高转速至800r/min，加入0.15mL，0.0788 M抗坏血酸溶液，反应10min制得AuNanostar@4-MBA@Au SERS探针；
（5）通过Au-S键将10 uL, 10 uM巯基修饰的sDNA，37℃下孵育12h键合至100 uL 步骤（4）制备得到的AuNanostar@4-MBA@Au表面制得AuNanostar@4-MBA@Au/sDNA SERS捕获探针。
步骤（5）所述sDNA的序列如下：
sDNA：5'- SH-TTTTTTCACGCGCG -3'。
进一步地，利用所述的AuNanostar@4-MBA@Au/sDNA SERS捕获探针检测赭曲霉毒素A，包括以下步骤：
（1）链霉亲和素修饰的磁珠（美国普洛麦格公司购买）预处理：取100uL链霉亲和素修饰的磁珠，用含有0.05v/v%终浓度吐温-20的PBS缓冲液洗涤磁珠三遍后，将磁珠分散于100uL，1×B2缓冲液中；
（2）制备磁珠/发夹DNA：将15uL，10uM生物素修饰的发夹DNA与步骤（1）制备得到的预处理磁珠混合，37℃下孵育1h，用含有0.05v/v%终浓度吐温-20的PBS缓冲液洗涤磁珠三遍后，磁铁分离后，分散在100uL，1×B2缓冲液中制得磁珠/发夹DNA；
（3）将OTA配制成浓度为0-1000 pg/mL的溶液，将5 uL 不同浓度的OTA溶液与10uL,1uM的dsDNA 在37℃下孵育2h，由于OTA和OTA适配体具有更高亲和力，使cDNA从适配体dsDNA中释放出来；
（4）在37℃下，加入25uL步骤（2）制备得到的磁珠/发夹DNA，一起孵育形成发夹dsDNA，同时加入1uL，20U/mL Exo III，在该酶的作用下发夹dsDNA中发夹DNA的3'末端将被剪切，导致cDNA释放，并进一步与发夹DNA杂交以实现循环扩增，导致在磁珠表面留下大量短的ssDNA，反应2h制得磁珠/ssDNA；
（5）将25uL步骤（4）磁珠/ssDNA与50uL的AuNanostar@4-MBA@Au/sDNA，在37℃下孵育6h形成磁珠/dsDNA/AuNanostar@4-MBA@Au组件；最后，取磁珠/dsDNA/AuNanostar@4-MBA@Au组件溶液5uL滴在硅片上，在37℃下烘干检测其SERS信号。
所述发夹DNA的序列为：
5'-Biotin-TTTTTTCGCGCGTGTCATTCCCTGCATCGGACAGGAATGACACGCTTTTT -3'。
所述1×B2缓冲液配方为：含有终浓度10 mM tris, 50 mM NaCl, 10 mM MgCl2,10 mM KCl, pH = 7.4。
所述适配体dsDNA 是由OTA-适配体和cDNA在37℃杂交形成；所述OTA-适配体序列为：5'-GATCGGGTGTGGGTGGCGTAA AGGGAGCATCGGACA AAAAAA -3'；所述cDNA序列为：5'- AAAAAGCGTGTCATTCCTGTCCGATGCTCAAAAA -3。
所述发夹dsDNA是由cDNA与发夹DNA杂交形成。
本发明相对于现有技术具有如下有益效果：
（1）本发明选用AuNanostar@4-MBA@Au作SERS探针，纳米金星具有大的表面积和针尖效应提高了检测灵敏度，以及用金壳作信号分子的保护层提高了检测灵敏度和稳定性。
（2）本发明利用OTA能够与OTA适配体特异性结合，形成稳定的结构，提高了OTA适配体传感器的选择性其在实际样品中的实用性。
（3）本发明将Exo III目标循环扩增信号放大技术应用到OTA的检测中来，在实现高灵敏地对OTA进行检测（检测限达到0.25 fM）的同时还具有操作简便，低成本等优点。
（4）本发明设计了一种“开启”模式用于OTA超灵敏检测的SERS传感器，避免了检测过程可能存在假阳性反应。
附图说明
图1为本发明一种基于SERS检测赭曲霉毒素A的方法原理示意图。
图2为本发明SERS探针表征图。
图3为本发明OTA SERS传感器对不同浓度的OTA的SERS响应。
具体实施方式
实施例1
引物：
1、AuNanostar@4-MBA@Au/sDNA SERS捕获探针的制备：
（1）金种的合成：往25mL的圆底烧瓶中依次加入5 mL, 0.1 M曲拉通、5 mL, 0.5 mM氯金酸溶液，300r/min搅拌混匀，然后提高转速至800r/min加入冰水新制的0.6 mL, 0.01 M硼氢化钠，反应2min，静置1h后制得金种溶液；
（2）AuNanostar的生长：往25mL的圆底烧瓶中依次加入10 mL, 0.1 M曲拉通、10 mL,0.5 mM氯金酸溶液，300r/min搅拌混匀，接着，提高转速至800r/min，依次加入步骤（1）制备得到的金种12 μL，0.5 mL, 1 mM硝酸银和0.6 mL, 0.0788 M抗坏血酸溶液，反应1min，静置1h后得到AuNanostar；
（3）通过Au-S键将1mL，2mM 4-MBA拉曼信号分子共价键合至上述AuNanostar表面，400r/min反应30min，制得AuNanostar@4-MBA；
（4）往25mL的圆底烧瓶中依次加入1mL,2v/v%吐温-20，2.5mL,0.5 mM氯金酸和步骤（3）制备得到的AuNanostar@4-MBA 1mL，300r/min搅拌混匀，提高转速至800r/min，加入0.15mL，0.0788 M抗坏血酸溶液，反应10min制得AuNanostar@4-MBA@Au SERS探针；
（5）通过Au-S键将10 uL, 10 uM巯基修饰的sDNA，37℃下孵育12h键合至100 uL 步骤（4）制备得到的AuNanostar@4-MBA@Au表面制得AuNanostar@4-MBA@Au/sDNA SERS捕获探针。
图2为制备得到的AuNanostar@4-MBA@Au/sDNA SERS探针表征图。（图2中A、B、C分别表示a:AuNanostar，b:AuNanostar@4-MBA，c:AuNanostar@4-MBA@Au的紫外光谱图、拉曼光谱图、TEM图）。
2、利用AuNanostar@4-MBA@Au/sDNA SERS捕获探针检测赭曲霉毒素A：
（1）链霉亲和素修饰的磁珠预处理：取100uL链霉亲和素修饰的磁珠，用含有0.05v/v%终浓度吐温-20的PBS缓冲液洗涤磁珠三遍后，将磁珠分散于100uL，1×B2缓冲液（含有终浓度10 mM tris, 50 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 10 mM KCl, pH = 7.4。）中；
（2）制备磁珠/发夹DNA：将15uL，10uM生物素修饰的发夹DNA与步骤（1）制备得到的预处理磁珠混合，37℃下孵育1h，用含有0.05v/v%终浓度吐温-20的PBS缓冲液洗涤磁珠三遍后，磁铁分离后，分散在100uL，1×B2缓冲液（含有终浓度10 mM tris, 50 mM NaCl, 10 mMMgCl2, 10 mM KCl, pH = 7.4。）中制得磁珠/发夹DNA；
（3）将OTA配制成浓度为0-1000 pg/mL的溶液（表1），将5 uL 不同浓度的OTA溶液与10uL, 1uM的适配体dsDNA 在37℃下孵育2h，由于OTA和OTA适配体具有更高亲和力，使cDNA从适配体dsDNA中释放出来；
（4）在37℃下，加入25uL步骤（2）制备得到的磁珠/发夹DNA，一起孵育形成发夹dsDNA，同时加入1uL，20U/mL Exo III，在该酶的作用下发夹dsDNA中发夹DNA的3'末端将被剪切，导致cDNA释放，并进一步与发夹DNA杂交以实现循环扩增，导致在磁珠表面留下大量短的ssDNA，反应2h制得磁珠/ssDNA；
（5）将25uL步骤（4）磁珠/ssDNA与50uL的AuNanostar@4-MBA@Au/sDNA，在37℃下孵育6h形成磁珠/dsDNA/AuNanostar@4-MBA@Au组件；最后，取磁珠/dsDNA/AuNanostar@4-MBA@Au组件溶液5uL滴在硅片上，在37℃下烘干检测其SERS信号。
（6）根据赭曲霉毒素A浓度和SERS的检测值（表1），计算得到其线性方程为y=964.06 lgCOTA+5668.48；如图3所示，其中y是SERS的检测值，COTA为其所对应的赭曲霉毒素A浓度,单位为pg ml-1。
表1 赭曲霉毒素A浓度和SERS的检测值
注：1586 cm-1峰位SERS强度。
实施例2 检出限计算
根据表2中空白实验组的SERS强度相应值，计算得到检出限为0.25 fM。
表2空白组SERS相应值
；
y= 964.06 lgCOTA+5668.48；
3 × S=A logC + B；
计算得检出限为0.25 fM。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 福州大学
<120> 一种基于SERS检测赭曲霉毒素A的方法
<130> 4
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ttttttcacg cgcg 14
<210> 2
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ttttttcgcg cgtgtcattc cctgcatcgg acaggaatga cacgcttttt 50
<210> 3
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gatcgggtgt gggtggcgta aagggagcat cggacaaaaa aa 42
<210> 4
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
aaaaagcgtg tcattcctgt ccgatgctca aaaa 34

Claims (7)

1.一种AuNanostar@4-MBA@Au/sDNA SERS捕获探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）金种的合成：往25mL的圆底烧瓶中依次加入5 mL, 0.1 M曲拉通、5 mL, 0.5 mM氯金酸溶液，300r/min搅拌混匀，然后提高转速至800r/min加入冰水新制的0.6 mL, 0.01 M硼氢化钠，反应2min，静置1h后制得金种溶液；
（2）AuNanostar的生长：往25mL的圆底烧瓶中依次加入10 mL, 0.1 M曲拉通、10 mL,0.5 mM氯金酸溶液，300r/min搅拌混匀，接着，提高转速至800r/min，依次加入步骤（1）制备得到的金种12 μL，0.5 mL, 1 mM硝酸银和0.6 mL, 0.0788 M抗坏血酸溶液，反应1min，静置1h后得到AuNanostar；
（3）通过Au-S键将1mL，2mM 4-MBA拉曼信号分子共价键合至上述AuNanostar表面，400r/min反应30min，制得AuNanostar@4-MBA；
（4）往25mL的圆底烧瓶中依次加入1mL,2v/v%吐温-20，2.5mL,0.5 mM氯金酸和步骤（3）制备得到的AuNanostar@4-MBA 1mL，300r/min搅拌混匀，提高转速至800r/min，加入0.15mL，0.0788 M抗坏血酸溶液，反应10min制得AuNanostar@4-MBA@Au SERS探针；
（5）通过Au-S键将10 uL, 10 uM巯基修饰的sDNA，37℃下孵育12h键合至100 uL 步骤（4）制备得到的AuNanostar@4-MBA@Au表面制得AuNanostar@4-MBA@Au/sDNA SERS捕获探针。
2.根据权利要求1所述一种AuNanostar@4-MBA@Au/sDNA SERS捕获探针的制备方法，其特征在于，步骤（5）所述sDNA的序列如下：
sDNA：5'- SH-TTTTTTCACGCGCG -3'。
3.一种利用权利要求1所述的AuNanostar@4-MBA@Au/sDNA SERS捕获探针检测赭曲霉毒素A的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）链霉亲和素修饰的磁珠预处理：取100uL链霉亲和素修饰的磁珠，用含有0.05v/v%终浓度吐温-20的PBS缓冲液洗涤磁珠三遍后，将磁珠分散于100uL，1×B2缓冲液中；
（2）制备磁珠/发夹DNA：将15uL，10uM生物素修饰的发夹DNA与步骤（1）制备得到的预处理磁珠混合，37℃下孵育1h，用含有0.05v/v%终浓度吐温-20的PBS缓冲液洗涤磁珠三遍后，磁铁分离后，分散在100uL，1×B2缓冲液中制得磁珠/发夹DNA；
（3）将OTA配制成浓度为0-1000 pg/mL的溶液，将5 uL 不同浓度的OTA溶液与10uL,1uM的dsDNA 在37℃下孵育2h，由于OTA和OTA适配体具有更高亲和力，使cDNA从适配体dsDNA中释放出来；
（4）在37℃下，加入25uL步骤（2）制备得到的磁珠/发夹DNA，一起孵育形成发夹dsDNA，同时加入1uL，20U/mL Exo III，在该酶的作用下发夹dsDNA中发夹DNA的3'末端将被剪切，导致cDNA释放，并进一步与发夹DNA杂交以实现循环扩增，导致在磁珠表面留下大量短的ssDNA，反应2h制得磁珠/ssDNA；
（5）将25uL步骤（4）磁珠/ssDNA与50uL的AuNanostar@4-MBA@Au/sDNA，在37℃下孵育6h形成磁珠/dsDNA/AuNanostar@4-MBA@Au组件；最后，取磁珠/dsDNA/AuNanostar@4-MBA@Au组件溶液5uL滴在硅片上，在37℃下烘干检测其SERS信号。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述发夹DNA的序列为：5'- Biotin-TTTTTTCGCGCGTGTCATTCCCTGCATCGGACAGGAATGACACGCTTTTT -3'。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述1×B2缓冲液配方为：含有终浓度10mM tris, 50 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 10 mM KCl, pH = 7.4。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述适配体dsDNA 是由OTA-适配体和cDNA在37℃杂交形成；所述OTA-适配体序列为：5'-GATCGGGTGTGGGTGGCGTAA AGGGAGCATCGGACAAAAAAA -3'；所述cDNA序列为：5'- AAAAAGCGTGTCATTCCTGTCCGATGCTCAAAAA -3。
7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述发夹dsDNA是由cDNA与发夹DNA杂交形成。
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