CN114317820A

CN114317820A - 基于不同散射光纳米颗粒构建的多种肝炎病毒标志物单颗粒可视化传感器

Info

Publication number: CN114317820A
Application number: CN202111585890.3A
Authority: CN
Inventors: 王健; 程茹; 祝福
Original assignee: Southwest University
Current assignee: Southwest University
Priority date: 2021-12-20
Filing date: 2021-12-20
Publication date: 2022-04-12

Abstract

本发明属于暗场显微成像技术领域，涉及磁珠、DNA、金纳米颗粒(AuNPs)构建的多靶标可视化传感器，可用于同时检测乙肝和丙肝病毒DNA。该方法基于磁珠与两种不同形貌的AuNPs组装的核壳卫星结构构建的一种新型的多靶物高灵敏检测策略。与其他类似传感器相比，该传感器的探针制备简单、成本低、检测灵敏度高，可同时检测人血清中乙肝病毒目标DNA和丙肝病毒目标DNA的含量，其测定结果与临床标准方法吻合，可推广应用于其他病毒目标DNA的检测。

Description

基于不同散射光纳米颗粒构建的多种肝炎病毒标志物单颗粒可视化传感器

技术领域

本发明属于暗场显微成像技术应用领域，具体涉及基于两种不同颜色光散射的金纳米颗粒(AuNPs)、磁珠(MBs)和DNA构建的可视化传感器用于同时检测两种病毒目标DNA，本发明以检测乙肝(HBV)病毒DNA和丙肝(HCV)病毒目标DNA为目标。

背景技术

单颗粒光散射显微镜，又称暗场显微镜(DFM)，用于获取等离子体纳米颗粒的光散射信号。与明场显微镜不同，单颗粒光散射显微镜上配备暗场聚光镜，只允许斜射的光照射到样品上，从而激发等离子体纳米颗粒使其发出散射光，因此该系统具有高信噪比、实时监控的特点。散射光经过物镜之后一部分被导入到真彩电荷耦合器件(CCD)相机内以获取暗场图像，另一部分散射光输入光谱仪可得到单个纳米颗粒的散射光谱。基于灵敏度高、可实时动态分析等特点，DMF已广泛用于蛋白质、核酸等生物分子的分析检测。

金纳米颗粒由于具有独特的局域表面等离激元共振特性、光学及电子属性可调、生物相容性好、制备简单、稳定、易于表面改性及修饰等优点，在生物传感领域被用于各种物质的检测，例如DNA、RNA、蛋白质、小分子、离子等。此外，金纳米颗粒近年来在生物制药、生物传感、医学、生物成像等领域得到了广泛的研究与应用。其形状与尺寸可控的性质使金纳米颗粒在多组分生物分析中大放异彩。金纳米颗粒作为一种优良的光学探针，由于其光散射光学性质可通过调节其大小、组成、形貌和微环境来控制，近年来被广泛应用于生化和药物分析。此外，金纳米颗粒具有独特的局域表面等离激元共振(LSPR)特性，可以实现单粒子水平的实时成像，具有高时空分辨率和高灵敏度。现如今，利用暗场显微成像技术对于一种疾病标志物的检测策略已经报道了很多，但利用该技术实现同时检测多种疾病标志物的报道还很少。实际上，在早期疾病诊断中，一种生物标志物的检测可能会导致诊断结果出现误差，因此需要开发一种多种疾病标志物同时检测的方法，以实现早期疾病的精确诊断。在利用暗场测定多靶物时，不可避免地存在非特异性吸附，引起结果的不准确。本工作中，避免非特异性吸附，我们先将靶物作用后再沉积，并且引入信号放大策略，进一步提高了检测方法的灵敏度。

发明内容

本发明针对单颗粒光散射显微成像DNA传感器，提出了一种新颖的基于不同形貌的金纳米颗粒、磁珠、DNA构建的多种肝炎病毒标志物单颗粒可视化传感器，也是可称为一种多元单颗粒光散射显微成像DNA传感器。本发明还基于所述传感器，提供了一种简单、便捷、低成本和高灵敏的方法用于同时检测乙肝病毒标志物DNA和丙肝病毒标志物DNA，能够用于检测人血清中乙肝病毒目标DNA和丙肝病毒目标DNA，与临床结果吻合，取得了满意的结果。

本发明所述的多种肝炎病毒标志物单颗粒可视化传感器，包括AuNSs-CpHCV-MBs和AuNRs-CpHBV-MBs两种探针组合；所述AuNSs-CpHCV-MBs由金纳米球颗粒和HCV病毒捕获链以及磁珠构建而成；所述AuNRs-CpHBV-MBs由金纳米棒颗粒和HBV病毒捕获链以及磁珠构建而成。其中，两种探针组合的磁珠浓度为1.125-1.375mg/mL；金纳米球颗粒浓度为0.040-0.055nM；金纳米棒颗粒浓度为0.045-0.065nM，每种金纳米颗粒与对应的病毒捕获链的原料比率为1：300-1：500。优选的，磁珠浓度为1.250mg/mL，金纳米球颗粒浓度为0.048nM，金纳米棒颗粒浓度为0.056nM，金纳米球颗粒与HCV病毒捕获链的原料比率为1：300，金纳米棒颗粒与HBV病毒捕获链的原料比率为1：400。

其中，可视化传感器中还包括Exo III酶，浓度为0.800-1.200U/uL，优选为1.0U/uL。

本发明还提供了基于暗场成像同时检测多种肝炎病毒的方法，采用具有上述特征的多种肝炎病毒标志物单颗粒可视化传感器进行检测。

其中，检测的时间为90min以上，温度10-40℃；优选为100-120min，温度30-40℃。

其中，检测的样本可以为血清样本，检测的样本中HBV或HCV病毒的浓度以5-120pM为佳。

本发明同时提供了上述多种肝炎病毒标志物单颗粒可视化传感器的制备方法，包括分别制备AuNSs-CpHCV-MBs和AuNRs-CpHBV-MBs两种探针，并将两种探针混合的步骤；

所述AuNSs-CpHCV-MBs探针的制备过程包括：采用TCEP溶液对HCV病毒捕获链的末端巯基进行活化，然后将活化好的HCV病毒捕获链加入金纳米球溶液中孵育，陈化后与磁珠溶液混合并反应，洗涤后即得；

所述AuNRs-CpHBV-MBs探针的制备过程包括：采用mPEG-SH溶液对金纳米棒溶液进行处理以替换金纳米棒颗粒表面的残余离子，并采用TCEP溶液对HBV病毒捕获链的末端巯基进行活化，然后将活化好的HCV病毒捕获链加入处理后的金纳米棒溶液中孵育，陈化后与磁珠溶液混合并反应，洗涤后即得。

其中，所述mPEG-SH溶液浓度为5mg/mL，金纳米棒与mPEG-SH的用量比为c_AuNRs:c_mPEG-SH＝1:120。

其中，活化过程中，病毒捕获链相对于TCEP的用量比为1：100；陈化试剂采用0.1MNaCl溶液；洗涤次数以六次为佳。

本发明的有益效果在于：

本发明基于金纳米颗粒标记的病毒捕获探针DNA/磁珠构建了一种新型的高灵敏的多元单颗粒光散射DNA传感器来同时检测乙肝病毒目标DNA和丙肝病毒目标DNA。这个单颗粒光散射DNA传感器具有良好的选择性、灵敏性、稳定性，利用此传感器同时检测人血清样品中的乙肝病毒目标DNA和丙肝病毒目标DNA的含量得到了满意的结果。本策略避免了非特异性吸附，提高了检测的准确性，并且结合信号放大技术，提高了方法的灵敏度。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作优选的详细描述，其中：

图1：金纳米球的表征。(a)金纳米球的SEM成像和吸收光谱。(b)金纳米球的暗场显微成像。(c)MBs(绿)，AuNSs(棕)，AuNSs-Cp_HCV(黄)和AuNSs-Cp_HCV-MBs(蓝)的Zeta电位。(d)MBs(绿)，和AuNSs-Cp_HCV-MBs(蓝)的水和粒径分布。

图2：金纳米棒的表征。(a)金纳米棒的SEM成像和吸收光谱。(b)金纳米棒的暗场显微成像。(c)MBs(绿)，AuNRs(红)，AuNRs-Cp_HBV(紫红)和AuNRs-Cp_HBV-MBs(青)的Zeta电位。(d)MBs(绿)和AuNRs-Cp_HBV-MBs(红)的水和粒径分布。

图3：Exo III酶辅助的酶循环反应的PAGE分析。Lane 1,HBV；lane 2,CpHBV；lane3,HBV+Cp_HBV；lane 4,HBV+Cp_HBV+Exo III；lane 5,HCV；lane 6,Cp_HCV；lane 7,HCV+Cp_HCV；lane 8,HCV+Cp_HCV+Exo III.所有核酸序列的浓度为1μM。利用12％变性PAGE凝胶在120V30mA的条件下通电90分钟。

图4：组装体AuNSs-Cp_HCV-MBs的洗涤次数探究。(a-f)磁分下组装体AuNSs-Cp_HCV-MBs洗涤不同次数上清液的暗场显微成像。(g)对于a-f组中绿色光斑数量的统计。

图5：组装体AuNRs-Cp_HBV-MBs的洗涤次数探究。(a-f)磁分下组装体AuNRs-Cp_HBV-MBs洗涤不同次数上清液的暗场显微成像。(g)对于a-f组中红色光斑数量的统计。

图6：AuNSs和AuNRs沉积时间研究。(a)AuNSs在沉积不同时间下绿色散射光斑数量统计。(b)AuNRs在沉积不同时间下红色散射光斑数量统计。

图7：对于HCV检测的反应条件优化。(a)AuNSs与Cp_HCV比例研究。(b)MBs浓度的影响。(c)AuNSs浓度研究。(d)Exo III酶浓度研究。(e)反应时间优化。(f)反应温度优化。(g)金纳米颗粒-磁珠形成的核-卫星结构图片。

图8：对于HBV检测的反应条件优化。(a)AuNRs与Cp_HBV比例研究。(b)MBs浓度的影响。(c)AuNRs浓度研究。(d)Exo III酶浓度研究。(e)反应时间优化。(f)反应温度优化。(g)金纳米棒-磁珠形成的核-卫星结构图片

图9：在单颗粒水平检测HBV/HCV。(a-h)在单靶物水平不同浓度HBV存在下的DFM成像。(i-p)在单颗粒水平不同浓度HCV存在下的DFM成像。(q)c_HBV与红色光斑数量之间的关系。(r)c_HCV与绿色光斑数量之间的关系。

图10：同时检测HBV和HCV。(a-p)同时检测HBV和HCV的暗场显微成像。(q)对于HBV单独检测和同时检测时红色光斑数量和c_HBV之间的关系；(r)对于q中红色圆圈标记部分的进一步放大；(s)对于HCV单独检测和同时检测时绿色光斑数量和c_HCV之间的关系；(t)对于s中红色圆圈标记部分的进一步放大。

图11：方法的选择性考察。条件：靶物DNA浓度为20pM；酶促反应时间为105min；温度为37℃；MBs浓度为1.250mg/ml；Exo III浓度为1.0U/uL；AuNSs浓度为0.048nM；AuNRs浓度为0.056nM。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

一、传感器的制备

1)棒状金纳米颗粒的制备：

首先，合成金种子溶液：在25mL的圆底烧瓶中加入5mL 0.5mM HAuCl₄和5mL 0.2MCTAB溶液，混合均匀，再加入1mL 6mM经过冰浴的NaBH₄于上述溶液中，在磁力搅拌器上1200rpm剧烈搅拌2min,室温放置备用。

其次，制备生长液：称取1.4g CTAB粉末及0.2468g油酸钠粉末与250mL锥形瓶中，加入50mL纯水，在50℃水浴中将CTAB充分溶解，冷却至30℃。再加入2.4mL 4mM AgNO₃溶液，30℃下静置15min，再加入50mL 1mM HAuCl₄溶液，在磁力搅拌器上700rpm搅拌90min。加入0.3mL浓盐酸，400rpm搅拌15min,再加入0.25mL 64mM L-抗坏血酸溶液，剧烈搅拌30s。再加入80μL金种子溶液，适当转速混匀，30℃水浴放置12h以上。

2)球形金纳米颗粒的制备：

在三颈烧瓶中加入150mL 2.2mM柠檬酸钠溶液，在磁力搅拌器上油浴加热至100℃，沸腾后加入1mL 25mM HAuCl₄溶液，反应至酒红色。降温至90℃，加入1mL 60mM柠檬酸钠，搅拌2min后加入1mL 25mM HAuCl₄，反应30分钟。重复以上操作6次，停止加热，搅拌下冷却至25℃，测定吸收和浓度。

3)HBV捕获链(Cp_HBV-DNA)在金纳米棒表面的修饰。

首先，将金纳米棒溶液6000转15分钟离心3次以尽可能地除去过量的CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)溶液，并重悬于0.05％吐温溶液中。然后按c_AuNRs:c_mPEG-SH＝1:120的比例加入浓度为5mg/mL的mPEG-SH(甲氧基聚乙二醇硫醇)溶液，在室温下孵育8h以替换金纳米棒表面的CTAB。得到的溶液以6000转15分钟离心一次，并且重悬于0.05％Tween-1*PBS中(pH＝7.4)。然后在修饰有巯基的DNA中按c_DNA:c_TCEP＝1:100的比例加入TCEP溶液，在室温下反应1h以活化DNA末端的巯基。然后将活化好的Cp_HBV-DNA按照c_AuNRs:c_CpHBV＝1:400的比例加入到上面得到的金纳米棒溶液中，并在室温下孵育过夜。最后，缓慢多次地加入NaCl溶液至终浓度为0.1M，加好后重悬于0.05％Tween-1×PBS(pH＝7.4)中后续应用。

4)Cp_HCV-DNA在金纳米球表面的修饰

首先，在Cp_HCV-DNA中按照c_CpHCV:c_TCEP＝1:100的比例加入新配的TCEP(三羧乙基膦溶液)溶液，在25℃下反应1h以活化DNA末端的巯基。然后将活化好的Cp_HBV-DNA按照c_AuNSs:c_CpHCV＝1:300的比例加入到金球胶体溶液中，25℃孵育过夜。最后，缓慢多次地加入新配的NaCl溶液至终浓度为0.1M，加好后重悬于1×PBS中(pH＝7.4)。

5)MBs-CpHCV-AuNSs(或表示为AuNSs-CpHCV-MBs)探针的制备：

将修饰有链霉亲和素的磁珠在磁性框架上用1×PBS(pH＝7.4)洗涤三次，并重悬于1×PBS溶液中。然后将修饰了HCV捕获链(CpHCV)的金纳米颗粒与洗好的磁珠溶液混合，在37℃下反应1h。反应完成后用1×PBS(pH＝7.4)洗涤六次以去除过量的AuNSs。

6)MBs-CpHBV-AuNRs(或表示为AuNRs-CpHBV-MBs)探针的制备：

将修饰有链霉亲和素的磁珠在磁性框架上用1×PBS(pH＝7.4)洗涤三次，并重悬于1×PBS溶液中。然后将修饰了HBV捕获链(CpHBV)的金纳米颗粒与洗好的磁珠溶液混合，在37℃下反应1h。反应完成后用1×PBS(pH＝7.4)洗涤六次以去除过量的AuNRs。

7)HBV/HCV检测程序：

在制备好的AuNSs-CpHCV-MBs/AuNRs-CpHBV-MBs探针中加入不同浓度的HBV/HCV溶液(c_MBs＝1.250mg/mL,c_AuNSs＝0.048nM,c_AuNRs＝0.056nM)，混合均匀后再加入Exo III酶(c_Exo _III＝1.0U/μL),最后加入1×PBS缓冲液至总体积为50μL,在37℃下反应105min。反应完成后，在磁性分离下取上清液，将上清液滴于经过铬酸洗液浸泡和N₂吹干的阳离子玻片上，沉积40min后，用纯水洗涤，N₂吹干，进行暗场显微成像。然后用image J软件处理成像得到的图片并统计颗粒数量。

二、结果与表征

图1显示了本发明所制备的金纳米球的形态及其探针制备结果。图1(a)SEM扫描电镜成像图显示出所合成的柠檬酸钠包被的AuNSs呈现出均匀分布的球体，在530nm处表现出局域表面等离激元共振吸收峰(内嵌图)，在暗场显微镜下呈现出均匀的绿色散射光斑(图1b)。在AuNSs表面修饰Cp_HCV后，其Zeta电位降低，表明Cp_HCV成功修饰。在磁珠表面连接AuNSs后，MBs的Zeta电位降低(图1c)以及水和粒径增大(图1d)，证明了探针AuNSs-CpHCV-MBs的成功制备。

图2显示了本发明所制备的金纳米棒的形态及其探针制备结果。图2(a)中SEM扫描电镜成像图显示出所合成的CTAB包被的AuNRs呈现出短棒状且均匀分布，在688nm处显示出强烈的纵向局域表面等离激元共振峰(内嵌图)，在暗场显微镜下呈现出颗粒大小均匀的绿色散射光斑(图2b)。在AuNRs表面修饰CpHBV后，AuNRs的Zeta电位降低，表明CpHBV的成功修饰。在磁珠表面连接AuNRs后，MBs的Zeta电位降低(图2c)以及水和粒径增大(图2d)，证明了探针AuNRs-CpHBV-MBs的成功制备。

图3显示了Exo III酶辅助的酶循环反应的PAGE分析结果。通过12％聚丙烯酰胺凝胶电泳进行验证了Exo III酶辅助的信号放大作用。实验结果显示，DNA单链HBV/Cp_HBV/HCV/Cp_HCV均与其分子量相匹配，当HBV(lane 1)/HCV(lane 5)与其捕获DNA Cp_HBV(lane 2)/Cp_HCV(lane 6)共同孵育时，生成了两条分子量较大的链(lane 3/lane 7)，其分子量与杂交双链相匹配，表明HBV/HCV与其捕获链的成功杂交。当Exo III酶与HBV-Cp_HBV/HCV-Cp_HCV双链混合孵育时，杂交链的颜色变浅并产生了一条新的条带，其分子量与HBV(lane 4)/HCV(lane 8)的单链相匹配，表明Exo III酶可以特异性地切割双链结构中的捕获链并释放靶物链，证明该酶的信号放大作用是可行的。

图4是组装体AuNSs-Cp_HCV-MBs的洗涤次数探究结果。为了尽可能地除去没有连接到磁珠上的AuNSs，避免假阳性信号的出现，对磁性分离条件下探针的洗涤次数进行了探讨。对探针洗涤不同次数后，磁性分离后取探针的上清液进行暗场显微镜成像，结果表明，洗涤次数越多，绿色散射光斑越少，表明没有连接上的AuNSs的数量越少，背景信号显著降低。第五次清洗后，暗场显微成像中未连接上的颗粒数量接近于0，背景接近于无，因此在后续实验中，选择洗涤六次进行。

图5为组装体AuNRs-Cp_HBV-MBs的洗涤次数探究结果。为了尽可能地除去没有连接到磁珠上的AuNRs，避免假阳性信号的出现，对磁性分离条件下探针的洗涤次数进行了探讨。对探针洗涤不同次数后，磁性分离后取探针的上清液进行暗场显微镜成像，结果表明，洗涤次数越多，红色散射光斑越少，表明没有连接上的AuNRs的数量越少，背景信号显著降低。第五次清洗后，暗场显微成像中未连接上的颗粒数量接近于0，背景接近于无，因此在后续实验中，选择洗涤六次进行。

图6是AuNSs和AuNRs沉积时间研究。AuNPs在玻片上的沉积时间对颗粒数量的统计起着至关重要的作用，若沉积时间过短，反应生成的AuNPs无法完全沉积于玻片上，导致计数的不准确性。为了获得稳定的颗粒计数，探究了金纳米颗粒在玻璃基底上的沉积时间，从图6可知，沉积在玻片上的AuNP数量随着沉积时间的增加而增加，30分钟后达到稳定状态，因此可以选择40分钟作为后续工作的最佳沉积时间。

图7和图8分别是对于HCV和HBV检测的反应条件优化研究。为了制备理想的具有核壳卫星结构的探针，研究了MBs和AuNPs的浓度以及AuNPs与DNA的比例对探针性能的影响。

首先，如果捕获链的浓度太大，AuNPs上连接的DNA太多，AuNPs可能会同时与多个MBs连接，形成一个大型网状结构。然而，捕获链太少将会导致一个金纳米颗粒上连得DNA太少甚至没有连接，导致没有足够量的AuNPs连接到磁珠的表面，无法制备出理想的核壳卫星结构的探针，不利于肝炎病毒的灵敏检测。从实验结果可以看出，随着AuNPs与DNA比例的增加，反应释放的AuNPs数量逐渐增加，对于形成MBs-Cp_HBV-AuNRs(图8a、g)和MBs-Cp_HCV-AuNPs(图7a、g)的核壳卫星结构，AuNPs与捕获DNA的比率优选范围为1：300-1：500，最佳比率分别为1:400和1:300。

此外，过多的MBs可能会导致一个金纳米颗粒与多个MBs连接，从而形成巨大的网络结构，而MBs不足可能导致金纳米颗粒与MBs连接的不足，从而影响肝炎病毒的灵敏检测。研究发现，随着MBs浓度的增加，反应生成的AuNPs数量逐渐增加，在1.125mg/mL时不再增加，1.125-1.375mg/mL为较佳范围，因此选择了1.250mg/mL用于后续实验(图7b和图8b)。

同样，过多或过少的AuNPs也不利于核壳卫星结构的形成,根据图7c和图8c的结果，在较佳的0.045-0.065nm范围内，选择0.056nm的AuNRs制备MBs DNA AuNRs探针(图8c)，在较佳的0.040-0.055nm范围内，选择0.048nm的AuNSs制备MBs DNA AuNSs探针(图7c)。

在该实验中，由于Exo III酶可以催化两种AuNPs的释放及两条靶物链的循环，因此Exo III酶的浓度起着关键作用。低浓度的酶导致反应不充分，无法将足够多的AuNPs释放到溶液中，随着Exo III酶浓度的增加，释放的AuNPs的数量增加。当酶浓度达到0.800U/uL时，反应生成的AuNPs数量达到最多且数量保持稳定，不再继续增长，因此在较佳的0.800-1.200U/uL范围内，选择1.0U/uL的酶浓度用于后续的实验。(图7d和图8d)。

酶促反应时间也是一个重要的影响因素，反应时间不足可能会导致探针上的AuNPs无法完全释放。结果表面，释放的AuNP在90分钟内持续增加，随后保持稳定，不再增加(图7e和8e)。因此，可以选择105分钟的反应时间进行后续的实验，反应时间较为稳定且不会过长。

最后，对反应温度进行了探讨，对比了室温(25℃)及生理温度(37℃)下的反应情况。虽然在10-40℃之间均能够发挥反应活性，但很明显，在生理温度(37℃)左右的范围内的反应比室温(25℃)下的反应更充分，因为Exo III酶在生理温度下具有最佳的生物酶活性(图7f和8f)。

综合以上分析，对于HCV检测的最佳条件可以优化为：AuNSs与Cp_HCV比例为1:300，酶反应时间为105分钟，温度为37℃，磁珠浓度为1.250mg/mL，AuNSs浓度为0.048nM,ExoIII酶浓度为1.0U/μL；对于HBV检测的最佳条件可以优化为：AuNRs与Cp_HBV比例为1:400，酶反应时间为105分钟，温度为37℃，磁珠浓度为1.250mg/mL，AuNRs浓度为0.056nM,Exo III酶浓度为1.0U/μL。

图9为在单颗粒水平检测HBV/HCV的结果。首先考察了该方法在单靶物水平对HBV/HCV-DNA的检测能力。在最佳条件下，反应生成的AuNRs数量随着HBV-DNA浓度的增加而增加(图9a-h)，并且在5-100pM范围内呈现出良好的线性相关性，其相关性可表示为N_R-N_R0＝6.49c_HBV+9.23，相关系数R²＝0.9878，检测限(LOD)低至0.194pM(3σ/k)，其中，N_R代表当HBV存在时反应产生的AuNRs的数量，N_R0分别代表无HBV时AuNRs的数量，c_HBV代表HBV浓度(图9q)。相似的，反应生成的AuNSs数量随着HCV-DNA浓度的增加而增加(图9i-p)，在5-120pM范围内表现良好的线性相关性，可以用公式表示为N_G-N_G0＝6.45c_HCV-17.10，相关系数R²＝0.9891，检测HCV的LOD低至0.169pM(3σ/k)，其中，N_G表示存在HCV时，催化生成的AuNSs数量，N_G0表示不存在HCV时的AuNSs的数量，c_HCV表示HCV-DNA浓度(图9r)。与先前报道的其他HBV/HCV检测方法相比，本发明的HBV/HCV检测方法显示出相同或更高的灵敏度(表1)。

表1现有报道中检测对象的检测水平

图10显示了同时检测HBV和HCV的结果。将两种探针与两种靶物同时混合，在最佳条件下(酶反应时间为105分钟；温度为37℃；磁珠浓度为1.250mg/mL；Exo III酶浓度为1.0U/μL；AuNSs浓度为0.048nM；AuNRs浓度为0.056nM)，HBV和HCV分别与其捕获链CpHBV和CpHCV杂交，经过Exo III酶的切割消化后，同时释放AuNRs和AuNSs并促使靶物HBV和HCV的循环。在暗场散射成像中，HBV的浓度由AuNRs的红色散射光斑数量表示，HCV的浓度由AuNSs的绿光散射光斑数量表示。在实验中，通过固定一种靶物的浓度改变另一种靶物的浓度验证了双靶物同时检测的准确性。首先，为了验证方法检测HBV的准确性，将HCV的浓度固定为0pM,使HBV的浓度在0-20pM之间变化，实验结果表明，反应生成的绿色光斑数量保持不变，而红色光斑数量呈现出明显的呈线性增加的趋势(图10a-d)。

同样，如果将HCV-DNA的浓度固定在5pM(图10e-h)、10pM(图10i-l)或10pM(图10i-l)，使HBV-DNA的浓度在0pM-20pM之间变化，实验结果呈现相同的线性变化趋势。从图10a-p中的结果可以推断出，HBV的浓度是由AuNRs产生的红色散射光斑的数量决定，并且HCV的存在对HBV检测的影响可以忽略不计。为了验证这两种肝炎病毒生物标志物在同时检测中的干扰较小，对HBV在单靶物水平的检测和双靶物同时检测的统计数据进行了拟合和比较(图10)，并利用Image J软件对暗场成像图片中的红色和绿色散射光斑进行自动分离并计数。结果表明，当HBV-DNA的浓度在0-20pM范围内变化时，双靶物同时检测的结果与单靶物检测的结果有很好的重叠。

此外，通过固定HBV浓度实现了混合物中HCV-DNA的检测。首先将HBV浓度固定为0pM，使HCV-DNA浓度在0到20pM之间变化时，红色散射光斑的数量保持不变，而绿光散射光斑的数量逐渐增加(图10a、e、I、m)。同样，当HBV浓度固定为5pM(图10b、f、j、n)、10pM(图10c、g、k、o)或20pM(图10d、h、l、p)，HCV浓度从0增加到20pM，绿色散射光斑的数量呈现出相同的增加趋势。双靶物检测和单靶物检测的结果比较表明，HCV-DNA浓度由绿色散射光斑的数量决定，HBV的存在对HCV检测的影响可以忽略不计。图10r和图10t进一步显示，在双靶物检测时，决定HBV浓度的红色散射光斑的数量和决定HCV浓度的绿色散射光斑数量与单独检测实验结果可以很好的吻合。上述结果表明，当靶物浓度在5-20pM范围内时，双靶物检测的干扰可以忽略不计，同时检测是可行的，并在120pM以内的检测浓度范围内具有与单靶物基本相当的相关性与灵敏度。

图11为方法的选择性考察。条件为：靶物DNA浓度为20pM；酶促反应时间为105min；温度为37℃；MBs浓度为1.250mg/ml；Exo III浓度为1.0U/uL；AuNSs浓度为0.048nM；AuNRs浓度为0.056nM。

方法的选择性考察对于靶物的灵敏检测至关重要，由于生物样品中存在许多类似物，因此需要考察该方法针对HBV和HCV-DNA的特异性。在相同条件下比较了9种不同的DNA序列，包括HBV单核苷酸错配(HBV mis 1)、HBV双核苷酸错配(HBV mis 2)、HBV四核苷酸错配(HBV mis 4)、HCV单核苷酸错配(HCV mis 1)、HCV双核苷酸错配(HCV mis2)、HCV四核苷酸错配(HCV mis 4)，人类免疫缺陷病毒DNA(HIV-DNA)以及两条随机序列(图11)。结果显示，HBV存在时生成的红色散射光斑数量远远多于HBV mis1、HBV mis2、HBV mis4、人类免疫缺陷病毒(HIV)和两条随机序列。此外，HCV存在时产生的绿色散射光斑数量远多于HCV mis1、HCV mis 2、HCV mis 4、HIV和两条随机序列。结果表明，该方法能够特异性区分病毒DNA的单碱基错配、双碱基错配、四碱基错配和随机序列，有良好的选择性。

为了进一步评估本发明检测人类血清样品中HBV和HCV的能力，收集了三名志愿者的血清样本，并用本发明的混合探针同时进行了血清中HBV和HCV的浓度测定。如表2所示，HBV的回收率在95.62％到100.37％之间，而HCV的回收率在99.12％到103.33％之间，这表明所提出的混合探针和检测方法在复杂生物样品中定量HBV和HCV的可行性。

表2：血清样本中HBV和HCV的测定(n＝3)

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims

1.多种肝炎病毒标志物单颗粒可视化传感器，包括AuNSs-CpHCV-MBs和AuNRs-CpHBV-MBs两种探针组合；所述AuNSs-CpHCV-MBs由金纳米球颗粒和HCV病毒捕获链以及磁珠构建而成；所述AuNRs-CpHBV-MBs由金纳米棒颗粒和HBV病毒捕获链以及磁珠构建而成。

2.根据权利要求1所述的多种肝炎病毒标志物单颗粒可视化传感器，其特征在于，两种探针组合的磁珠浓度为1.125-1.375mg/mL；金纳米球颗粒浓度为0.040-0.055nM；金纳米棒颗粒浓度为0.045-0.065nM，每种金纳米颗粒与对应的病毒捕获链的原料比率为1：300-1：500；

优选的，磁珠浓度为1.250mg/mL，金纳米球颗粒浓度为0.048nM，金纳米棒颗粒浓度为0.056nM，金纳米球颗粒与HCV病毒捕获链的原料比率为1：300，金纳米棒颗粒与HBV病毒捕获链的原料比率为1：400。

3.根据权利要求1所述的多种肝炎病毒标志物单颗粒可视化传感器，其特征在于，还包括Exo III酶，浓度为0.800-1.200U/uL，优选为1.0U/uL。

4.基于暗场成像同时检测多种肝炎病毒的方法，采用权利要求1-3任一项所述的多种肝炎病毒标志物单颗粒可视化传感器进行检测。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，检测的时间为90min以上，温度10-40℃；优选为100-120min，温度30-40℃。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，检测的样本可以为血清样本，检测的样本中HBV或HCV病毒的浓度以5-120pM为佳。

7.权利要求1-3任一项所述多种肝炎病毒标志物单颗粒可视化传感器的制备方法，包括分别制备AuNSs-CpHCV-MBs和AuNRs-CpHBV-MBs两种探针，并将两种探针混合的步骤；

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述mPEG-SH溶液浓度为5mg/mL，金纳米棒与mPEG-SH的用量比为c_AuNRs:c_mPEG-SH＝1:120。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，活化过程中，病毒捕获链相对于TCEP的用量比为1：100；陈化试剂采用0.1M NaCl溶液；洗涤次数为六次。