CN108414758A - 用于检测肿瘤标志物miRNA-141的SERS生物传感器的制备方法及其应用 - Google Patents
用于检测肿瘤标志物miRNA-141的SERS生物传感器的制备方法及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了用于检测肿瘤标志物miRNA‑141的SERS生物传感器的制备方法及其应用，特点是包括以下步骤：（1）将Fe3O4@Au磁性纳米颗粒与捕获探针结合得到捕获单元溶液；（2）将空心金纳米球与引发探针结合制备即得信号单元溶液；（3）将捕获单元、miRNA‑141和信号单元反应结合，磁选分离得到SERS生物传感器，其应用为利用拉曼光谱仪测定SERS信号，测定一系列不同浓度的miRNA‑141对应的SERS信号强度，建立miRNA‑141浓度与SERS信号强度之间的定量关系；根据该定量关系即可测定未知样品中miRNA‑141浓度，优点是灵敏度高、特异性强、组装过程简单以及检测速度快。
Description
技术领域
本发明涉及检测肿瘤标志物miRNA-141的检测方法，尤其是涉及用于检测肿瘤标志物miRNA-141的SERS生物传感器的制备方法及其应用。
背景技术
癌症，也称恶性肿瘤，本质上是一种多基因疾病，是由细胞生长增殖机制失常引起的疾病，严重危害人类健康。联合国世界卫生组织下属的国际癌症研究机构预计到2030年将会有1320万人死于癌症，确诊病例将达到2140万人。虽然癌症死亡率高但并非不可治愈，研究表明：癌症早期是治愈癌症的最佳时期，因此实现对肿瘤的早期发现、早期诊断、早期治疗，可以有效地预防和治疗癌症。肿瘤标志物的发现使得早期诊断成为可能。肿瘤标志物是在肿瘤的发生和增殖过程中产生、反映肿瘤存在和生长的物质，大量研究表明，不同种类的肿瘤疾病会导致不同种类微小核糖核酸MicroRNA（miRNA）含量的变化。因此，作为一类具有高特异性的肿瘤标志物，miRNA检测对肿瘤疾病的早期诊疗具有重要科学意义和应用前景。
表面增强拉曼散射光谱（SERS）是一种重要的光谱检测技术，在生物检测方面体现出了相当大的优势。一方面，粗糙的金属表面作为SERS基底，能够使SERS信号强度大大增加，增强幅度能够达到106～1014，因此SERS可对微量或者痕量目标物进行超灵敏检测；另一方面，与其他方法的标记物相比，SERS标记物具有更简单、更广泛、更尖锐的“指纹”信号和良好的重复性。目前，大量新型纳米材料如空心纳米球、纳米颗粒、纳米线等，也被用作为SERS基底以增强信号强度，其中，空心金纳米球、银纳米颗粒因制备方法简单、具有良好的生物相容性、信号增强能力大等优点，尤为受到关注。
生物传感器是以酶、蛋白质、核酸、细胞等生物物质作为敏感元件与待测样品进行接触，并将目标物浓度、物质的量等性质转变为电信号、光信号等可视信号的系统，DNA生物传感器是其中一种，其以DNA为敏感元件，待测定的核酸序列与敏感元件杂交形成双链DNA结构将反应过程的变化转化为能记录的信号，进而推测出待测定的核酸序列的量，近年来，聚合酶链式反应（PCR）、杂交链式反应（HCR）等技术在DNA生物传感器构建方面有不少应用。目前，国内外还没有公开关于用于检测肿瘤标志物miRNA-141的SERS生物传感器的制备方法的相关研究报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种灵敏度高、特异性强、组装过程简单以及检测速度快的用于检测肿瘤标志物miRNA-141的SERS生物传感器的制备方法及其应用。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种用于检测肿瘤标志物miRNA-141的SERS生物传感器的制备方法，包括以下步骤：
（1）捕获单元制备
a. 制备Fe3O4磁性纳米颗粒溶液：将0.7～1.0 g FeCl3·6H2O和0.2～0.5 g FeCl2·4H2O溶于50～100 mL水，通氮除氧，搅拌混合均匀，升温到80～100 ℃，缓慢滴加20～25wt%氨水，调节pH=9～10，继续加热搅拌1～2 h后，停止加热，在氮气保护下，搅拌回流，冷却至室温，水清洗至中性，乙醇定容至50 mL，即得Fe3O4磁性纳米颗粒溶液；
b. 制备氨基化Fe3O4磁性纳米颗粒溶液：将40～50 mL Fe3O4磁性纳米颗粒溶液超声0.5～1 h，加入0.2～0.3 mL 3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES），搅拌4～5 h，加入1～2 mL0.1～0.5 mol/L硝酸溶液，继续搅拌3～4 h，水清洗至中性，乙醇定容至100 mL，即得氨基化Fe3O4磁性纳米颗粒溶液；
c. 制备Fe3O4@Au磁性纳米颗粒溶液：将5～10 mL氨基化Fe3O4磁性纳米颗粒溶液和10～20 mL 1wt% HAuCl4溶液在60～100 kHz的超声频率下混合，搅拌1 h后，缓慢加入30～50mL 20～30 mmol/L柠檬酸三钠溶液，超声2～3 h，水清洗至中性，乙醇定容至20 mL，即得Fe3O4@Au磁性纳米颗粒溶液；
d. 制备捕获单元溶液：取50～100 µL Fe3O4@Au磁性纳米颗粒溶液超声5～10 min，加入20～50 µL 1～5 µmol/L捕获探针（CP）溶液，用DNA固定液定容至200 µL，混合均匀，37℃下震荡3～4 h，暗处放置24 h，利用Au-S键合作用，捕获探针（CP）自组装在Fe3O4@Au磁性纳米颗粒的表面，清洗；滴加10～20 µL 10～20 mmol/L巯基己醇（MCH）溶液封闭非特异性吸附位点，清洗；用缓冲液定容至100 µL，即得捕获单元溶液；
（2）信号单元制备
a. 制备金纳米颗粒（GNPs）溶液：取10～20 µL四羟甲基氯化磷（THPC）加入到50～60mL 6～7 mmol/L NaOH溶液中，搅拌5 min，加入1.8～2.0 mL 1wt% HAuCl4溶液，溶液颜色由亮黄色变为紫黑色再变为酒红色，继续搅拌30 min，置于4 ℃冰箱密封避光保存，陈化2周，即得金纳米颗粒溶液；
b. 制备氨基化SiO2纳米颗粒溶液：取2～3 mL正硅酸乙酯（TEOS）加入到40～60 mL乙醇中，再加入3～4 mL水、3～4 mL 10～20 wt%氨水和40～50 mL乙醇，混合均匀，室温下反应20 h，水清洗，乙醇定容至50 mL，得到SiO2纳米颗粒溶液；取10 mL SiO2纳米颗粒溶液，加入100～120 µL 3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES），混合均匀，80 ℃下烘箱中反应2 h，冷却之后，超声0.5 h，离心清洗，用水定容至10 mL，得到氨基化SiO2纳米颗粒溶液；
c. 制备二氧化硅/金纳米复合颗粒（SiO2@GNPs）溶液：取100～120 µL氨基化SiO2纳米颗粒溶液，加入到50～60 mL金纳米颗粒溶液中，搅拌2 h，清洗，水定容至20 mL，即得二氧化硅/金纳米复合颗粒（SiO2@GNPs）溶液；
d. 制备空心金纳米球（HGNs）溶液：称取10～15 mg K2CO3溶于40～50 mL水中，搅拌5min后，逐滴加入0.8～1.0 mL 1wt% HAuCl4溶液，继续搅拌，溶液由黄色逐渐变为无色，得到K2CO3-HAuCl4生长液；取40～50 mL K2CO3-HAuCl4生长液，加入0.5～1.0 mL二氧化硅/金纳米复合颗粒（SiO2@GNPs）溶液，搅拌5 min，加入0.3～0.5 mL 0.1 mol/L H2O2溶液，继续搅拌30 min，溶液由粉红变紫色再变蓝色最后深红色，离心清洗，水定容至20 mL，得到金纳米壳溶液；取5～6 mL金纳米壳溶液，加入2～3 µL 0.02 mol/L氢氟酸（HF），缓慢搅拌，离心清洗，水定容至20 mL，得到空心金纳米球（HGNs）溶液；
e. 制备信号单元溶液：取300～400 µL空心金纳米球（HGNs）溶液，超声10 min，加入5～10 µL 5～10 µmol/L引发探针（TP）溶液，用DNA固定液定容至500 µL，混合均匀，37 ℃下震荡3～4 h，暗处放置24 h后，加入发卡DNA 1（H1）和发卡DNA 2（H2），37 ℃下孵育2～3 h，进行HCR扩增，离心清洗，缓冲液定容500 µL，得到HGNs/HCR溶液；取400～500 µL的HGNs/HCR溶液，加入5～10 µL 5～10 mmol/L AgNO3溶液，反应20 min，Ag+吸附到HGNs表面和DNA双链中，加入10～20 µL 10～20 mmol/L氢醌溶液，反应30 min，吸附的Ag+被还原为银纳米颗粒，缓冲液清洗，定容至500 µL，得到AgNPs@HGNs/HCR溶液；取400～500 µL的AgNPs@HGNs/HCR溶液，加入5～10 µL 0.5～1.0 mmol/L罗丹明6G（R6G）溶液，孵育2～3 h，缓冲液清洗，即得信号单元溶液；
（3）SERS生物传感器制备
取5～10 µL捕获单元溶液，加入5～10 µL一定浓度的miRNA-141溶液，在37℃下孵育2h后；加入5～10 µL信号单元溶液，并在37 ℃下孵育2 h；清洗，并用磁铁进行分离，反复三次，得到用于检测肿瘤标志物miRNA-141的SERS生物传感器。
所述的捕获探针的核苷酸序列为：5’-SH-GAA AGC CCA TCT TTA CCA GAC AGTGTT AGG TTT GGC TTT C-3’所述的引发探针的核苷酸序列为： 5’-SH- CGG CGA TAA CAAGAA AGC CAA ACC-3’；所述的发卡DNA 1的核苷酸序列为： 5’- TAA CAA GAA AGC CAA ACCGAG ATG GGT TTG GCT TTC TTG TTA TCG CCG -3’；所述的发卡DNA 2的核苷酸序列为：5’-CAT CTC GGT TTG GCT TTC TTG TTA CGG CGA TAA CAA GAA AGC CAA ACC-3’；所述的miRNA-141的核苷酸序列为：5’-UAA CAC UGU CUG GUA AAG AUG G-3’。
所述的DNA固定液的配方如下：10 mmol/L Tris-HCl，1.0 mmol/L EDTA，10 mmol/L三(2-羧乙基)膦（TCEP）和0.1 mol/L NaCl，pH为7.6～8.0；所述的缓冲液配方如下：10mmol/L Tris-HCl，1.0 mmol/L EDTA，0.3 mol/L NaCl和1 mmol/L MgCl2，pH为7.6～8.0；
一种利用上述SERS生物传感器检测肿瘤标志物miRNA-141的方法，包括以下步骤：
（1）取5～10 µL捕获单元溶液，加入5～10 µL一定浓度的miRNA-141溶液，在37℃下孵育2 h；加入5～10 µL信号单元溶液，并在37 ℃下孵育2 h；清洗，并用磁铁进行分离，反复三次得到权利要求1-3所述的用于检测肿瘤标志物miRNA-141的SERS生物传感器，利用拉曼光谱仪测定SERS信号；
（2）测定一系列不同浓度的miRNA-141对应的SERS信号强度，建立miRNA-141浓度与SERS信号强度之间的定量关系；根据该定量关系即可测定未知样品中miRNA-141浓度。
发明原理如下：本发明利用碱基互补配对原则，制备捕获单元和信号单元，构建了一种检测肿瘤标志物miRNA-141的SERS生物传感器。
捕获单元，由捕获探针（CP）通过Au-S键结合于Fe3O4@Au磁性纳米颗粒表面而成，具有以下功能：（1）捕获探针（CP）是发卡结构，可以特异性捕获miRNA-141而打开发卡结构，其末端可以和信号单元杂交；（2）Fe3O4@Au生物相容性好，有利于大量捕获探针被固定在其表面；（3）Fe3O4@Au具有磁性，可以通过磁力，迅速实现清洗、分离，极大程度简化操作。
信号单元，通过如下步骤制备而成：引发探针（TP）通过Au-S键结合于空心金纳米球表面，在H1和H2存在下，TP原位触发杂交链式反应（HCR），形成双链DNA超夹心结构。加入AgNO3溶液，经氢醌还原后，空心金纳米球表面和双链DNA超夹心结构中形成银纳米颗粒，银纳米颗粒表面吸附拉曼信号分子R6G，可产生SERS信号。该信号单元具有以下功能：（1）一个miRNA-141分子，对应于一个信号单元，而一个信号单元对应于大量双链DNA超夹心结构，实现一级放大；空心金纳米球和每一个双链DNA超夹心结构，对应于其上的大量银纳米颗粒，实现二级放大；每一个银纳米颗粒，对应于其上的大量拉曼信号分子R6G；因此，银纳米颗粒本身对SERS信号有较大增强作用，再通过上述三级放大，SERS信号极大程度地增强；（2）HCR扩增后H2末端与捕获探针（CP）末端互补，通过杂交，可以与捕获单元连接在一起形成复合物。
检测机理：miRNA-141存在时，捕获单元上的捕获探针（CP）可以特异性识别并捕获miRNA-141，其发卡结构被打开；该发卡结构末端与信号单元中HCR扩增后H2末端互补而杂交，捕获单元与信号单元相连接形成复合物；通过磁性快速分离；拉曼光谱仪检测复合物的拉曼信号，通过上述三级放大作用，miRNA-141的检测限低至0.03 fmol/L。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
（1）灵敏度高。SERS方法本身具有高灵敏度，本发明通过上述三级放大作用，SERS信号极大程度地增强，检测灵敏度超高，miRNA-141的检测限低至0.03 fmol/L。
（2）特异性强。本发明是基于核酸分子之间碱基互补配对原则而构建的生物传感器，干扰物质不是特定捕获探针（CP）的目标物，因此待测液中的干扰物质并不能与CP结合，CP的发卡结构不能被打开，无法和信号单元中的H2杂交，也就不能产生SERS信号，故对本检测体系无干扰。
（3）传感器组装过程简单，检测过程迅速。捕获单元设计为磁性结构，可以通过磁力，迅速实现清洗、分离，极大程度简化传感器组装过程。除DNA孵育杂交时间外，检测几乎及时完成。
（4）此方法具有普适性，只需适当改变CP、TP、H1、H2序列，即可实现对不同种miRNA-141的检测。
综上所述，本发明制备了一种高灵敏检测miRNA-141的SERS生物传感器，联用空心金纳米球和HCR技术，在空心金纳米球表面进行HCR扩增，随后将大量银纳米颗粒同时固载到空心金纳米球表面和DNA双链中，实现SERS信号的三级放大，构建出高灵敏度SERS生物传感器，具有灵敏度高、特异性强、简单、快速、易于操作等优点，可以实现对超低浓度miRNA-141的检测，具有良好的应用前景。
附图说明
图1为基于SERS生物传感器高灵敏检测miRNA-141的检测原理图；
图2为不同浓度miRNA-141的SERS信号(y)—浓度(x)的关系图；
图3为不同浓度miRNA-141的SERS信号(y)—浓度(x)对数线性图。
具体实施方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
具体实施例一
实施例1
一种用于检测肿瘤标志物miRNA-141的SERS生物传感器的制备方法，包括以下步骤：
（1）捕获单元制备
a. 制备Fe3O4磁性纳米颗粒溶液：将0.8 g FeCl3·6H2O和0.4 g FeCl2·4H2O溶于70mL水，通氮除氧，搅拌混合均匀，升温到90 ℃，缓慢滴加20～25wt%氨水，调节pH=9～10，继续加热搅拌1～2 h后，停止加热，在氮气保护下，搅拌回流，冷却至室温，水清洗至中性，乙醇定容至50 mL，即得Fe3O4磁性纳米颗粒溶液；
b. 制备氨基化Fe3O4磁性纳米颗粒溶液：将45 mL Fe3O4磁性纳米颗粒溶液超声0.7 h，加入0.25 mL 3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES），搅拌4～5 h，加入1.5 mL 0.3 mol/L硝酸溶液，继续搅拌3～4 h，水清洗至中性，乙醇定容至100 mL，即得氨基化Fe3O4磁性纳米颗粒溶液；
c. 制备Fe3O4@Au磁性纳米颗粒溶液：将7 mL氨基化Fe3O4磁性纳米颗粒溶液和15 mL1wt% HAuCl4溶液在8 kHz的超声频率下混合，搅拌1 h后，缓慢加入40mL 25 mmol/L柠檬酸三钠溶液，超声2～3 h，水清洗至中性，乙醇定容至20 mL，即得Fe3O4@Au磁性纳米颗粒溶液；
d. 制备捕获单元溶液：取80 µL Fe3O4@Au磁性纳米颗粒溶液超声8 min，加入35 µL 3µmol/L捕获探针（CP）溶液，用DNA固定液定容至200 µL，混合均匀，37 ℃下震荡3～4 h，暗处放置24 h，利用Au-S键合作用，捕获探针（CP）自组装在Fe3O4@Au磁性纳米颗粒的表面，清洗；滴加15 µL 15 mmol/L巯基己醇（MCH）溶液封闭非特异性吸附位点，清洗；用缓冲液定容至100 µL，即得捕获单元溶液；
（2）信号单元制备
a. 制备金纳米颗粒（GNPs）溶液：取15 µL四羟甲基氯化磷（THPC）加入到55 mL 6.5mmol/L NaOH溶液中，搅拌5 min，加入1.9 mL 1wt% HAuCl4溶液，溶液颜色由亮黄色变为紫黑色再变为酒红色，继续搅拌30 min，置于4 ℃冰箱密封避光保存，陈化2周，即得金纳米颗粒溶液；
b. 制备氨基化SiO2纳米颗粒溶液：取2.5 mL正硅酸乙酯（TEOS）加入到50 mL乙醇中，再加入3.5 mL水、3.5 mL 15 wt%氨水和45 mL乙醇，混合均匀，室温下反应20 h，水清洗，乙醇定容至50 mL，得到SiO2纳米颗粒溶液；取10 mL SiO2纳米颗粒溶液，加入110 µL 3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES），混合均匀，80 ℃下烘箱中反应2 h，冷却之后，超声0.5 h，离心清洗，用水定容至10 mL，得到氨基化SiO2纳米颗粒溶液；
c. 制备二氧化硅/金纳米复合颗粒（SiO2@GNPs）溶液：取1100 µL氨基化SiO2纳米颗粒溶液，加入到55 mL金纳米颗粒溶液中，搅拌2 h，清洗，水定容至20 mL，即得二氧化硅/金纳米复合颗粒（SiO2@GNPs）溶液；
d. 制备空心金纳米球（HGNs）溶液：称取12 mg K2CO3溶于45 mL水中，搅拌5 min后，逐滴加入0.9 mL 1wt% HAuCl4溶液，继续搅拌，溶液由黄色逐渐变为无色，得到K2CO3-HAuCl4生长液；取45 mL K2CO3-HAuCl4生长液，加入0.8 mL二氧化硅/金纳米复合颗粒（SiO2@GNPs）溶液，搅拌5 min，加入0.4 mL 0.1 mol/L H2O2溶液，继续搅拌30 min，溶液由粉红变紫色再变蓝色最后深红色，离心清洗，水定容至20 mL，得到金纳米壳溶液；取5.5 mL金纳米壳溶液，加入2.5 µL 0.02 mol/L氢氟酸（HF），缓慢搅拌，离心清洗，水定容至20 mL，得到空心金纳米球（HGNs）溶液；
e. 制备信号单元溶液：取350 µL空心金纳米球（HGNs）溶液，超声10 min，加入8 µL 8µmol/L引发探针（TP）溶液，用DNA固定液定容至500 µL，混合均匀，37 ℃下震荡3～4 h，暗处放置24 h后，加入发卡DNA 1（H1）和发卡DNA 2（H2），37 ℃下孵育2～3 h，进行HCR扩增，离心清洗，缓冲液定容500 µL，得到HGNs/HCR溶液；取450 µL的HGNs/HCR溶液，加入8 µL 8mmol/L AgNO3溶液，反应20 min，Ag+吸附到HGNs表面和DNA双链中，加入15 µL 15 mmol/L氢醌溶液，反应30 min，吸附的Ag+被还原为银纳米颗粒，缓冲液清洗，定容至500 µL，得到AgNPs@HGNs/HCR溶液；取400～500 µL的AgNPs@HGNs/HCR溶液，加入8 µL 0.8 mmol/L罗丹明6G（R6G）溶液，孵育2～3 h，缓冲液清洗，即得信号单元溶液；
（3）SERS生物传感器制备
取5～10 µL捕获单元溶液，加入5～10 µL一定浓度的miRNA-141溶液，在37℃下孵育2h后；加入5～10 µL信号单元溶液，并在37 ℃下孵育2 h；清洗，并用磁铁进行分离，反复三次，得到用于检测肿瘤标志物miRNA-141的SERS生物传感器。
上述核苷酸序列为：捕获探针（CP）：5’-SH-GAA AGC CCA TCT TTA CCA GAC AGTGTT AGG TTT GGC TTT C-3’；引发探针（TP）: 5’-SH- CGG CGA TAA CAA GAA AGC CAAACC-3’；发卡DNA 1（H1）: 5’- TAA CAA GAA AGC CAA ACC GAG ATG GGT TTG GCT TTC TTGTTA TCG CCG -3’；发卡DNA 2（H2）: 5’-CAT CTC GGT TTG GCT TTC TTG TTA CGG CGA TAACAA GAA AGC CAA ACC-3’；miRNA-141: 5’-UAA CAC UGU CUG GUA AAG AUG G-3’。
上述DNA固定液的配方如下：10 mmol/L Tris-HCl，1.0 mmol/L EDTA，10 mmol/L三(2-羧乙基)膦（TCEP）和0.1 mol/L NaCl，pH为7.6～8.0；缓冲液的配方如下： 10 mmol/LTris-HCl，1.0 mmol/L EDTA，0.3 mol/L NaCl和1 mmol/L MgCl2，pH为7.6～8.0。
实施例2
同上述实施例1，其区别在于：
（1）捕获单元制备
a. 制备Fe3O4磁性纳米颗粒溶液：将0.7 g FeCl3·6H2O和0.2 g FeCl2·4H2O溶于50mL水；
b. 制备氨基化Fe3O4磁性纳米颗粒溶液：将40 mL Fe3O4磁性纳米颗粒溶液超声0.5 h，加入0.2 mL 3-氨丙基三乙氧基硅烷，搅拌4 h，加入1 mL 0.5 mol/L硝酸溶液，继续搅拌3～4 h；
c. 制备Fe3O4@Au磁性纳米颗粒溶液：将5 mL氨基化Fe3O4磁性纳米颗粒溶液和10 mL1wt% HAuCl4溶液在60 kHz的超声频率下混合，搅拌1 h后，缓慢加入30 mL 30 mmol/L柠檬酸三钠溶液，超声2 h；
d. 制备捕获单元溶液：取50 µL Fe3O4@Au磁性纳米颗粒溶液超声5 min，加入20 µL 5µmol/L捕获探针溶液；
滴加10 µL 20 mmol/L巯基己醇（MCH）溶液封闭非特异性吸附位点；
（2）信号单元制备
a. 制备金纳米颗粒溶液：取10 µL四羟甲基氯化磷（THPC）加入到50 mL 7 mmol/LNaOH溶液中，搅拌5 min，加入1.8 mL 1wt% HAuCl4溶液；
b. 制备氨基化SiO2纳米颗粒溶液：取2 mL正硅酸乙酯（TEOS）加入到40 mL乙醇中，再加入3 mL水、3 mL 20 wt%氨水和40 mL乙醇，混合均匀；取10 mL SiO2纳米颗粒溶液，加入100 µL 3-氨丙基三乙氧基硅烷；
c. 制备二氧化硅/金纳米复合颗粒溶液：取100 µL氨基化SiO2纳米颗粒溶液，加入到50 mL金纳米颗粒溶液中；
d. 制备空心金纳米球溶液：称取10 mg K2CO3溶于40 mL水中，搅拌5 min后，逐滴加入0.8 mL 1wt% HAuCl4溶液；
取40 mL K2CO3-HAuCl4生长液，加入0.5 mL二氧化硅/金纳米复合颗粒溶液，搅拌5min，加入0.3 mL 0.1 mol/L H2O2溶液；
取5 mL金纳米壳溶液，加入2 µL 0.02 mol/L氢氟酸；
e. 制备信号单元溶液：
取300 µL空心金纳米球（HGNs）溶液，超声10 min，加入5 µL 10 µmol/L引发探针溶液；
取400 µL的HGNs/HCR溶液，加入5 µL 10 mmol/L AgNO3溶液；
取400 µL的AgNPs@HGNs/HCR溶液，加入5 µL 1.0 mmol/L罗丹明6G（R6G）溶液。
实施例3
同上述实施例1，其区别在于：
（1）捕获单元制备
a. 制备Fe3O4磁性纳米颗粒溶液：将1.0 g FeCl3·6H2O和0.5 g FeCl2·4H2O溶于100mL水；
b. 制备氨基化Fe3O4磁性纳米颗粒溶液：将50 mL Fe3O4磁性纳米颗粒溶液超声1 h，加入0.3 mL 3-氨丙基三乙氧基硅烷，搅拌5 h，加入2 mL 0.1 mol/L硝酸溶液，继续搅拌3～4h；
c. 制备Fe3O4@Au磁性纳米颗粒溶液：将10 mL氨基化Fe3O4磁性纳米颗粒溶液和20 mL1wt% HAuCl4溶液在100 kHz的超声频率下混合，搅拌1 h后，缓慢加入50 mL 20 mmol/L柠檬酸三钠溶液，超声2～3 h；
d. 制备捕获单元溶液：取100 µL Fe3O4@Au磁性纳米颗粒溶液超声10 min，加入50 µL1 µmol/L捕获探针溶液；
滴加20 µL 10 mmol/L巯基己醇（MCH）溶液封闭非特异性吸附位点；
（2）信号单元制备
a. 制备金纳米颗粒溶液：取20 µL四羟甲基氯化磷（THPC）加入到60 mL 6mmol/L NaOH溶液中，搅拌5 min，加入2.0 mL 1wt% HAuCl4溶液；
b. 制备氨基化SiO2纳米颗粒溶液：取3 mL正硅酸乙酯（TEOS）加入到60 mL乙醇中，再加入4 mL水、4 mL 10 wt%氨水和50 mL乙醇，混合均匀；取10 mL SiO2纳米颗粒溶液，加入120 µL 3-氨丙基三乙氧基硅烷；
c. 制备二氧化硅/金纳米复合颗粒溶液：取120 µL氨基化SiO2纳米颗粒溶液，加入到60 mL金纳米颗粒溶液中；
d. 制备空心金纳米球溶液：称取15 mg K2CO3溶于50 mL水中，搅拌5 min后，逐滴加入1.0 mL 1wt% HAuCl4溶液；
取50 mL K2CO3-HAuCl4生长液，加入1.0 mL二氧化硅/金纳米复合颗粒溶液，搅拌5min，加入0.5 mL 0.1 mol/L H2O2溶液；
取6 mL金纳米壳溶液，加入3 µL 0.02 mol/L氢氟酸；
e. 制备信号单元溶液：
取400 µL空心金纳米球（HGNs）溶液，超声10 min，加入10 µL 5 µmol/L引发探针溶液；
取500 µL的HGNs/HCR溶液，加入10 µL 5 mmol/L AgNO3溶液；
取500 µL的AgNPs@HGNs/HCR溶液，加入10 µL 0.5 mmol/L罗丹明6G溶液。
具体实施例二
利用上述具体实施例一制备得到的SERS生物传感器检测肿瘤标志物miRNA-141的方法，由图1所示，包括以下步骤：
（1）取5～10 µL捕获单元溶液，加入5～10 µL一定浓度的miRNA-141溶液，在37℃下孵育2 h；加入5～10 µL信号单元溶液，并在37 ℃下孵育2 h；清洗，并用磁铁进行分离，反复三次，利用拉曼光谱仪测定SERS信号；
（2）测定一系列不同浓度的miRNA-141对应的SERS信号强度，建立miRNA-141浓度与SERS信号强度之间的定量关系；根据该定量关系即可测定未知样品中miRNA-141浓度。
由图2和图3表明，该传感器的线性范围为0.1 fmol/L～1.0 pmol/L，线性关系为y=8436.6+3283.9*logx，R=0.994，线性良好，可以用于未知样品检测。
具体实施例三
为了考察该方法的准确性与实际应用价值，采用加标回收法，在血清中加入不同浓度的miRNA-141。使用本发明具体实施例二的方法检测结果可知，相对标准偏差（RSD）小于7.4%，回收率为91.5～108.5%，结果令人满意。表明本发明对于血清中miRNA-141的检测结果准确可靠。
表1 人体血清中miRNA-141的检测结果（n=5）
以上结果说明，本发明构建了一种检测miRNA-141的SERS生物传感器，实验过程中只需将捕获单元和信号单元依次加入到待测样品中反应，反应结束后通过磁分离可以马上进行检测，灵敏度高，检测限低，特异性好，操作简单，检测结果准确可靠。通过改变本SERS生物传感器中的CP、TP、H1、H2序列，即可实现不同种miRNA的高灵敏度、高特异性检测。
当然，上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。
Claims (4)
1.一种用于检测肿瘤标志物miRNA-141的SERS生物传感器的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）捕获单元制备
a. 制备Fe3O4磁性纳米颗粒溶液：将0.7～1.0 g FeCl3·6H2O和0.2～0.5 g FeCl2·4H2O溶于50～100 mL水，通氮除氧，搅拌混合均匀，升温到80～100 ℃，缓慢滴加20～25wt%氨水，调节pH=9～10，继续加热搅拌1～2 h后，停止加热，在氮气保护下，搅拌回流，冷却至室温，水清洗至中性，乙醇定容至50 mL，即得Fe3O4磁性纳米颗粒溶液；
b. 制备氨基化Fe3O4磁性纳米颗粒溶液：将40～50 mL Fe3O4磁性纳米颗粒溶液超声0.5～1 h，加入0.2～0.3 mL 3-氨丙基三乙氧基硅烷，搅拌4～5 h，加入1～2 mL 0.1～0.5mol/L硝酸溶液，继续搅拌3～4 h，水清洗至中性，乙醇定容至100 mL，即得氨基化Fe3O4磁性纳米颗粒溶液；
c. 制备Fe3O4@Au磁性纳米颗粒溶液：将5～10 mL氨基化Fe3O4磁性纳米颗粒溶液和10～20 mL 1wt% HAuCl4溶液在60～100 kHz的超声频率下混合，搅拌1 h后，缓慢加入30～50mL 20～30 mmol/L柠檬酸三钠溶液，超声2～3 h，水清洗至中性，乙醇定容至20 mL，即得Fe3O4@Au磁性纳米颗粒溶液；
d. 制备捕获单元溶液：取50～100 µL Fe3O4@Au磁性纳米颗粒溶液超声5～10 min，加入20～50 µL 1～5 µmol/L捕获探针溶液，用DNA固定液定容至200 µL，混合均匀，37 ℃下震荡3～4 h，暗处放置24 h，利用Au-S键合作用，捕获探针自组装在Fe3O4@Au磁性纳米颗粒的表面，清洗；滴加10～20 µL 10～20 mmol/L巯基己醇溶液封闭非特异性吸附位点，清洗；用缓冲液定容至100 µL，即得捕获单元溶液；
（2）信号单元制备
a. 制备金纳米颗粒溶液：取10～20 µL四羟甲基氯化磷加入到50～60 mL 6～7 mmol/L NaOH溶液中，搅拌5 min，加入1.8～2.0 mL 1wt% HAuCl4溶液，溶液颜色由亮黄色变为紫黑色再变为酒红色，继续搅拌30 min，置于4 ℃冰箱密封避光保存，陈化2周，即得金纳米颗粒溶液；
b. 制备氨基化SiO2纳米颗粒溶液：取2～3 mL正硅酸乙酯加入到40～60 mL乙醇中，再加入3～4 mL水、3～4 mL 10～20 wt%氨水和40～50 mL乙醇，混合均匀，室温下反应20 h，水清洗，乙醇定容至50 mL，得到SiO2纳米颗粒溶液；取10 mL SiO2纳米颗粒溶液，加入100～120 µL 3-氨丙基三乙氧基硅烷，混合均匀，80 ℃下烘箱中反应2 h，冷却之后，超声0.5 h，离心清洗，用水定容至10 mL，得到氨基化SiO2纳米颗粒溶液；
c. 制备二氧化硅/金纳米复合颗粒溶液：取100～120 µL氨基化SiO2纳米颗粒溶液，加入到50～60 mL金纳米颗粒溶液中，搅拌2 h，清洗，水定容至20 mL，即得二氧化硅/金纳米复合颗粒溶液；
d. 制备空心金纳米球溶液：称取10～15 mg K2CO3溶于40～50 mL水中，搅拌5 min后，逐滴加入0.8～1.0 mL 1wt% HAuCl4溶液，继续搅拌，溶液由黄色逐渐变为无色，得到K2CO3-HAuCl4生长液；取40～50 mL K2CO3-HAuCl4生长液，加入0.5～1.0 mL二氧化硅/金纳米复合颗粒溶液，搅拌5 min，加入0.3～0.5 mL 0.1 mol/L H2O2溶液，继续搅拌30 min，溶液由粉红变紫色再变蓝色最后深红色，离心清洗，水定容至20 mL，得到金纳米壳溶液；取5～6 mL金纳米壳溶液，加入2～3 µL 0.02 mol/L氢氟酸，缓慢搅拌，离心清洗，水定容至20 mL，得到空心金纳米球溶液；
e. 制备信号单元溶液：取300～400 µL空心金纳米球溶液，超声10 min，加入5～10 µL5～10 µmol/L引发探针溶液，用DNA固定液定容至500 µL，混合均匀，37 ℃下震荡3～4 h，暗处放置24 h后，加入发卡DNA 1和发卡DNA 2，37 ℃下孵育2～3 h，进行HCR扩增，离心清洗，缓冲液定容500 µL，得到HGNs/HCR溶液；取400～500 µL的HGNs/HCR溶液，加入5～10 µL5～10 mmol/L AgNO3溶液，反应20 min，Ag+吸附到HGNs表面和DNA双链中，加入10～20 µL10～20 mmol/L氢醌溶液，反应30 min，吸附的Ag+被还原为银纳米颗粒，缓冲液清洗，定容至500 µL，得到AgNPs@HGNs/HCR溶液；取400～500 µL的AgNPs@HGNs/HCR溶液，加入5～10 µL 0.5～1.0 mmol/L罗丹明6G溶液，孵育2～3 h，缓冲液清洗，即得信号单元溶液；
（3）SERS生物传感器制备
取5～10 µL捕获单元溶液，加入5～10 µL一定浓度的miRNA-141溶液，在37℃下孵育2h后；加入5～10 µL信号单元溶液，并在37 ℃下孵育2 h；清洗，并用磁铁进行分离，反复三次，得到用于检测肿瘤标志物miRNA-141的SERS生物传感器。
2.根据权利要求1所述的用于检测肿瘤标志物miRNA-141的SERS生物传感器的制备方法，其特征在于所述的捕获探针的核苷酸序列为：5’-GAA AGC CCA TCT TTA CCA GAC AGTGTT AGG TTT GGC TTT C-3’；所述的引发探针的核苷酸序列为： 5’-SH- CGG CGA TAA CAAGAA AGC CAA ACC-3’；所述的发卡DNA 1的核苷酸序列为： 5’- TAA CAA GAA AGC CAA ACCGAG ATG GGT TTG GCT TTC TTG TTA TCG CCG -3’；所述的发卡DNA 2的核苷酸序列为：5’-CAT CTC GGT TTG GCT TTC TTG TTA CGG CGA TAA CAA GAA AGC CAA ACC-3’；所述的miRNA-141的核苷酸序列为：5’-UAA CAC UGU CUG GUA AAG AUG G-3’。
3.根据权利要求1所述的用于检测肿瘤标志物miRNA-141的SERS生物传感器的制备方法，其特征在于所述的DNA固定液的配方如下：10 mmol/L Tris-HCl，1.0 mmol/L EDTA，10mmol/L三(2-羧乙基)膦和0.1 mol/L NaCl，pH为7.6～8.0；所述的缓冲液的配方如下：10mmol/L Tris-HCl，1.0 mmol/L EDTA，0.3 mol/L NaCl和1 mmol/L MgCl2，pH为7.6～8.0。
4.一种利用权利要求1-3所述的SERS生物传感器检测肿瘤标志物miRNA-141的方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）取5～10 µL捕获单元溶液，加入5～10 µL一定浓度的miRNA-141溶液，在37℃下孵育2 h；加入5～10 µL信号单元溶液，并在37 ℃下孵育2 h；清洗，并用磁铁进行分离，反复三次得到权利要求1-3所述的用于检测肿瘤标志物miRNA-141的SERS生物传感器，利用拉曼光谱仪测定SERS信号；
（2）测定一系列不同浓度的miRNA-141对应的SERS信号强度，建立miRNA-141浓度与SERS信号强度之间的定量关系；根据该定量关系即可测定未知样品中miRNA-141浓度。
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