CN109946285B - 用于检测肺癌标志物miR-196a的金银纳米线SERS传感器的制备方法及传感器 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于检测肺癌标志物miR‑196a的金银纳米线SERS传感器的制备方法及SERS传感器，该方法包括1）将带正电荷的金纳米颗粒以及带负电荷的银纳米线混合，利用静电吸附作用将带正电荷的金纳米颗粒修饰到带负电荷的银纳米线上制备金银双金属纳米线；2）将步骤1）制备得到的金银双金属纳米线偶联到氨基化处理的硅片的抛光面上，制备得到金银纳米线均匀、致密排列的SERS基底；3）在SERS基底表面修饰拉曼信号分子5‑FAM标记的发卡结构DNA探针，构建SERS传感器。本发明具有灵敏度高、特异性强、组装过程简单、检测速度快等优点。

Description

用于检测肺癌标志物miR-196a的金银纳米线SERS传感器的制 备方法及传感器

技术领域

本发明属于材料技术领域，涉及一种SERS传感器的制备方法及SERS传感器，尤其涉及一种用于检测肺癌标志物miR-196a的金银纳米线SERS传感器的制备方法及SERS传感器。

背景技术

肺癌的发病率及病死率近年来逐渐上升，肺癌成为全球死亡率最高的恶性肿瘤之一。据报道，我国2015年新发肺癌病例约73万人，死于肺癌病例约61万人。肺癌主要分为肺癌分为小细胞肺癌(SCLC)和非小细胞肺癌(NSCLC)，其中NSCLC约占80％。近年来，肺癌的外科手术技术、化疗、放疗以及免疫治疗取得了明显的进展，但是肺癌总体预后较差，5年生存率只有15％，其中I期肺癌为80％，而IV期则低于10％，主要是因为肺癌是无症状的，难以诊断以及其进展中的生物学变化机制不能完全明确。因此，高特异性的肿瘤标志物的检测成为肺癌诊断及有效治疗的关键。

微小RNA(miRNA)是近年来发现的一类长约19-22个核苷酸的非编码单链小分子RNA，通过特异性降解mRNA或抑制蛋白翻译来调控靶基因表达在肿瘤细胞增殖、侵袭、转移和凋亡中发挥着重要的调控作用功能，可以作为恶性肿瘤的诊断标志物及靶向治疗基因。miRNA是近年来肺癌研究中的热点，不断有研究证实miR-196a在肺癌的发生和发展中起着举足轻重的作用。miRNA-196a通过调控CDKN1B和HOXA9基因，激活PI3K/Akt通路，从而介导的细胞增殖，迁移和致瘤的活动。由于miRNA在肺癌早期患者的体液和细胞中表达量极少且具有同源性特点，这就要求筛选技术具有很高的灵敏度和特异性。传统检测方法如Northern杂交、原位杂交、实时定量PCR、微阵列技术等操作复杂、耗时、灵敏度低，很难满足生物样品检测的需要。因此，探索一种操作简单、灵敏度高、重复性好和特异性强的miRNA检测技术成为当前急需解决的问题。

表面增强拉曼散射(SERS)是一种新兴的光谱分析技术，具备灵敏度度高、特异性强、无损和非侵入性振动检测等特征，在生物、化学和医学等领域有了很广泛的应用。SERS主要借助于纳米尺度的粗糙金属的表面达到增强检测信号的现象。当被检测物质接近具有增强效应的纳米材料时，拉曼散射可以增强到大约14个数量级，从而达到单分子的检测水平。此外，与其他光谱技术相比，SERS还具有稳定、窄光谱线、不易猝灭、不受背景荧光干扰等特点。当前，许多科研小组开展了miRNA的SERS研究，并取得了丰硕成果。然而SERS检测RNA的技术真正走入临床应用还面临诸多需要解决的难题。首要问题是制备表面增强性能优异便于使用、易于制备、均一且可重复性好，具有较好的生物相容性的SERS基底。金银纳米线是一种新型的、极有前景的等离子体共振材料。金纳米颗粒靠近银纳米线时，金纳米颗粒可以起到纳米天线的作用，使光通过金纳米颗粒与银纳米线的传播等离子基元耦合，且在颗粒与银纳米线间隙处形成热点，可以大大增强拉曼信号。目前合成金银纳米线的方法相对复杂、所需时间长、所需成本高，发展一种简单快速方法仍是一项具有挑战性的工作。通过自组装工艺、物理蒸发镀膜技术、纳米压印光刻技术等手段，将纳米粒子组装到硅片、ITO玻璃等材料上构建SERS基底，也可以进一步提升检测的高灵敏性和可靠性。另一关键问题是探索简单快速、稳定、高效的检测结构的技术。目前已知的三明治检测结构模型需要二次杂化，SERS联合酶切技术需要双链特异性核酸酶作用于miRNA-DNA双链，这些检测模型较复杂且繁琐。发卡检测结构是一种新型检测模型，不同于三明治检测模型或SERS联合酶切技术，发卡结构检测模型只要简单的一步配对杂化，不需要三明治结构的二次杂化，具有检测简单快速、用量少、高通量等优点。将金银纳米线基底的SERS效应和发卡结构检测模型相结合，用于miRNA的研究在国内尚无相关报道。既往SERS对肺癌的研究多数集中在CEA、NSE、CK-19等蛋白质类相关指标，涉及miRNA相关的研究也鲜有报道。

发明内容

为了解决背景技术中存在的上述技术问题，本发明提供了一种灵敏度高、特异性强、组装过程简单、检测速度快的用于检测肺癌标志物miR-196a的金银纳米线SERS传感器的制备方法及SERS传感器。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种用于检测肺癌标志物miR-196a的金银纳米线SERS传感器的制备方法，所述用于检测肺癌标志物miR-196a的金银纳米线SERS传感器的制备方法包括以下步骤：

1)将带正电荷的金纳米颗粒以及带负电荷的银纳米线混合，利用静电吸附作用将带正电荷的金纳米颗粒修饰到带负电荷的银纳米线上制备金银双金属纳米线；

2)将步骤1)制备得到的金银双金属纳米线偶联到氨基化处理的硅片的抛光面上，制备得到金银纳米线均匀、致密排列的SERS基底；

3)在SERS基底表面修饰拉曼信号分子5-FAM标记的发卡结构DNA探针，构建SERS传感器。

作为优选，本发明所采用的步骤1)的具体实现方式是：

1.1)将乙二醇加入三口烧瓶中在160℃条件下冷凝回流，将0.1M硝酸银溶液与0.2M聚乙烯吡咯烷酮溶液同时以0.3mL/min的速度缓慢滴加到搅拌的乙二醇中，滴加完毕后反应持续，待银纳米线冷却至25℃±2℃后分别用丙酮和超纯水清洗后待用，形成带负电荷的银纳米线；

1.2)在转速是700rpm的搅拌条件下将0.15mM硼氢化钠溶液加入到24.3mM氯金酸溶液中，制备金纳米颗粒，在常温下反应，合成带正电荷的金纳米颗粒；

1.3)将步骤1.1)合成得到的带负电荷的银纳米线与步骤1.2)合成得到的带正电荷的金纳米颗粒混合，搅拌后，带正电荷的金纳米颗粒吸附至带负电荷的银纳米线上，形成金银双金属纳米线。

作为优选，本发明所采用的步骤1.3)中带负电荷的银纳米线与带正电荷的金纳米颗粒的体积比是20∶1。

作为优选，本发明所采用的步骤2)的具体实现方式是：

2.1)将单晶硅片切割成小正方形，对小正方形的单晶硅片进行预处理，除去小正方形的单晶硅片表面的有机物；用硫酸-双氧水溶液对干净的小正方形的单晶硅片活化，使小正方形的单晶硅片表面-OH增加；将已活化好的端基为羟基的小正方形的单晶硅片竖直浸入浓度是1％的3-氨丙基三乙氧基硅烷-乙醇溶液中，获得氨基化的硅片；在氨基化完成后使用无水乙醇清洗硅片，80℃烘干；

2.2)将步骤2.1)制备得到的氨基化好的硅片抛光面向上放置在步骤1)所合成的金银双金属纳米线溶液中，使金银双金属纳米线充分偶联到硅片表面，取出用超纯水清洗后烘干，得到金银纳米线均匀、致密排列的SERS基底。

作为优选，本发明所采用的步骤2.1)中的活化的具体实现方式是：在80℃水浴条件下，将干净的硅片置于硫酸-双氧水溶液中1h；所述硫酸-双氧水溶液中硫酸与双氧水的体积比是7∶3。

作为优选，本发明所采用的步骤3)的具体实现方式是：

3.1)将50μL 10μM发夹结构的DNA探针滴加到步骤2)制备得到的SERS基底表面，在25℃80％湿度环境中孵育条件下共培养，所述发夹结构的DNA记为hpDNA；所述hpDNA的核苷酸序列是5′-SH-CCCGAAYCACAGTGAAACTACTAAGAGTAAGAGACCTTTAA-5FAM-3′；所述hpDNA的核苷酸序列能够与待测目标miRNA的核苷酸序列特异性互补配对；所述待测目标miRNA是肺癌标志物为miR-196a；

3.2)将hpDNA功能化的SERS基底在PBS缓冲液中浸泡30min，使hpDNA形态保持稳定；

3.3)使用巯基己醇封闭基片表面裸露的位点，并用PBS缓冲液轻轻冲洗干净，得到用于检测肺癌标志物的金银纳米线SERS传感器。

作为优选，本发明所采用的步骤3.1)中在25℃80％湿度环境中孵育条件下共培养的时间不大于180min。

基于如前所述的用于检测肺癌标志物miR-196a的金银纳米线SERS传感器的制备方法制备形成的用于检测肺癌标志物miR-196a的金银纳米线SERS传感器。

一种利用用于检测肺癌标志物miR-196a的金银纳米线SERS传感器检测待检测样本中miR-196a的方法，所述检测方法包括以下步骤：

1)用PBS缓冲液或细胞裂解液分散miR-196a标准样，配置得到不同浓度的miR-196a标准样的混合溶液；将不同浓度的待检测物溶液点样到用于检测肺癌标志物miR-196a的金银纳米线SERS传感器上，在37℃恒温箱进行杂交反应；取出用于检测肺癌标志物miR-196a的金银纳米线SERS传感器用PBS缓冲液轻轻冲洗后进行SERS测试，检测得到5-FAM的信号；根据5-FAM在1334cm^-1的特征信号作miR-196a浓度和SERS信号强度变化量的工作曲线；

2)将肺癌细胞和肺上皮细胞裂解后，形成待检测样本，将待检测样本点样到用于检测肺癌标志物miR-196a的金银纳米线SERS传感器上，在37℃恒温箱进行杂交反应；取出用于检测肺癌标志物miR-196a的金银纳米线SERS传感器用PBS缓冲液轻轻冲洗后进行SERS测试，检测得到待检测样本的5-FAM的信号；

3)将步骤2)检测得到的待检测样本的5-FAM的信号代入步骤1)所确定的工作曲线中，测定待检测样本中miR-196a的浓度。

作为优选，本发明所采用的在37℃恒温箱进行杂交反应时的杂交时间是不低于120min。

与现有的检测miRNA的SERS传感器相比，本发明具有以下优点：

本发明提供了一种用于检测肺癌标志物miR-196a的金银纳米线SERS传感器的制备方法及基于该方法所形成的传感器。本发明首先将带有正电荷的金纳米颗粒和带有负电荷的银纳米线按照一定的比例混合，利用静电吸附作用将金纳米颗粒修饰到银纳米线上制备金银双金属纳米线。接着将金银纳米线偶联到氨基化处理的硅片的抛光面上，制备得到金银纳米线均匀、致密排列的SERS基底。最后在基底表面修饰拉曼信号分子5-FAM标记的发卡结构DNA探针(hpDNA)，通过优化制备条件，构建SERS传感器。该传感器具有组装过程简单、特异性强、均一性好、重复性优和灵敏度高等优点。通过测定PBS缓冲液和细胞裂解液中不同浓度miR-196a对应的SERS信号强度，建立miR-196a的浓度和SERS信号强度之间的定量关系。根据定量关系检测了肺癌细胞裂解液中miR-196a的浓度，准确性非常高。结果表明本发明的SERS传感器可用于临床样本样品中低丰度肿瘤核酸标志物的快速、定量、高灵敏检测，为拓展SERS在肺癌早期检测中的广泛应用提供了技术支持。

本发明所提供的金银纳米线合成方法只需将负电荷银纳米线与正电荷金纳米颗粒混合，在1h左右时间内即可完成金银纳米线合成。原料廉价易得，工艺简单、合成条件温和等，适用于后续SERS基底的组装。本发明涉及的SERS基底制备方法简单，可操作性强，不需要特殊的仪器设备。实验成本低，所需的试剂均为常用化学试剂。本发明制备的SERS基底具有很好的重复性，能够实现规模化制备。本发明提出的发卡结构(hpDNA)检测模型是一种新型检测模型，不同于三明治检测模型或SERS联合酶切技术，发卡结构检测模型只要简单的一步配对杂化，不需要三明治结构的二次杂化，具有检测简单快速、用量少、高通量等优点。既往对肺癌的研究多数集中于对CEA、NSE、CK-19等蛋白质类相关指标的检测，涉及miRNA的研究目前还相对较少。miR-196a在转录后水平调控基因表达，参与调控肺癌细胞迁移、侵袭、转移和凋亡，非常有望成为肿瘤标志物。本发明公开了一种检测肺癌标志物miR-196a的金银纳米线SERS传感器的制备方法。金银纳米线采用的是静电吸附方法合成，反应条件温和，方法简单。接着将金银纳米线沉积并静电自组装到氨基化处理的硅片表面，形成均匀、致密排列的结构，从而得到了高性能的SERS基底。最后将hpDNA修饰到基底表面，构建得到SERS传感器，最终实现miR-196a的检测。

附图说明

图1A是本发明所制备的银纳米线的SEM照片；

图1B是本发明所制备的银纳米线的TEM照片；

图1C是本发明所合成的金银纳米线的SEM照片；

图1D是本发明所合成的金银纳米线的高分辨TEM照片；

图1E是本发明所合成的金银纳米线中银元素的EDX成像图；

图1F是本发明所合成的金银纳米线中金元素的EDX成像图；

图1G是本发明所制备的银纳米线的EDX光谱图；

图1H是本发明所合成的金银纳米线的EDX光谱图；

图1I是拉曼信号分子NBA(a)、NBA标记银纳米线(b)及NBA标记金银纳米线(c)的拉曼光谱图；

图1J是NBA标记银纳米线及NBA标记金银纳米线的拉曼光谱在592cm^-1特征峰处SERS强度的柱形图；

图2A是本发明所合成的金银纳米线SERS传感器的制备过程示意图；

图2B是本发明所合成的金银纳米线SERS传感器用于检测肺癌细胞中miR-196a的流程示意图；

图3A是本发明所合成的金银纳米线基底的SEM照片；

图3B是NBA标记的金银纳米线基底的SERS成像照片；

图3C是miR-196a的SERS光谱图；

图3D是5-FAM在1334cm^-1特征峰处强度与SERS传感器组装时间之间的关系图；

图3E是本发明所制备的SERS传感器的检测miR-196a不同位置6个点的SERS光谱图；

图3F是本发明所制备的SERS传感器的检测miR-196a不同位置6个点在1334cm^-1处强度的柱形图；

图3G是本发明所制备的SERS传感器的重现性图；

图3H是本发明所制备的3个不同的SERS传感器在1334cm^-1处强度的柱形图；

图3I是本发明所制备的SERS传感器检测互补miR-196a(三角形)、非互补miRNA-10a(方块形)和单碱基错配miRNA(圆形)在1334cm^-1特征峰处强度与时间之间的关系图；

图3J是本发明所制备的SERS传感器特异性表征图；

图4A是本发明所制备的SERS免疫传感器用于检测PBS缓冲液中不同浓度miR-196a及初始信号的SERS光谱图；

图4B是PBS缓冲液中miR-196a各浓度SERS光谱在1334cm^-1特征峰处强度与初始信号强度的差值和miR-196a浓度的对数的线性拟合图；

图4C是本发明所制备的SERS免疫传感器用于检测细胞裂解液中不同浓度miR-196a及初始信号的SERS光谱图；

图4D是细胞裂解液中miR-196a各浓度SERS光谱在1334cm^-1特征峰处强度与初始信号强度的差值和miR-196a浓度的对数的线性拟合图；

图5A是肺癌细胞A549和肺泡上皮细胞BEAS-2B中miR-196a的平均SERS光谱图；

图5B是本发明所制备的SERS传感器和实时定量PCR(RT-PCR)检测miR-196a浓度的柱形图。

具体实施方式

为了加深对本发明的理解，将结合实施例和附图对本发明做进一步详述。

本发明所用的仪器设备以及测试条件如下：

扫描电子显微镜(TEM)照片是由日本日立公司生产的S-4800II型场发射扫描电子显微镜测得。

透射电子显微镜(SEM)照片是由荷兰飞利浦公司生产的TECNAI 10型投射电子显微镜测得。

拉曼光谱及SERS成像是由英国雷尼绍公司生产的Invia Reflex型激光显微拉曼光谱仪测得。测试条件为激光波长785nm，曝光时间为10s，激光强度为50mW，50×物镜。

细胞破碎是由巩义市予华仪器有限公司生产的Sciemz-IID型超声波细胞破碎仪破碎。

实施例1一种银纳米线与金纳米颗粒耦合金银纳米线的合成及表征

1)将10mL乙二醇加入在三口烧瓶，在160℃条件下冷凝回流1h，然后同时将5mL0.1M硝酸银溶液与5mL 0.2M聚乙烯吡咯烷酮同时以0.3mL/min的速度逐滴加入搅拌的乙二醇中，滴加完毕后反应持续1h，银纳米线冷却至室温(25℃±2℃)后用分别用丙酮和超纯水洗三遍后待用，制备得到银纳米线。

2)将50μL24.3mM氯金酸溶液加入50mL烧杯中，接着在剧烈搅拌(700rpm)下将20mL0.15mM硼氢化钠溶液加入烧杯。在常温下反应40min为止，即合成了带正电荷的金纳米颗粒。

3)将20mL银纳米线和1mL金纳米颗粒分别加入烧杯中，搅拌1h，即制备得到金银纳米线。

4)银纳米线和金银纳米线的形貌及SERS效应的表征。

通过SEM和TEM检测银纳米线和金银纳米线的形貌。室温下，配制50mL浓度为1×10^-3M的NBA水溶液，在4℃条件下保存。将50μL浓度为1×10^-3M的NBA水溶液加入0.5mL合成的银纳米线或金银纳米线溶液中，混合均匀。将混合液静置1h后检测其拉曼光谱。

参见图1A以及图1B，分别是合成的银纳米线的SEM照片和TEM照片。由图1A以及图1B可知，银纳米线具有比较高的长径比，长度平均大概在10μm左右，直径大约在80nm左右。大量线性结构的银纳米线生产，只有少量的银纳米立方颗粒出现。合成的银纳米线由于表面上吸附着聚乙烯吡咯烷酮而带上负电荷。图1C和图1D是金银纳米线的SEM照片和高分辨TEM照片。与之前合成的银纳米线的光滑表面相比，可以明显看到静电吸附金纳米颗粒后银纳米线的表面变得凹凸不平。高分辨TEM照片则可以更清楚地看到银纳米线表面单层分布的微小的金纳米颗粒。为了进一步证明吸附在银纳米线表面的颗粒是合成的金纳米颗粒以及金纳米颗粒在银纳米线表面分布的均一性，对合成的双金属纳米结构进行了金和银元素的成像分析及相应的EDX光谱表征。图1E和图1F是金和银元素在双金属纳米结构中的分布。从图中可以明显看出，银元素的图片较之金元素的图片要细一些，而且二者的分布都很均匀，这说明在银纳米线的表面均匀吸附了金纳米颗粒。在EDX光谱进一步证实了这种结论(图1G和图1H)。图1I和图1J为银纳米线和金银纳米线分别作为增强基底测得的10^-5M NBA的SERS光谱。金银纳米线测得NBA的SERS光谱的信号强度远大于银纳米线。银纳米线与金纳米颗粒之间的耦合，产生更多的“热点”，得到的很强的SERS信号。

实施例2金银纳米线基底的制备及表征

1)同实施例1制备金银纳米线。

2)将单晶硅片切割成1em×1em的小正方形。然后分别用丙酮、无水乙醇、去离子水超声清洗3次，每次清洗时间为20min，确保硅片的清洁，最后用氮气吹干待用。将清洁干净的硅片放置在体积比7∶3的98％浓硫酸、30％双氧水混合溶液，在80℃条件下水浴1h，使硅片表面的-OH增加，最后用超纯水充分冲洗硅片表面三次，以消除杂质离子硫酸根的吸附。

3)将已经活化的端基为羟基的硅片竖直浸入0.1％3-氨丙基三乙氧基硅烷-乙醇溶液中，密闭条件下放置12h，使硅片表面联上氨基，取出用超纯水冲洗3次后用氮气吹干。保持硅片抛光面向上放置于金银纳米线溶液中24h，使金银纳米线沉积并静电吸附到硅片表面。取出金银纳米线修饰的硅片，用超纯水清洗3次，在80℃条件下烘干，即可获得本发明所述的金银纳米线基底，基底的制备流程见图2A。

4)金银纳米线基底的形貌及SERS均一性的表征。

通过SEM检测金银纳米线基底的形貌。对SERS基底的均一性进行评价。以NBA作为拉曼信号分子对SERS活性基底的均一性进行评价。取1片制备的基底，浸入浓度1×10^-4M的NBA溶液中，静置2h后取出晾干。将晾干的NBA标记的基底置于拉曼光谱仪上，根据NBA在592cm^-1处特征峰的强度对基底进行SERS成像，激光扫描基底上被选择的区域，点与点的间隔为50mm，曝光时间为10s。

图3A是金银纳米线基底的SEM照片，由图3A可知，在基底表面的金银纳米线分布均匀、致密。图3B是4-MBA标记的基底的SERS成像，如图3B可知，该基底在592cm^-1特征峰处信号较均匀，具有良好的均一性。

实施例3SERS传感器的优化制备

1)同实施例2制备金银纳米线基底。

2)将50μL10μM发夹结构的DNA探针(核苷酸序列是5′-SH-CCCGAAYCACAGTGAAACTACTAAGAGTAAGAGACCTTTAA-5FAM-3′，其中：3′-端修饰拉曼信号分子5-FAM；5′-端修饰巯基基团，能够通过Au-S键连接到基底表面，该序列能够与待测目标miRNA的核苷酸序列特异性互补配对，序列表SEQ ID No.1)滴加到金银纳米线基底表面，放置在25℃80％湿度的培养箱中孵育条件下共培养，每隔15min进行SERS测试，筛选hpDNA的最佳组装时间(在25℃80％湿度环境中孵育条件下共培养的时间)。接着将hpDNA功能化的金银纳米线基底在PBS缓冲液中浸泡30min，使hpDNA形态保持稳定；纯化后形成具有闭合茎环、稳定的发夹结构。使用巯基己醇封闭基片表面裸露的位点，并用PBS缓冲液轻轻冲洗干净，即可得到本发明所述的miR-196a检测的SERS传感器。

3)将待测miR-196a点样到最佳组装时间制备得到的SERS传感器上，在37℃恒温箱进行杂交反应。每隔10min，取出传感器用PBS缓冲液轻轻冲洗后进行SERS测试，筛选最佳杂交时间。在测试区域随机选择10个位置进行SERS检测，并获得平均的SERS光谱。

4)hpDNA的组装时间决定hpDNA探针在金银纳米线基底表面的组装数量。图3C和图3D所示，选取1334cm^-1处的SERS强度(I₁₃₃₄)与组装时间绘制的曲线。可以清楚地观察到，当组装时间＜90min时，I₁₃₃₄随着组装时间几乎线性增加；当组装时间＝180min，I₁₃₃₄增加逐渐减慢；当组装时间＞180min时，I₁₃₃₄几乎饱和。结果表明hpDNA在金银纳米线表面的组装数量达到最大值，因此，最佳组装时间为180min。待检测物和传感器之间的杂交时间决定了miR-196a与hpDNA有效杂交需要的时间，这是实现传感器良好性能的另一个关键参数。当杂交时间＜60min，I₁₃₃₄衰减迅速；当杂交时间进一步增加时，I₁₃₃₄衰减缓慢；当杂交时间＞110min时，I₁₃₃₄最终达到稳定。I₁₃₃₄的明显衰减表明固定在基底上的hpDNA探针能够与miR-196a有良好杂交活性，并且为获得最大且稳定的SERS信号变化，最佳杂交时间为120min。

实施例4SERS传感器的稳定性、重复性及特异性

1)同实施例3制备SERS传感器。

2)分别将10μM互补miR-196a(序列表SEQ ID No.2)、非互补miRNA-10a(序列表SEQID No.3)和单碱基错配miRNA(序列表SEQ ID No.4)(见表1)与SERS传感器共同孵育，在37℃恒温箱杂交反应实施例3中的最佳杂交时间，分别取出传感器用PBS缓冲液轻轻冲洗后进行SERS测试，评估SERS传感器的特异性。使用SERS传感器检测100pM miR-196a，在测试区域检测6个不同位置，对比它们光谱差异，评估SERS传感器的均一性。为研究传感器的重现性，以相同的方式制备3个SERS传感器，然后用于检测100pM miR-196a。金银纳米线SERS传感器用于检测肺癌细胞中miR-196a的流程，请参见图2B。

表1特异性检测实验设计

图3E和图3F为SERS传感器测得miR-196a，在传感器的6个不同位置处的测得的SERS光谱。这些光谱的强度无明显差异，表明SERS传感器有很好的均一性。图3G和图3H为SERS传感器的重复性。3个传感器的检测miR-196a的SERS光谱几乎没有差异。表明SERS传感器在miRNA检测中具有良好的可重复性。图3I和图3J显示出互补miR-196a、非互补miRNA-10a和单碱基错配miRNA杂交后稳定的SERS光谱。所有SERS光谱具有相似的特征峰，相对于初始信号，非互补miRNA-10a仅观察到I₁₃₃₄轻微的变化，单碱基错配miRNA的SERS强度变化相对于初始信号下降约为30％，而互补miR-196a的I₁₃₃₄变化为约为81％。表明SERS感器可以有效的、特异性的识别目标miR-196a。

实施例5SERS传感器检测样本中miR-196a

1)同实施例3制备SERS传感器。

2)将miR-196a分散到PBS缓冲液或细胞裂解液，配置得到浓度1fM、10fM、100fM、1pM、10pM、100pM的miR-196a的混合溶液。将SERS传感器与不同浓度的miR-196a溶液，在37℃恒温箱杂交反应实施例3中的最佳杂交时间，取出传感器用PBS缓冲液冲洗后进行SERS测试，检测得到5-FAM的信号。根据5-FAM在1334cm^-1的特征信号作miR-196a浓度和SERS信号强度变化量的工作曲线。将1×10⁵个/mL肺癌细胞和肺上皮细胞裂解，将细胞裂解液点样到SERS传感器上，在37℃恒温箱进行杂交反应实施例3中的最佳杂交时间；取出传感器用PBS缓冲液轻轻冲洗后进行SERS测试。

3)图4A是SERS传感器检测PBS缓冲液中不同浓度的miR-196a的SERS光谱。SERS传感器与miR-196a杂交后，随着miR-196a浓度的增加，SERS强度衰减的越多。对于1334cm^-1特征峰处SERS强度差ΔI，ΔI＝I₀-I，其中I₀表示SERS传感器“原始”SERS峰强度，I是杂交后的强度。ΔI与miR-196a浓度C_miR-196a的对数(log[C_miR-196a])的关系如图4B所示。ΔI与log[C_miR-196a]呈现出良好的线性关系，最佳拟合的工作曲线为AI＝1177.5log[C_miR-196a]-19059，R²＝0.9873。而且痕量的miR-196a仍能有明显可区分的SERS强度变化，浓度低至1fM。通过计算得到miR-196a的LOD为65.16aM。SERS传感器被用来进一步检测细胞裂解液中不同浓度的miR-196a。如附图4C和4D所示，ΔI与log[C_miR-196a]在1fM至100pM范围内呈现出良好的线性关系，最佳拟合的工作曲线为ΔI＝1091.1log[C_miR-196a]+18026，计算得到的LOD为30.13aM。结果表明，所制备的SERS传感器对于PBS缓冲液和细胞裂解液中痕量miR-196a具有高灵敏传感性能。图5A和图5B显示A549细胞中miR-196a的表达量低于BEAS-2B细胞中miR-196a的表达量，且SERS和RT-PCR检测结果一致。表明该SERS传感器在临床样品的核酸检测中具有良好的应用前景。

序列表

<110> 扬州大学

<120> 用于检测肺癌标志物miR-196a的金银纳米线SERS传感器的制备方法及传感器

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cccgaaycac agtgaaacta ctaagagtaa gagaccttta a 41

<210> 2

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

uaguaguuuc acugugauuc ggg 23

<210> 3

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

uacccuguag auccgaauuu gug 23

<210> 4

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

uaguaguuuc acugagauuc ggg 23

Claims (8)

1.一种用于检测肺癌标志物miR-196a的金银纳米线SERS传感器的制备方法，其特征在于：所述用于检测肺癌标志物miR-196a的金银纳米线SERS传感器的制备方法包括以下步骤：

1)将带正电荷的金纳米颗粒以及带负电荷的银纳米线混合，利用静电吸附作用将带正电荷的金纳米颗粒修饰到带负电荷的银纳米线上制备金银双金属纳米线；

2)将步骤1)制备得到的金银双金属纳米线偶联到氨基化处理的硅片的抛光面上，制备得到金银纳米线均匀、致密排列的SERS基底；

所述步骤2)的具体实现方式是：

2.1)将单晶硅片切割成小正方形，对小正方形的单晶硅片进行预处理，除去小正方形的单晶硅片表面的有机物；在80℃水浴条件下，将干净的硅片置于体积比是7∶3的硫酸-双氧水溶液中1h，对干净的小正方形的单晶硅片活化，使小正方形的单晶硅片表面-OH增加；将已活化好的端基为羟基的小正方形的单晶硅片竖直浸入浓度是1％的3-氨丙基三乙氧基硅烷-乙醇溶液中，获得氨基化的硅片；在氨基化完成后使用无水乙醇清洗硅片，80℃烘干；

2.2)将步骤2.1)制备得到的氨基化好的硅片抛光面向上放置在步骤1)所合成的金银双金属纳米线溶液中，使金银双金属纳米线充分偶联到硅片表面，取出用超纯水清洗后烘干，得到金银纳米线均匀、致密排列的SERS基底；

3)在SERS基底表面修饰拉曼信号分子5-FAM标记的发卡结构DNA探针，构建SERS传感器；

所述发卡结构DNA探针记为hpDNA；所述hpDNA的核苷酸序列是5′-SH-CCCGAAYCACAGTG AAACTACTAAGAGTAAGAGACCTTTAA-5FAM-3′。

2.根据权利要求1所述的用于检测肺癌标志物miR-196a的金银纳米线SERS传感器的制备方法，其特征在于：所述步骤1)的具体实现方式是：

1.1)将乙二醇加入三口烧瓶中在160℃条件下冷凝回流，将0.1M硝酸银溶液与0.2M聚乙烯吡咯烷酮溶液同时以0.3mL/min的速度缓慢滴加到搅拌的乙二醇中，滴加完毕后反应持续，待银纳米线冷却至25℃±2℃后分别用丙酮和超纯水清洗后待用，形成带负电荷的银纳米线；

1.2)在700rpm的条件下将0.15mM硼氢化钠溶液加入到24.3mM氯金酸溶液中，制备金纳米颗粒，在常温下反应，合成带正电荷的金纳米颗粒；

1.3)将步骤1.1)合成得到的带负电荷的银纳米线与步骤1.2)合成得到的带正电荷的金纳米颗粒混合，搅拌后，带正电荷的金纳米颗粒吸附至带负电荷的银纳米线上，形成金银双金属纳米线。

3.根据权利要求2所述的用于检测肺癌标志物miR-196a的金银纳米线SERS传感器的制备方法，其特征在于：所述步骤1.3)中带负电荷的银纳米线与带正电荷的金纳米颗粒的体积比是20∶1。

4.根据权利要求1所述的用于检测肺癌标志物miR-196a的金银纳米线SERS传感器的制备方法，其特征在于：所述步骤3)的具体实现方式是：

3.1)将50μL 10μM发夹结构的DNA探针滴加到步骤2)制备得到的SERS基底表面，在25℃80％湿度环境中孵育条件下共培养，；所述hpDNA的核苷酸序列能够与待测目标miRNA的核苷酸序列特异性互补配对；所述待测目标miRNA是肺癌标志物为miR-196a；

3.2)将hpDNA功能化的SERS基底在PBS缓冲液中浸泡30min，使hpDNA形态保持稳定；

3.3)使用巯基己醇封闭基片表面裸露的位点，并用PBS缓冲液轻轻冲洗干净，得到用于检测肺癌标志物的金银纳米线SERS传感器。

5.根据权利要求4所述的用于检测肺癌标志物miR-196a的金银纳米线SERS传感器的制备方法，其特征在于：所述步骤3.1)中在25℃80％湿度环境中孵育条件下共培养的时间不大于180min。

6.基于权利要求5所述的用于检测肺癌标志物miR-196a的金银纳米线SERS传感器的制备方法制备形成的用于检测肺癌标志物miR-196a的金银纳米线SERS传感器。

7.一种利用基于权利要求5所述的用于检测肺癌标志物miR-196a的金银纳米线SERS传感器的制备方法制备形成的用于检测肺癌标志物miR-196a的金银纳米线SERS传感器检测待检测样本中miR-196a的方法，其特征在于：所述检测方法包括以下步骤：

1)用PBS缓冲液或细胞裂解液分散miR-196a标准样，配置得到不同浓度的miR-196a标准样的混合溶液；将不同浓度的待检测物溶液点样到如权利要求8制备形成的用于检测肺癌标志物miR-196a的金银纳米线SERS传感器上，在37℃恒温箱进行杂交反应；取出用于检测肺癌标志物miR-196a的金银纳米线SERS传感器用PBS缓冲液轻轻冲洗后进行SERS测试，检测得到5-FAM的信号；根据5-FAM在1334cm^-1的特征信号作miR-196a浓度和SERS信号强度变化量的工作曲线；

2)将肺癌细胞和肺上皮细胞裂解后，形成待检测样本，将待检测样本点样到如权利要求6制备形成的用于检测肺癌标志物miR-196a的金银纳米线SERS传感器上，在37℃恒温箱进行杂交反应；取出用于检测肺癌标志物miR-196a的金银纳米线SERS传感器用PBS缓冲液轻轻冲洗后进行SERS测试，检测得到待检测样本的5-FAM的信号；

3)将步骤2)检测得到的待检测样本的5-FAM的信号代入步骤1)所确定的工作曲线中，测定待检测样本中miR-196a的浓度。

8.根据权利要求7所述的检测待检测样本中miR-196a的方法，其特征在于：所述在37℃恒温箱进行杂交反应时的杂交时间是不低于120min。

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