CZ34808U1

CZ34808U1 - Povrchově modifikované částice

Info

Publication number: CZ34808U1
Application number: CZ202038027U
Authority: CZ
Inventors: Petr CĂgler; Petr Mgr. Cígler; Jitka Neburková; Jitka Mgr. Neburková; Jiří Schimer; Jiří Mgr Schimer; Miroslava Guricová; Miroslava Ing. Guricová; Marian HajdĂşch; Marian doc. Mudr. Hajdúch; Hana Jaworek; Hana Mgr Jaworek; Martin Ondra; Martin Mgr. Ondra; Agáta Kubíčková; Agáta Mgr. Kubíčková
Original assignee: Ústav organické chemie a biochemie AV ČR, v. v. i.; Univerzita Palackého v Olomouci
Priority date: 2020-09-29
Filing date: 2020-09-29
Publication date: 2021-01-28

Description

Povrchově modifikované částice

Oblast techniky

Technické řešení se týká částic, umožňujících přímou optickou detekci v in vitro diagnostice závažných onemocnění.

Dosavadní stav techniky

Diagnostické metody jsou v současnosti základem pro úspěšnou léčbu prakticky všech onemocnění. Laboratorní vyšetření vzorku tělních tekutin či tkání je často prováděno metodami tzv. in vitro diagnostiky. Takto získané výsledky slouží mimo jiné k vyhledávání nemocí (screening, například diabetes, onemocnění prostaty, nádory tlustého střeva a konečníku), k určení či upřesnění diagnózy, k určení prognózy či k epidemiologickým studiím. Biologický znak, (bio)marker, může být vyšetřován na úrovni metabolické, genomické (DNA i RNA) nebo proteinové. Mezi nejčastěji používané techniky v této oblasti patří imunohistochemie (IHC) a in situ hybridizační techniky (ISH).

Principem IHC je stanovení zvýšené exprese proteinu na úrovni tkáňové anebo buněčné. Technické detaily provedení se od sebe v určitých bodech liší, například rozdílné doby inkubace, druhy použitých protilátek, jejich ředění atd. Nejčastěji se technika provádí na parafinizovaných tkáních, které se nejprve deparafinizují a rehydratují. Poté se blokují nespecifické vazby imunoglobulinů v blokačním roztoku inertní bílkoviny. Po promytí se vzorky inkubují s primární anti-protilátkou. Po promytí je nej častěji aplikována sekundární protilátka, konjugovaná s vhodným detekčním systémem. Vizualizace probíhá například pomocí enzymu peroxidázy a diaminobenzidinu za vzniku hnědého nerozpustného barviva, které vizualizuje oblast tkáně s pozitivním signálem. Preparát se zalije pod krycí sklíčko a hodnotí ve světelném mikroskopu. Problémem IHC detekce bývá například pozadí endogenní enzymatické aktivity (např. peroxidázová aktivita v makrofázích) i nižší ostrost signálu (difúze substrátu při enzymatické reakci) ve srovnání například s fluorescenčním značením.

Techniky ISH mají vysokou specifitu, reprodukovatelnost a rychlost stanovení (do 24 hodin). Pomocí nich lze stanovit počet jednotlivých onkogenu v buněčném jádře. Preparáty jsou přeneseny do vodného pufru a následně denaturovány ve formamidovém pufru, promývány ethanolem a inkubovány se značenou detekční sondou. Tyto metody ve velké většině využívají interakce synteticky připraveného úseku DNA (DNA detekční sonda), který nese chemickou nebo fluorescenční značku, která umožňuje přímou vizualizaci daného úseku DNA. V případě fluorescenčního značení (fluorescenční in situ hybridizace, FISH) se pozitivita signálu v buňkách přímo odečítá pod fluorescenčním mikroskopem. V případě detekčního systému enzymatického (chromogenic in situ hybridization, CISH) se DNA/RNA próba značí vhodně modifikovaným nukleosidem (např. biotin, skupina vhodná pro bioorthogonální kovalentní konjugaci atd.) a detekce se provádí nej častěji enzymatickým systémem v obdobném provedení i s podobnými nevýhodami jako v případě IHC. Signál lze odečíst pomocí mikroskopie ve světlém poli (tzv. „brightfield mikroskopie“). Vzhledem k dostupnosti a nízké ceně světelných mikroskopu je technika CISH široce využívána v klinické diagnostice. Výhoda dostupnosti je ovšem vykoupena neostrostí signálu danou limitacemi enzymatického detekčního systému, nižší citlivostí metody ve srovnáním s FISH a náročnější přípravou vzorků způsobenou inkubací s enzymy generujícími barevné látky.

V současné době existuje celá řada komerčně využívaných modifikovaných sond pro FISH značených různými fluorescenčními značkami, ale neexistuje žádná značka umožňující přímou detekci pomocí extinkce viditelného světla.

- 1 CZ 34808 UI

Intenzitu extinkce, a tedy i barevný kontrast ve viditelné oblasti poskytnutý danou sloučeninou, lze kvantifikovat pomocí extinkčního koeficientu ε, kde λ označuje vlnovou délku světla, při které extinkci měříme. Barevnost organických i anorganických molekul je nejčastěji způsobena absorpcí záření ve viditelné oblasti, spojenou s excitací vazebných elektronů. Běžná barviva vykazují nízké hodnoty εχ, které se pohybují v rozmezí přibližně 1.10⁴ až 2. 10⁵ M¹ cm¹. Při takto nízkých hodnotách ε, a reálných hybridizačních a amplifikačních stechiometriích použitelných v IHC nebo ISH není možné pozorovat lokalizovaný kontrast pomocí mikroskopie ve světlém poli. Pro možnost přímého značení barvivém v IHC nebo ISH by muselo barvivo mít ε, minimálně o 5 až 6 řádů vyšší.

V nanosystémech tvořených vzácnými kovy (Au, Ag, Pt), je mechanizmus extinkce záření odlišný. Při interakci světelného záření s kovovou nanočásticí začnou volné fotony v mřížce kovu skupinově oscilovat se stejnou frekvencí, jako má působící světlo. Tento fenomén je známý jako lokalizovaná povrchová plazmonová rezonance, která se skládá ze dvou hlavních příspěvku: 1) rozptylu, kdy je dopadající světlo vyzářeno se stejnou energií, avšak všesměmě, 2) absorpce fotonu vytvářející charakteristický absorpční pás v UV-vis spektru, jejichž energie je v tomto případě přeměněna na teplo. Tyto dva příspěvky lze shrnout jako extinkci, kterou pozorujeme jako celkový optický projev kovových plazmonických nanosystémů.

Z pohledu detekce ISH je významný fakt, že molámí extinkční koeficienty pro základní typy plazmonických nanočástic jsou o 4 až 5 řádů vyšší než pro molekulární barviva (Jain P. K. et al., J. Phys. Chem. B 2006,110, 7238-7248). Pro přímé použití však zlaté ani stříbrné nanočástice stále nemají dostatečné extinkční vlastnosti. Pro IHC/ISH tak byla v poslední době vyvinuta tzv. metalografická detekce založená na peroxidáze z křenu, která je konjugována k sekundární protilátce (Powell R. D. et al., Hum. Pathol. 2007, 38, 1145-1159). V přítomnosti Ag⁺ dochází k jeho redukci na nanočástice kovového stříbra, které má intenzivnější absorpci než molekulární barviva a vyšší stabilitu zbarvení. Další metalografickou technikou je zesílení extinkce velmi malých zlatých nanočástic (< 2 nm), které jsou navázány pomocí konjugátů s protilátkami na cílovou strukturu (Tubbs R. et al., J. Mol. Histol. 2004, 35, 589-594). Zesílení se uskutečňuje pomocí sekundární redukce zlata nebo stříbra indukované preferenčně na povrchu částic. Nevýhodami těchto metalografických metod jsou, podobně jako u molekulárních barviv, dlouhé inkubační časy potřebné k sekvenčnímu navázání protilátek, časově náročná in situ redukce kovu, a vysoké pozadí způsobené nespecifickou redukcí na biomolekulách.

Kovové nanoskořápky jsou částice s nekovovým jádrem obaleným kovovou vrstvou. Představují jedny z nejvíce světlo absorbujících a zároveň rozptylujících nanostruktur známých v přírodě. Jejich molámí extinkční koeficient ε, dosahuje v maximu extinkce hodnot kolem 10¹² M¹ cm¹ a ve srovnání s molekulárními barvivý leží přibližně o 7 až 8 řádů výše. Nanoskořápky byly dosud použity např. pro detekci a kvantifikaci analytů pomocí povrchově zesíleného Ramanova rozptylu, např. glukózy nebo proteinů (US 6699724 Bl). Dále byly použity např. pro uvolňování molekul ze svého povrchu způsobeného zahřátím nanoskořápek absorpcí světla v blízké infračervené oblasti (US 2020164072 Al). Pro podobné aplikace postačuje zakotvení nanoskořápek v ze síťovaném polymemím gelu nebo stabilizace povrchu nanoskořápek reakcí kovového povrchu s thiolovaným poly(ethylenglykolem), který se naváže na povrch pomocí vazeb kov-síra. Tento přístup navázání polymeru vede ke konformaci polymemího řetězce typu houba („mushroom conformation“), která poskytuje pouze základní koloidní ochranu. Je známé, že pro vysoce selektivní aplikace nanočástic v biologickém prostředí je potřeba povrch nanočástic pokrýt tzv. biokompatibilním polymemím kartáčem („polymer brusli“) (C. Cmje and D. B. Chithrani, Rev. Nanosci. Nanotechnol. 2014, 3, 20-30). Tento typ povrchu vykazuje uspořádání s vysokou plošnou hustotou polymeru a zajišťuje účinnou ochranu proti opsonizaci, nespecifické adsorpci biomolekul na povrch částic i prevenci adsorpce nanočástic na biologické struktury jako jsou např. buněčná membrána a buněčné organely. U kovových nanoskořápek se však dosud nepodařilo takového typu pokrytí povrchu dosáhnout.

- 2 CZ 34808 UI

Podstata technického řešení

Předkládané technické řešení řeší problém přímé detekce v in vitro diagnostice pomocí extinkce světla za použití částic s nekovovým jádrem obaleným kovovou vrstvou, známých jako nanoskořápky (nanoshells), které jsou však zcela specificky povrchově modifikované.

Z pohledu 1HC a ISH detekčních systémů dosahují extinkční vlastnosti nanoskořápek do oblasti, kde může být lokalizovaná extinkce způsobená pouhou vazbou nanočástic na cílovou buněčnou strukturu přímo pozorovatelná pomocí mikroskopie ve světlém poli (tedy za výhodných instrumentačních podmínek podobných CISH). Oproti CISH ovšem není nutné použít enzymatický detekční systém, mezi jehož hlavní nevýhody patří neostrost signálu, nižší citlivost, nízká teplotní stabilita a nutnost dlouhodobého skladování v chladu, častá endogenní aktivita ve vyšetřovaných tkáních, která vede ke zvyšování pozadí a/nebo snižování specificity detekce.

Předmětné technické řešení předkládá částice s polymemí povrchovou modifikací, která nově umožňuje jejich koloidní stabilizaci v roztocích s iontovou silou (pufrech, médiích, krvi, biologických kapalinách) a především potlačení nespecifických interakcí s biomolekulami a biologickými rozhraními

Předmětem technického řešení jsou povrchově modifikované částice obsahující jádro, vnitřní slupku a vnější slupku, kde jádro je tvořeno nekovovým materiálem a má průměr di v rozmezí 20 nm až 1 pm, vnitřní slupka je tvořena vrstvou kovu M o tloušťce d2 v rozmezí 2 až 60 nm, vnější slupka o tloušťce d; v rozmezí 2 až 200 nm je tvořena vrstvou polymeru obecného vzorce

(Π), kde x = 2 až 50, y = 5 až 5000, z = 0 až 2000, z/y = 0 až 0,4;

Rjsou vzájemně stejné nebo různé, přičemž každé Rje zvoleno ze skupiny, zahrnující -CH2-C=CH. -(CH2)n-N3, -(CH2)n-NH2, -(CH₂)n-COOH kde n = 2 až 6 a ve výhodném provedení n = 2 až 3;

který je k povrchu vnitřní slupky uchycen pomocí atomu síry, vytvářejících vazbu M-S s atomy kovu, jak znázorňují čárkované vazby označující atomy síry podílející se na vazbě M-S, nekovový materiál tvořící jádro je zvolený ze skupiny, zahrnující oxidy a hydratované oxidy, fosforečnan železitý, sklo, keramiku, vodu, biomolekuly a polymery, a vnitřní slupka je tvořena alespoň jedním kovem M vybraným ze skupiny zahrnující zlato, stříbro, nikl a měď.

Ve výhodném provedení vynálezu je nekovový materiál jádra vybrán ze skupiny: oxidy a hydratované oxidy Si, Ti, AI, nebo Zr, biomolekuly vybrané z lipidů a nukleových kyselin, a polymery vybrané ze skupiny zahrnující poly(ethylen), silikony, poly(estery), póly(methylmethakrylát), poly(anhydridy), poly(dimethylsiloxany), poly(dioxanon), poly(ethylenglykol), poly(ethylentereftalát), poly(glykolid), poly(hydroxyalkanoáty), poly(imidy), poly(tetratluoroethylen) a poly(vinylidenfluorid).

- 3 CZ 34808 UI

S výhodou je nekovovým materiálem jádra hydratovaný oxid křemičitý. Hydratovaný oxid křemičitý může být připravený pomocí Stóberova procesu např. hydrolýzou tetraethoxy sílánu.

S výhodou je vnitřní slupka tvořena zlatém.

Vnitřní slupka má výhodně tloušťku d2 v rozmezí 3 až 25 nm, výhodněji 5 až 20 nm.

Vnější slupka má s výhodou tloušťku d; v rozmezí 5 až 100 nm, výhodněji 10 až 60 nm.

V částicích podle předkládaného technického řešení jsou obvykle jádro, vnitřní slupka a vnější slupka uspořádány v podstatě koncentricky.

Polymer II tvořící vnější slupku slouží k potlačení nespecifických interakcí modifikovaných částic v biologickém prostředí. Přítomnost reaktivních skupin azidu, alkynu, aminu nebo karboxylové kyseliny v polymeru II umožňuje snadné připojení dalších molekul a/nebo biomolekul k povrchově modifikovaným částicím, které pak mohou být použity k selektivnímu rozpoznání a následné vizualizaci detekovaných biomarkeru přímo v tkáních, buňkách a biologických vzorcích. Konkrétně lze povrchově modifikované částice derivatizovat pro konjugaci k rozpoznávacím strukturám systémem biotin-streptavidin, biotin-avidin nebo biotin neutravidin.

V dalším výhodném provedení se reaktivní skupina alkynu v polymeru II ponechá reagovat s azidovaným derivátem mannosy, např. mannosa-PEG4-azidem za katalýzy měďnými ionty. Vznikají tak povrchově modifikované částice nesoucí mannosu, která se může vázat na cílové místo obsahující receptor rozpoznávající mannosu, např. CD206 exprimovaný ve vysoké míře na membráně makrofágů. Po inkubaci takto modifikovaných nanočástic s makrofágy je možné analyzovat fagocytámí aktivitu makrofágů pomocí průtokové cytometric pouze pomocí zvýšeného rozptylu světla způsobeného modifikovanými nanočásticemi, bez použití fluorescenčních značek.

Variací geometrických parametrů povrchově modifikovaných částic (průměr jádra, tloušťka vnitřní slupky, celkový průměr částice) lze připravit různé částice s odlišnými optickými vlastnostmi (molámí extinkční koeficient, poloha plazmonického extinkčního pásu, schopnost vytvářet kontrast při mikroskopii v procházejícím světle). Výchozí částice jádra lze připravit odborníkovi známými reakcemi a postupy, a některé silikagelové a polymemí částice jsou i komerčně dostupné.

Povrchově modifikované částice jsou využitelné pro řadu aplikací v in vitro diagnostice. Tyto aplikace zahrnují detekci biomolekul v biologických vzorcích na základě interakce modifikovaných částic s těmito biomolekulami. Biomolekula může být vybrána ze skupiny zahrnující nukleové kyseliny, proteiny, polysacharidy a glykoproteiny. Biologickým vzorkem se rozumí např. krev, krevní plasma, krevní sérum, moč, sperma, slzy, sliny, hlen, stolice, pot, výtěr, lymfa, mozkomíšní mok, buněčná suspenze, tkáň.

Ve výhodném provedení lze povrchově modifikované částice použít i v systému detekce integrované formy viru HPV16 v genomu lidských buněk karcinomu děložního čípku. V tomto provedení je genová sonda značená digoxigeninem hybridizována s DNA buněk a následně modifikována biotinylovanou protilátkou proti králičím imunoglobulinům. Přítomnost virové DNA je následně vizualizována pomocí povrchově modifikovaných nanočástic derivatizovaných neutravidinem a projevuje se jako tmavé kontrastní skvrny na světlém pozadí. Takto provedená detekce umožňuje rychlou, přesnou a velmi ostrou identifikaci přítomnosti HPV16 v nádorových buňkách.

Předmětné technické řešení tedy předkládá částice s nekovovým jádrem obaleným kovovou vrstvou a povrchem, který je modifikován biokompatibilním polymemím kartáčem. Toto řešení poskytuje výhody v oblasti zobrazování cílových struktur v tkáních v běžném světelném mikroskopu, konkrétně přímé a snadné provedení detekce, ostřejší, méně difůzní signál a chemickou i biologickou dlouhodobou stabilitu nanočástic se širokými možnostmi uplatnění v diagnostice a bioanalýze. Předmětný vynález dále poskytuje výhody v oblasti průtokové

- 4 CZ 34808 UI cytometric a hemocytometrie, kdy extrémní rozptyl způsobený částicemi po jejich příjmu do buňky umožňuje přímou identifikaci i kvantifikaci takto označených buněk pouze pomocí rozptylu světla, bez nutnosti použít fluorescenční detekci.

Objasnění výkresů

Obrázek 1: Extinkční spektra modifikovaných částic A) A6, A7 a A8, B) B6 a B7, normalizovaná na absorpční maximum. Jednotlivé modifikace povrchu nemají vliv na polohu spektrálních maxim série A i série B.

Obrázek 2: Dynamický rozptyl světla pro modifikované částice A) A6, A7 a A8, B) B5, B6 a B7 měřený ve vodě, pufru PBS (PBS) a lOx koncentrovaném pufru PBS (lOx PBS). Pro obě série částic A a B je patrná vysoká koloidní stabilita charakterizovaná stabilní polohou distribučního histogramu, která je nezávislá na prostředí. Expozice modifikovaných částic prostředí lOx PBS představuje robustní zkoušku, která odpovídá iontové síle přibližně řádově vyšší, než je přítomna ve fýziologickém prostředí.

Obrázek 3: Mikrografy modifikovaných částic AI, A3, A4, Bl, B3 a B4 z transmisního elektronového mikroskopu. Pro každou ze série A a B je demonstrován postupný růst částice: AI aBl jsou výchozí silikagelové částice, A3 a B3 jsou silikagelové částice s navázanými zlatými nanočásticemi, A4 a B4 jsou kompaktní modifikované částice. Velikosti měřítek: pro částice AI, A3, A4 je měřítko vždy 100 nm. Pro částici B1 200 nm, B3 100 nm a pro B4 200 nm.

Obrázek 4: Analýza fagocytózy myšími makrofágy J774A.1 pomocí pomocí průtokové cytometric bez fluorescenčního značení. (A) Distribuce buněk po 3 hodinách v kontrolní skupině bez modifikovaných částic (Kontrola), s modifikovanými částicemi (B6) a s modifikovanými částicemi derivatizovanými manosou (B7). Proces fagocytózy byl monitorován pomocí „dot plotů“ vizualizujících velikost (přímý rozptyl světla, FSC-A) a granularitu (boční rozptyl světla, SSC-A) jednotlivých buněk. (B) Dynamika distribuce buněk v jednotlivých kvadrantech. Specifický příjem modifikovaných částic makrofágy se projevuje výrazným nárůstem signálu v kvadrantu Ql, který narůstá i s časem.

Obrázek 5: Mikroskopie ve světelném poli živých makrofágů J774A.1 pro časy 0 až 18 hod. Byly testovány tyto varianty: médium bez částic (kontrola), médium obsahující kontrolní modifikované částice B6 nesoucí pouze polymer (negativní kontrola) a modifikované částice B7 derivatizované manosou (obě částice ve finální koncentraci 7,3 pmol.1¹). Fagocytóza byla zřetelně pozorovatelná pouze pro specifickou variantu obsahující B7 s navázanou manosou jako výrazná změna optického kontrastu v oblastech buněk.

Obrázek 6: Schéma struktury povrchově modifikované částice, která obsahuje jádro 1, vnitřní slupku 2 a vnější slupku 3, kde jádro 1 je tvořeno nekovovým materiálem a má průměr di, vnitřní slupka 2 je tvořena vrstvou kovu M o tloušťce d2, a vnější slupka 3 o tloušťce d; je tvořena vrstvou polymeru.

Seznam zkratek

DCM DIPEA UPLC-MS	dichlormethan N,N-diisopropylethylamin ultra účinná kapalinová chromatografíe-hmotnostní spektrometrie TLC chromatografie na tenké vrstvě
MeOH DMSO HRMS UPLC	methanol dimethylsulfoxid hmotnostní spektrometrie s vysokým rozlišením ultra účinná kapalinová chromatografie

- 5 CZ 34808 UI qDa kvadrupólový detektor v hmotnostní spektrometrii

ACN acetonitril

PEG polyethylenglykol

Příklady uskutečnění technického řešení

Příklad 1

Syntéza ligandu pro polymeraci

500 mg B0C-PEG4-NH2 (1,0 ekv.) bylo rozpuštěno do 50 ml DCM a 446 μΐ (1,5 ekv) DIPEA bylo přidáno do reakční směsi, která byla následně zchlazena v ledové lázni. 167 μΐ (1,0 ekv.) methakryloyl chloridu bylo přidáno po kapkách po dobu zhruba 5 minut. Reakce byla ponechána, aby se postupně vytemperovala na pokojovou teplotu a byla míchána přes noc. Ráno byla reakční směs vytřepána 2x 10% (vždy objemová procenta, není-li uvedeno jinak) KHSO4, 2x nasyceným roztokem hydrogenuhličitanu sodného a Ix solankou, vždy 30 ml. Organická fáze byla poté vysušena bezvodým síranem hořečnatým a odpařena na odparce. Podle UPLC-MS analýzy surového produktu měl odparek čistotu více než 95 % (R_t = 3,7 min, identifikováno m/z: 361,4 [M+H]⁺ 261,3 [M -Boc, +H] . TLC analýza (čistý EtOAc, Rf= 0,3) potvrdila po obarvení roztokem 3% KMnO4 jedinou majoritní přítomnou látku. Produkt VI byl použit v následujícím kroku bez jakékoliv další purifikace.

(VI)

Surový odpařený produkt VI byl rozpuštěn v 2 ml kyseliny trifluoroctové (TFA) a roztok byl 5 min sonikován v lázni, aby se podpořilo odchránění chránící skupiny Boc.

crcqo μ-μΊ V'’ (VII)

Poté byla TFA odpařena v proudu dusíku. Po úplném odstranění TFA byl produkt použit v následujícím kroku bez další purifikace.

639 mg (1,0 ekv) odchráněného aminu bylo rozpuštěno v 50 ml DCM a následně bylo přidáno 1,06 ml (3,5 ekv) DIPEA. pH reakční směsi bylo zkontrolováno, aby bylo zásadité (pokud nebyla TFA odstraněna dostatečně, je potřeba více DIPEA). 528 mg (1,0 ekv) A-hydroxysuccinimidylesteru kyseliny lipoové bylo přidáno najednou a reakce byla míchána přes noc. Chromatografie na preparativních TLC deskách (Analtech P02015 Silica Gel GF UNIPLATE, 2000 pm, 200 mm šířka, 200 mm délka, použity 4 desky pro separaci) byla provedena jako jediná čistící metoda (5% MeOH v DCM, Rf=0,5, UV aktivní). Skvrna obsahující produkt byla vyškrábána a produkt extrahován na fritě čistým MeOH. Látka byla dále používána v podobě roztoku v MeOH, protože odpaření a zakoncentrování roztoku vedlo k samovolné polymerizaci. Pouze malá část roztoku byla odpařena pro určení koncentrace. Bylo izolováno 390 mg produktu VIII v roztoku MeOH (finální izolovaný výtěžek po 3 krocích byl 51%). Tento roztok byl stabilní a byl skladován po dobu mnoha měsíců v mrazáku při -80 °C. Analýza UPLC-MS detekovala pouze jeden pík (R_t = 3,7 min, čistota 97 %).

-6CZ 34808 UI

(VIII)

Pro analysu NMR byl roztok postupně odpařen do DMSO. Ή NMR (400 MHz, DMSO-r/e) δ 7,92 (NH, t, J= 5,7 Hz, 1H), 7,84 (NH, t, J= 5,6 Hz, 1H), 5,65 (CH₂=, dq, J= 1,9, 1,0 Hz, 1H), 5,32 (CH₂=, h, J= 1,5 Hz, IH), 4,14 (q, 7=5,2 Hz, 3H), 3,66 - 3,56 (m, 1H), 3,54 - 3,47 (m, 4H), 3,463,39 (m, 1H) 3,26 (q, J= 6,1 Hz, 2H), 3,21 - 3,15 (m, 6H), 3,14 - 3,06 (m, 2H), 2,41 (dtd, J= 12,9, 6,5, 5,5 Hz, 1H), 2,07 (t, 7=7,3 Hz, 2H), 1,93 - 1,79 (m, 4H), 1,66 (dtd, 7= 13,6, 7,9, 7,4, 5,5 Hz, 1H), 1,58 - 1,42 (m, 3H), 1,40 - 1,28 (m, 2H). ¹³C NMR (101 MHz, DMSO-7₆) δ 172,63, 168,06, 140,30, 119,57, 70,18, 70,03, 69,60, 69,26, 56,62, 38,92, 38,55, 35,57, 34,56, 28,74, 25,48, 19,06. HRMS vypočtené pro C₂0H3?O5N₂S₂: m/z [M+H]⁺: 449,21384; nalezeno 449,21378.

Analýza UPLC-MS: data byly získána na systému Waters acquity UPLC system napojeným na qDA detektor. Jako kolona byla použita 2,1x100 mm C18 1,7 um Acquity Waters. 7minutový gradient byl nastaven následovně: 2% ACN po dobu 1 minuty, poté gradient do 100% ACN v následujících 5 minutách, následovaný 1 minutou čistým ACN.

Příklad 2

Příprava modifikovaných částic

a) Příprava silikagelových částic

Silikagelové částice byly připraveny ve dvou krocích. Nejprve byla připravena zárodečná zrna částic. Bylo rozpuštěno 4,55 mg argininu v 3,45 ml vody. Roztok byl převrstven směsí cyklohexanu (225 μΐ) a tetraethoxyorthosilikátu (275 μΐ). Směs byla zahřáta na 60 °C a ponechána míchat 20 hodin. Poté byla spodní fáze obsahující silikagelová zárodečná zma oddělena.

Pro další růst silikagelových částic různých velikostí bylo smícháno 39,5 ml ethanolu, 11 ml H₂O a 466 μΐ připraveného roztoku silikagelových zárodečných zrn. Po důkladném promíchání byl přidán za míchání tetraethoxyorthosilikát a 0,9 ml 24,5% roztoku NH4OH. Množství tetraethoxyorthosilikátu bylo měněno podle požadované velikosti částic. Například pro přípravu částic AI o průměru 58 nm bylo přidáno 180 μΐ; pro přípravu větších částic Bio průměru 95 nm bylo přidáno 1000 μΐ. Reakce probíhala přes noc při teplotě místnosti. Částice byly promyty ethanolem.

b) Příprava thiolovaných silikagelových částic

Částice AI nebo B1 (10 mg) připravené v předchozím kroku byly smíchány s 11,5 ml vody, 37,5 ml ethanolu a roztok byl 10 minut probubláván argonem. Za stálého míchání byly přidány roztoky (3-merkaptopropyl)trimethoxysilanu a l,2-bis(triethoxysilyl)ethanu v množství vhodném pro dané velikosti silikagelových částic (pro vznik A2: 14,5 μΐ k částicím AI; pro vznik B2; 8 μΐ k částicím Bl). Za stálého míchání bylo přidáno 0,9 ml 24.5% roztoku NH4OH a reakční směs byla ponechána reagovat 4 hodiny při teplotě místnosti v inertní atmosféře argonu. Připravené thiolované částice byly promyty ethanolem.

c) Příprava silikagelových částic s navázanými zlatými nanočásticemi

Nejprve byly připraveny zlaté nanočástice o průměru <5 nm přidáním 2 ml 1% roztoku kyseliny

- 7 CZ 34808 UI terachlorozlatité k roztoku chloridu tetrakis(hydroxymethyl)fosfonia (1,34 pmol.l¹ v 50 ml 10 mmol.l¹ roztoku NaOH). Částice modifikované thiolem (A2, B2) byly smíchány s tímto roztokem. Vzniklé částice s navázanými zlatými nanočástice (A3, B3) byly promyty vodou.

d) Růst vnitřní slupky

Částice A3 nebo B3 byly smíchány se zlatícím roztokem (250 mg K2CO3, 174 mg HAuCE, 1 litr vody. pH 9,5) a probublány oxidem uhelnatým. Poměr množství částic a zlatícího roztoku závisel na velikosti částice a požadované tloušťce zlaté vrstvy. Pro 0,5 mg částic A3 bylo použito 72 ml roztoku za vzniku částic A4, pro 0,5 mg částic B3 bylo použito 40 ml zlatícího roztoku za vzniku B4. Částice byly odděleny sedimentací.

Příklad 3

Příprava částic s vrstvou hydrofilního polymeru

K pozlaceným částicím A4 rozředěným do 700 ml vody byla přidána směs ligandu VIII a kyseliny lipoové (14,4 ml 10 mmol.l¹ lipoové kyseliny a 3,6 ml 10 mmol.¹ ligandu VIII), pH bylo upraveno na 9,5. Výměna ligandu probíhala 3 dny. Vzniklé částice A5 byly zakoncentrovány sedimentací.

K částicím B4 rozředěným do 500 ml byla přidána směs ligandu VIII a kyseliny lipoové (9,64 ml 10 mmol.l¹ lipoové kyseliny a 2,41 ml 10 mmol.l¹ ligandu), pH bylo upraveno na 9,5. Výměna ligandu probíhala 3 dny. Vzniklé částice B5 byly zakoncentrovány sedimentací. Koncentrovaný roztok částic A5 (45 ml odpovídající 5 mg silikagelových částic) byl smíchán za stálého míchání s roztokem HPMA (9,72 g v 84 ml vody, pH 11) a probublán argonem.

K roztoku byla přidána směs monomeru a iniciátoru v methanolu pod argonem [486 μΐ alkynového monomeru A-(prop-2-yn-l-yl)methakrylamidu, 466 μΐ dimethyl 2,2'-azobis(2-methylpropionátu) (V-601) v 14,6 ml methanolu]. Směs byla zahřívána na 60 °C po dobu 48 hodin. Vzniklé částice A6 byly promyty methanolem a poté PBS s 0,1% (hmot, procenta) detergentem Tween.

Koncentrovaný roztok částic B5 (30 ml odpovídající 6,75 mg silikagelových částic) byl smíchán za stálého míchání s roztokem HPMA (5 g v 53,75 ml vody, pH 11) a probublán argonem. K roztoku byla v inertní atmosféře argonu přidána směs monomeru a iniciátoru v methanolu [250 μΐ A-(prop-2-yn-l-yl)methakrylamidu, 300 μΐ iniciátoru V-601 v 9,375 ml methanolu). Směs byla zahřívána na 60 °C po dobu 48 hodin. Vzniklé částice B6 byly promyty methanolem a poté PBS s 0,1% (hmota, procenta) detergentem Tween.

Příklad 4

Charakterizace modifikovaných částic

Bylo proměřeno extinkční spektrum připravených modifikovaných částic (Obr. 1). V použité nízké pikomolámí koncentraci všechny částice vykazovaly intenzivní absorpční pásy v oblasti vhodné pro detekci signálu.

Byl změřen dynamický rozptyl světla připravených modifikovaných částic v koncentracích odpovídajících jednotkám pmol.l¹ ve vodě, pufru PBS a lOx koncentrovaném pufru PBS, který vzhledem ke své vysoké iontové síle představuje velmi robustní test koloidní stability (Obr. 2). Všechny modifikované částice prokázaly vysokou stabilitu i v prostředí lOx koncentrovaného pufru PBS, což svědčí o silné stabilizační funkci polymeru chránícího interakční rozhraní modifikovaných částic.

Struktura částic v jednotlivých krocích přípravy byla dokumentována pomocí transmisní elektronové mikroskopie (JEOL JEM-1011, napětí 80 kV) (Obr. 3). Pozorované změny odpovídají mechanizmu růstu a dokumentují přítomnost očekávaných struktur, včetně vzniklých

-8CZ 34808 UI nanoskořápek.

Příklad 5

Derivatizace modifikovaných částic pomocí manosy

Částice B6 byly modifikovány manosou pomocí azid-alkynové cykloadice katalyzované měďnými ionty. Částice byly naředěny do 4,5 ml a smíchány s 377 μΐ 10 mmol.l¹ manosa-PEG4-azidu (0,74 mmol.l¹). Ve finálním objemu 5089 μΐ byl 0,15 mmol.l¹ CuSO4, 0,3 mmol.l¹ ligandu BTTAA, 1,48 mmol.l¹ askorbát a 1,48 mmol.l¹ aminoguanidin. Reakce byla ponechána reagovat 2 hodiny a poté byly manosylované částice B7 7x promyty PBS s 0,1% (hmota, procenta) detergentem Tween.

Příklad 6

Využití modifikovaných částic pro detekci fagocytámí aktivity

Měření fagocytámí aktivity profesionálně fagocytujících buněk je ukazatelem parametru nespecifické buněčné imunity. Její vyšetření se rutinně klinicky provádí z krevních buněk pacienta pomocí fagocytózy fluorescenčně značených manosylovaných částic (například latex, zymozan apod.), barvením mikroskopicky nebo na průtokovém cytometru. Fluorescenční průtoková cytometric je ovšem nákladné a sofistikované zařízení, které není v každé hematologické laboratoři běžně dostupné. Vzhledem k extrémním rozptylovým vlastnostem modifikovaných částic je lze využít pro měření fagocytámí aktivity např. průtokovou cytometrií v nativních, fluorescenčně nebarvených buňkách, pomocí hemocytometrie, nebo pomocí mikroskopie ve světlém poli s automatizovanou analýzou obrazu. Jako modelové makrofágy byla použita myší buněčná linie J774A.1 (ATCC® TIB-67™) kultivovaná v Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium s 10% fetálním hovězím sérem a antibiotiky (lOOU/lOOpg penicillin/streptomycin).

Cytometrická detekce

Den před experimentem bylo vysazeno 6xl0⁵ J774A.1 buněk na 60 mm kultivační misku. Po 24 hodinách bylo přidáno čerstvé médium bez částic (kontrola), médium obsahující kontrolní modifikované částice B6 nesoucí pouze polymer (negativní kontrola) a modifikované částice B7 s navázanou manosou (obě částice ve finální koncentraci 7,3 pmol.1¹). Buňky byly sklizeny v časových intervalech 0, 1,3 a 6 h od přidání média s částicemi nebo bez částic a následně byly bez fixace měřeny pomocí detekce rozptylu světla. Výsledky jsou shrnuté na Obr. 5. Je patrné, že manosylované částice B7 byly selektivně a intenzivně přijímány makrofágy, příjem byl časově podmíněný a že cytometrická metoda bez použití fluorescenčního značení byla pro detekci fagocytámí aktivity velmi citlivá.

Detekce pomocí mikroskopie ve světlém poli

Den před experimentem bylo vysazeno IxlO⁴ J774A.1 buněk na 96jamkovou desku. Po 24 hodinách bylo přidáno čerstvé médium bez částic (kontrola), médium obsahující kontrolní modifikované částice B6 nesoucí pouze polymer (negativní kontrola) a modifikované částice B7 s navázanou manosou (obě částice ve finální koncentraci 7,3 pmol.1¹). Znázornění živých buněk (live cell imaging) v časových intervalech 0, 1, 3, 6, 12 a 18 h po přidání média s částicemi nebo bez nich byl proveden pomocí vysokokapacitní analýzy na mikroskopu discovery systém Cell Voyager CV7000 (Yokogawa, Japan) při 37 °C v 5 % CO2 v režimu světelného pole. Výsledky jsou shrnuté na Obr. 6. Podobně jako v případě cytometrické detekce, mikroskopická metoda bez použití fluorescenčního značení byla pro detekci fagocytámí aktivity velmi citlivá. Manosylované částice B7 byly selektivně a intenzivně přijímány makrofágy a příjem byl časově podmíněný.

-9CZ 34808 UI

Průmyslová využitelnost

Předmětný vynález řeší problém přímé detekce v in vitro diagnostice pomocí extinkce světla za použití povrchově modifikovaných částic s nekovovým jádrem obaleným kovovou vrstvou, na níž 5 je zachycen biokompatibilní polymemí kartáč. Jejich aplikace umožňuje v biologických vzorcích přímou detekci biomolekul zahrnujících nukleové kyseliny, proteiny, polysacharidy a glykoproteiny. Biologickým vzorkem se rozumí např. krev, krevní plasma, krevní sérum, moč, sperma, slzy, sliny, hlen, stolice, pot, výtěr, lymfa, mozkomíšní mok, buněčná suspenze či tkáňový vzorek.

Claims

NÁROKY NA OCHRANU

1. Povrchově modifikované částice vyznačující se tím, že obsahují jádro, vnitřní slupku a vnější slupku, kde jádro je tvořeno nekovovým materiálem a má průměr di v rozmezí 20 nm až 1 pm, vnitřní slupka je tvořena vrstvou kovu M o tloušťce d2 v rozmezí 2 až 60 nm, vnější slupka o tloušťce ds v rozmezí 2 až 200 nm je tvořena vrstvou polymeru obecného vzorce

(Π), kde x = 2 až 50, y 5 až 5000, z = 0 až 2000, z/y = 0 až 0,4;

Rjsou vzájemně stejné nebo různé, přičemž každé Rje zvoleno ze skupiny, zahrnující -CH2-C=CH, -(CH2)n-N3, -(CH2)n-NH2, -(CH₂)n-COOH kde n = 2 až 6 a ve výhodném provedení n = 2 až 3;

který je k povrchu vnitřní slupky uchycen pomocí atomu síry, vytvářejících vazbu M-S s atomy kovu, jak znázorňují čárkované vazby označující atomy síry podílející se na vazbě M-S, přičemž jádro je tvořeno nekovovým materiálem zvoleným ze skupiny, zahrnující oxidy a hydratované oxidy, fosforečnan železitý, sklo, keramiku, biomolekuly a polymery, vnitřní slupka je tvořena alespoň jedním kovem M ze skupiny zahrnující zlato, stříbro, nikl a měď.
2. Povrchově modifikované částice podle nároku 1, vyznačující se tím, že oxidy a hydratované oxidy nekovového jádra jsou vybrány z oxidu a hydratovaných oxidu Si, Ti, AI, nebo Zr, biomolekuly jsou zvoleny z lipidu a nukleových kyselin a polymery jsou zvoleny ze skupiny, zahrnující poly(ethylen), silikon, poly(estery), poly(methylmethakrylát), poly(anhydridy), poly(dimethylsiloxany), poly(dioxanon), poly(ethylenglykol), poly(ethylentereftalát), poly(glykolid), poly(hydroxyalkanoáty), poly(imidy), poly(tetrafluoroethylen) a poly(vinylidenfluorid).
3. Povrchově modifikované částice podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že jako nekovový materiál jádra se použije hydrátovaný oxid křemičitý.
4. Povrchově modifikované částice podle kteréhokoliv z nároku 1 až 3, vyznačující se tím, že vnitřní slupka je tvořena zlatém.
5. Povrchově modifikované částice podle kteréhokoliv z nároku 1 až 4, vyznačující se tím, že vnitřní slupka má tloušťku d2 v rozmezí 3 až 25 nm, výhodněji 5 až 20 nm, a vnější slupka má tloušťku ds v rozmezí 5 až 100 nm, výhodněji 10 až 60 nm.