CN107478641B - 液相表面增强拉曼光谱传感器、其制备方法及其用于核酸检测的用途 - Google Patents

液相表面增强拉曼光谱传感器、其制备方法及其用于核酸检测的用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了液相表面增强拉曼光谱传感器、其制备方法及其用于核酸检测的用途。该传感器包含检测基底和SERS探针两部分。检测基底为四面体DNA探针修饰的磁核枝杈状金壳纳米颗粒，SERS探针为表面修饰有能与目标核酸杂交的特定碱基序列和拉曼信号分子的金纳米颗粒。检测是，将检测基底、SERS探针与待检测液体样品混合，通过碱基互补配对形成“检测基底‑目标核酸‑SERS探针”夹心结构复合物，借助外加磁场分离检测液中的复合物并富集后进行SERS测试，利用SERS信号实现了对于血清中核酸的高灵敏、特异性检测，检测限达到fM，可实现在血清等复杂环境中检测核酸标志物。

Description

液相表面增强拉曼光谱传感器、其制备方法及其用于核酸检 测的用途
技术领域
本发明属于功能纳米材料和生物检测领域，具体涉及一种用于核酸检测的液相表面增强拉曼光谱(简称SERS)传感器、其制备方法及其核酸检测的用途。
背景技术
随着对肿瘤发生机制的研究不断深入，人们逐步认识到肿瘤本质上是一种遗传物质改变引起的疾病，近年来研究证明miRNA的表达失控与肿瘤的发生发展密切相关，在特定组织及特定发育阶段表达，具有组织特异性和时序性，这就决定了miRNA在疾病诊断中的重要作用。然而在病变的早期肿瘤核酸标志物含量很低，急需发展可靠、价格低廉的高灵敏检测新方法。
SERS技术具有超高的检测灵敏度，能够实现单分子水平检测，为肿瘤标志物筛选及肿瘤早期检测提供新的超灵敏分析检测方法。而且制备具有丰富的尖端及间隙等SERS“热点”的金纳米材料并构建SERS传感器，有望获得高灵敏检测。在基于SERS技术的液相检测方法中，通常选择磁性纳米颗粒作为基底，利用其良好的磁响应性能进行样品的分离、提纯和富集。但已报道的磁性核壳结构大部分制备得到平滑的金壳表面，但对于磁核表面生长枝杈状金壳进而提升颗粒SERS 增强性能的研究较为少见。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的是提供一种液相表面增强拉曼光谱传感器，该传感器检测基底以磁核枝杈状金壳纳米颗粒为载体，经表面修饰特定的四面体DNA探针构建得到，复合磁性和SERS活性。
本发明的另一个目的是提供一种液相表面增强拉曼光谱传感器的制备方法。
本发明的再一个目的是提供一种液相表面增强拉曼光谱传感器用于核酸检测的用途，具有超高的检测灵敏度，能够实现单分子水平检测。
为了实现上述发明目的，本发明采用如下的技术方案：
一种用于核酸检测的液相SERS传感器，包含检测基底和 SERS探针，其中，检测基底为表面修饰四面体DNA探针的磁核枝杈状金壳纳米颗粒。
所述的DNA探针为具有三维立体结构四面体DNA，该四面体DNA由四条DNA单链自组装而成，其中的三条单链DNA 分别在5’端修饰巯基，第四条DNA链5’端延伸出与miRNA-21部分碱基互补配对的碱基序列；制备方法是：四条DNA单链等物质的量混合，经加热和降温处理过程，即在95℃环境中保持2～5min，再在4℃环境中保持20～30min，得到四面体DNA探针。
所涉及到的SERS传感器构建及工作原理图如图6所示：
基于上述液相表面增强拉曼光谱传感器的检测方法是：检测基底和SERS探针与含有不同浓度目标核酸miRNA-21的血清样品溶液混合共培育，检测基底上的四面体DNA探针-目标核酸分子-SERS探针通过特异性地碱基互补配对后形成夹心结构复合物，借助外加磁场分离检测液中的复合物并富集后进行SERS测试，得到不同浓度样品检测的SERS信号强度，以核酸浓度为横坐标，以SERS信号强度为纵坐标做出工作曲线，根据工作曲线计算得出待测样品中目标核酸的浓度。
其中混合共培育的条件为：在37℃，杂交反应3h。
上述液相表面增强拉曼光谱传感器的制备方法，步骤如下：
(一)检测基底的制备，包括如下步骤：
(1)制备磁核枝杈状金壳纳米颗粒，用缓冲液多次清洗；
(2)四条DNA单链等物质的量混合，组装形成三维立体结构的四面体DNA探针；
(3)取四面体DNA探针溶液与磁核枝杈状金壳纳米颗粒混合并共培养，四面体DNA探针通过三个巯基与金共价作用有序修饰在磁核枝杈状金壳纳米颗粒表面，然后用缓冲液清洗提纯，得到检测基底；
其中，步骤(1)中所述磁核枝杈状金壳纳米颗粒制备方法为：在中国专利文件CN103933904B公布的磁核二氧化硅壳(Fe3O4@SiO2)纳米颗粒表面先吸附3～8nm金种子，随后与金壳生长液和定向生长控制试剂混合，加入还原剂甲醛 (50～200μL)，在温度(4℃～30℃)环境静置生长30～60min，所得的液体经过离心和洗涤处理后提纯得到磁核枝杈状金壳纳米颗粒，颗粒直径为180～230nm。该金纳米壳表面具有 SERS性能优异的枝杈，长度为20～45nm。该磁核枝杈状金壳纳米颗粒同时具有超顺磁性和SERS活性。
其中，金壳生长液由氯金酸溶液和碳酸钾溶液组成，具体地讲是由20mM的HAuCl4溶液和浓度为0.1M的K2CO3溶液按体积比1:1～2:1混合配制；
定向生长控制试剂为硝酸银溶液，浓度为5～20mM，加入量为10～50μL。
步骤(3)中所述四面体DNA溶液与磁核枝杈状金壳纳米颗粒混合并共培养的培养条件为在25℃，800rpm的恒温振荡仪中培养3h。
(二)、SERS探针的制备：是在球形金纳米颗粒表面修饰上能与miRNA-21部分碱基序列互补配对的DNA单链探针序列和拉曼信号分子DTNB后获得。
吸附有金种子的磁核硅壳纳米颗粒(Fe3O4@SiO2@Au 种子)，具体制备方法按文献Song C,Min L,Zhou N,et al. Synthesis of novel gold mesoflowers as SERS tagsfor immunoassay with improved sensitivity.ACS applied materials &interfaces,2014,6,21842-21850.；Song C,Min L,Zhou N, et al.Ultrasensitive detection ofcarcino-embryonic antigen by using novel flower-like gold nanoparticle SERStags and SERS-active magnetic nanoparticles.RSC Advances,2014,4, 41666-41669；CN103933904B中公开的方法制备。
有益效果：本发明制备得到的用于核酸检测的液相 SERS传感器，以SERS为检测技术，SERS技术具有超高的检测灵敏度，能够实现单分子水平检测。该传感器检测基底为四面体DNA探针修饰的磁核枝杈状金壳纳米颗粒，该检测基底具有超顺磁性，可实现液相样品分离和富集；具有 SERS活性，能够提高SERS检测的灵敏度。相比于常规单链 DNA探针，四面体DNA纳米结构具有良好的结构刚性和稳定性，能够调控DNA探针在颗粒表面分布的密度，而且优异的空间定位能力可以改善探针在颗粒表面的取向，进而增加探针对目标分子的捕获能力和杂交效率，提高检测灵敏度，同时能够高效封闭颗粒表面的非特异性吸附位点，能够有效降低血清环境中杂质分子的非特异性吸附，提高检测的特异性。
本发明的用于核酸检测的液相SERS传感器将磁核枝杈状金壳纳米颗粒的磁性分离富集能力、SERS增强效应、四面体DNA探针高效的生物分子捕获优势相结合，发挥其协同增效作用，提高检测灵敏度和特异性，检测限可低于1fM (飞摩尔每升量级)水平，可实现在血清等复杂环境中高效检测低丰度的核酸。
本发明公开的传感器检测灵敏度高、可靠性好，在肿瘤早期诊断、药物开发等领域有广泛的应用前景；同时该SERS 核酸传感器的构建对各种目标核酸分子具有良好的普适性。
附图说明
图1是本发明实施例1所得磁核枝杈状金壳纳米颗粒的透射电镜图像。
图2是本发明实施例1所得磁核枝杈状金壳纳米颗粒的扫描电镜图像。
图3是本发明实施例2中四面体DNA探针形成的电泳胶图验证。
图4是本发明实施例2中SERS传感器用于血清样品检测时对应不同浓度的miRNA-21的SERS谱线。
图5是本发明实施例2中SERS传感器用于血清样品 miRNA-21的工作曲线。
图6是本发明所涉及到的SERS传感器构建及工作原理图。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明的内容并不限于所举的实施例。
以检测肺癌核酸标志物microRNA-21为例制备用于核酸检测的SERS传感器。
(1)示例中的目标核酸分子microRNA-21的核酸碱基序列为：5’-UAG CUU AUC AGACUG AUG UUG A-3’
(2)示例中的探针DNA链序列为： 5’-SH-TTTTTTCAACATCAGT-3’
(3)示例中的特殊设计的四条DNA片段碱基序列如表 1所示：
表1
Figure BDA0001375259800000071
实施例1磁核枝杈状金壳纳米颗粒的制备：
(1)配置浓度为20mM的HAuCl4溶液，浓度为0.1M的 K2CO3溶液，浓度10mM的AgNO3溶液。
(2)在室温下，取上述720μL 0.1M K2CO3和760μL 20 mM HAuCl4加入20mL超纯水中并剧烈搅拌20min，配置得到金壳生长液；
(3)将20μL 10mM AgNO3加入到100μL Fe3O4@SiO2@Au种子中并超声处理10min；
(4)将步骤(2)和(3)所得溶液混合，剧烈搅拌2min；
(5)向步骤(4)的混合溶液中加入100μL甲醛溶液并继续搅拌2min；
(6)将混合物在28℃环境下静置生长30min后，将所合成的胶体经离心机分离提纯，离心机转速2500rpm，离心时间15min，用超纯水清洗三次，最终制得磁核枝杈状金壳结构的纳米颗粒，分散于超纯水中。如图1和图2所示TEM和 SEM形貌表征，纳米颗粒直径为180～230nm，表面为粗糙的金壳，生长有许多长度为20～45nm的枝杈。
实施例2核酸检测SERS传感器的制备和检测方法
(1)四条DNA单链(表1中列出的A，B，C和D) 等物质的量混合于TM缓冲液(20mMTris-HCl、50mM MgCl2，pH 8.0)，进行高温冷却处理，即在95℃恒温摇床中保持5min，再在4℃冰箱保持20min，形成四面体DNA探针，最终浓度为1μM。用10％的聚丙烯酰胺凝胶电泳验证四面体DNA探针的形成。图3为电泳胶图，相比于一条、两条和三条DNA链的组合，四条DNA链混合自组装形成的四面体DNA探针在泳道15中移动得最慢，验证了四面体DNA 探针的成功形成，而且产率高。
(2)取10μL四面体DNA溶液与500μL磁核枝杈状金壳纳米颗粒混合并在25℃，800rpm的恒温振荡仪中培养3 h。然后用缓冲液离心清洗三次(转速2500rpm，离心时间15min)，制备得到检测基底。
(3)将500μL 15nm金颗粒(AuNPs，购自British Biocell International(Cardiff,UK)公司)与50μL DNA探针链(10 μM)在0.5×TBE缓冲液(89mM Tris、90mM硼酸、2mM EDTA，pH 8.0)中混合，在25℃下培养4小时加入2M NaCl 溶液12.5μL，混合物在25℃下老化过夜，用0.5×TBE缓冲液离心(8500rpm，20min)清洗除去多余的DNA探针链；再将5μL的100μM DTNB拉曼分子加入修饰DNA探针链的AuNPs中，共培养3h后用0.5×TBE缓冲液离心(8500rpm， 20min)清洗除去多余的DTNB，分散于PBS缓冲液(10mM 磷酸盐，100mM氯化钠，pH7.4)中，制备得到SERS探针。
(4)将50μL检测基底、10μL目标核酸分子、50μL SERS探针混合，在37℃环境下杂交反应3h，用外加磁场分离并富集后进行SERS测试得到SERS信号(拉曼测试条件：扫描时间2s，激光功率9mW，激发光波长785nm)。
(5)工作曲线：将检测物microRNA-21用80％的人血清稀释至不同浓度1fM，10fM，100fM，1pM，10pM，100pM 的核酸溶液；将检测基底和SERS探针置于不同浓度的待检测物microRNA-21液溶中，在37℃环境下杂交反应3h，随后用外加磁场分离清洗复合物，并将复合物滴加在硅片表面用外磁场富集后进行SERS测试得到SERS信号，对目标核酸分子浓度和相应SERS信号强度作出核酸传感器的工作曲线，并计算传感器对这种目标核酸分子的线性范围和检测下限。
(6)SERS传感器用于核酸检测方法：将上述传感器置于某个待检测的microRNA-21溶液，在37℃环境下杂交反应3 h，随后用外加磁场分离清洗复合物，并将复合物滴加在硅片表面用外磁场富集后进行SERS测试得到SERS信号，检测到的SERS信号强度与工作曲线对照，计算得出待检测样品的浓度。
图4和5为SERS检测结果，SERS传感器可有效识别肺癌标志物micro RNA-21，SERS检测信号随micro RNA-21浓度的增加而上升，SERS谱上1331cm-1处特征峰信号强度与microRNA-21的浓度在区间1fM～100pM呈线性关系，计算得出最低检测极限达到623aM。
应理解上述实施例仅用于说明本发明技术方案的具体实施方式，而不用于限制本发明的范围。本发明公开的一种用于核酸检测的液相表面增强拉曼光谱(简称SERS)传感器、其制备方法及其核酸检测的用途。在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等同形式的修改和替换均落于本申请权利要求所限定的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 南京邮电大学
<120> 液相表面增强拉曼光谱传感器、其制备方法及其用于核酸检测的用途
<130> 2017-5-1
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
uagcuuauca gacugauguu ga 22
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
shttttttca acatcagt 18
<210> 3
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
shchtatcac caggcagttg acagtgtagc aagctgtaat agatgcgagg gtccaatac 59
<210> 4
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 4
shchtcaact gcctggtgat aaaacgacac tacgtgggaa tctactatgg cggctcttc 59
<210> 5
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 5
shchttcaga cttaggaatg tgcttcccac gtagtgtcgt ttgtattgga ccctcgcat 59
<210> 6
<211> 71
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 6
ctgataagct atttttacat tcctaagtct gaaacattac agcttgctac acgagaagag 60
ccgccatagt a 71

Claims (6)

1.用于检测miRNA-21的液相表面增强拉曼光谱传感器，其特征在于包含检测基底和SERS探针，其中，检测基底为表面修饰四面体DNA探针的磁核枝杈状金壳纳米颗粒，同时具有超顺磁性和SERS活性;所述的DNA探针为具有三维立体结构四面体DNA，该四面体DNA由四条DNA单链自组装而成，其中的三条单链DNA分别在5’端修饰巯基，第四条DNA链5’端延伸出与miRNA-21部分碱基互补配对的碱基序列；SERS探针是在球形金纳米颗粒表面修饰上能与miRNA-21部分碱基序列互补配对的DNA单链探针序列和拉曼信号分子DTNB后获得。
2.根据权利要求1所述的用于检测miRNA-21的液相表面增强拉曼光谱传感器，其特征在于所述的DNA探针是由四条DNA单链等物质的量混合，经加热和降温处理过程后获得。
3.基于权利要求1所述的用于检测miRNA-21的液相表面增强拉曼光谱传感器的核酸检测方法，其特征在于是将检测基底和SERS探针与含有不同浓度目标核酸miRNA-21的血清样品溶液混合共培育，检测基底上的四面体DNA探针-目标核酸分子-SERS探针通过特异性地碱基互补配对后形成夹心结构复合物，借助外加磁场分离检测液中的复合物并富集后进行SERS测试，得到不同浓度样品检测的SERS信号强度，以核酸浓度为横坐标，以SERS信号强度为纵坐标做出工作曲线，根据工作曲线计算得出待测样品中目标核酸的浓度。
4.权利要求1所述的用于检测miRNA-21的液相表面增强拉曼光谱传感器的制备方法，其特征在于，步骤如下：
（一）检测基底的制备：
（1）、制备磁核枝杈状金壳纳米颗粒，用缓冲液多次清洗；
（2）、四条DNA单链等物质的量混合，经加热和降温处理过程后，组装形成三维立体结构的四面体DNA探针；
（3）、取四面体DNA探针溶液与磁核枝杈状金壳纳米颗粒混合并共培养，四面体DNA探针通过三个巯基与金共价作用有序修饰在磁核枝杈状金壳纳米颗粒表面，然后用缓冲液清洗提纯，得到检测基底；
（二）、SERS探针的制备：是在球形金纳米颗粒表面修饰上能与miRNA-21部分碱基序列互补配对的DNA单链探针序列和拉曼信号分子DTNB后获得。
5.根据权利要求4所述的用于检测miRNA-21的液相表面增强拉曼光谱传感器的制备方法，其特征在于步骤（1）中所述磁核枝杈状金壳纳米颗粒制备方法为：在磁核二氧化硅壳纳米颗粒表面先吸附3~8 nm金种子，随后与金壳生长液和定向生长控制试剂混合，加入50~200 μL甲醛，在4℃~30℃静置生长30~60 min，所得的液体经过离心和洗涤处理后提纯得到磁核枝杈状金壳纳米颗粒；
其中，金壳生长液由20 mM的HAuCl4溶液和浓度为0.1 M的K2CO3溶液按体积比1:1~2:1混合得到；
定向生长控制试剂为硝酸银溶液，浓度为5~20 mM，加入量为10~50 μL。
6.根据权利要求4所述的用于检测miRNA-21的液相表面增强拉曼光谱传感器的制备方法，其特征在于步骤（3）中所述四面体DNA溶液与磁核枝杈状金壳纳米颗粒混合并共培养的培养条件为在25℃，800 rpm的恒温振荡仪中培养3 h。
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