CN108152250B - 生物识别探针的构建方法及其逻辑运算方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种生物识别探针的构建及对核酸内切酶检测的逻辑运算方法，构建步骤为：分别制备金银核壳纳米立方体溶胶和四面体结构DNA分子溶液，并将Au@AgNCs溶胶固定于氧化铟锡导电膜玻璃表面；将所述四面体结构的DNA分子溶液滴加到固定有Au@AgNCs溶胶的氧化铟锡导电膜玻璃表面，室温下进行孵育、洗涤、吹干，得到所述基于四面体结构DNA分子的识别探针。利用上述方法制备的局域表面等离子体共振LSPR探针可用于对MicroRNA‑21和核酸内切酶(KpnI和StuI)检测的逻辑运算。与银纳米立方体相比，Au@Ag NCs具有相似的等离子体特性且结构更佳稳定；与一维结构的单链DNA分子以及二维结构的发夹型DNA分子相比，三维结构的四面体结构DNA具有更好的刚性以及结构稳定性等优点。

Description

生物识别探针的构建方法及其逻辑运算方法

技术领域

本发明涉及一种基于四面体结构DNA(tsDNA)的单颗粒局域表面等离子体共振(LSPR)探针的构建方法及其逻辑运算方法，属于生物检测技术领域。

背景技术

MicroRNAs是一类长度在20～24个核苷酸的内源性非蛋白编码的RNAs，通常在早期发育，细胞增殖、分化、凋亡等生物学过程中起着非常重要的作用。MicroRNAs的异常表达发生在癌症前期的恶性肿瘤细胞中，与许多癌症(如：肺、肝细胞、大肠和乳腺癌等)相关。MicroRNA-21(miR-21)存在于上述许多人类的癌症组织中，尤其在肺鳞癌组织中表达水平是正常组织中的2倍之多。因此，microRNAs可以作为生物标志物用于早期癌症的诊断和预后治疗。发展一种高灵敏的分析方法跟踪检测microRNAs用于早期癌症诊断对于生物学和诊断学是至关重要的。

在许多生物系统中，单分子水平的研究可以揭示分子间的相互作用、动力学以及构象的细微变化。目前用于单分子水平检测的可行方法通常需要荧光分子作标记，然而荧光探针容易发生光漂白等现象且信噪比较低。近些年来，由于其独特的尺寸、形貌、组分和微环境依赖的光学性质，等离子体在化学和生物传感领域引起了广泛的研究兴趣。这些传感器基于贵金属纳米颗粒(如：金纳米颗粒和银纳米颗粒)的LSPR特性，通过颗粒的LSPR峰(λ_max)的移动作为检测信号。LSPR传感器用于测量金属纳米颗粒表面的分子间相互作用引起了研究者们的关注。并且，许多不同的用于固定生物分子到金属纳米颗粒表面的方法被广泛的报道。另外，从单个金属纳米颗粒获得的信号可以提供更加详细的信息。因此，我们希望基于单个纳米颗粒水平来检测金属纳米颗粒表面的生物分子间的相互作用。

然而，由于microRNAs含量低，采用基于简单的单链DNA修饰的单个银纳米立方体形成的探针分子构建的等离子体纳米生物传感器对miR-21的检测限只能到1fM。

发明内容

技术问题：针对现有技术中的缺陷，本发明的目的是提供一种生物识别探针的构建方法及其逻辑运算方法。

技术方案：本发明是通过以下技术方案实现的：

一种基于tsDNA的单颗粒LSPR探针的构建方法，其包括如下步骤：

分别制备Au@AgNCs溶胶和tsDNA溶液，并将所述Au@AgNCs固定于氧化铟锡导电膜玻璃表面；

将所述tsDNA溶液滴加到固定有Au@AgNCs的氧化铟锡导电膜玻璃表面，室温下孵育2～6h后，用超纯水洗涤，并用氮气吹干，得到所述基于tsDNA的单颗粒LSPR探针。

作为优选方案，所述Au@AgNCs溶胶的制备方法包括如下步骤：

合成纳米金种子；

将所述纳米金种子与十六烷基三甲基氯化铵进行反应，得到金溶胶；

将所述金溶胶与抗坏血酸在40～80℃下进行反应后，加入硝酸银，反应后得到Au@AgNCs溶胶。

作为优选方案，所述Au@AgNCs在氧化铟锡导电膜玻璃表面的固定方法为：

将氧化铟锡导电膜玻璃的表面清洗干净后，浸入到Au@AgNCs溶胶中，静置1～5min后取出，用超纯水清洗并用氮气吹干，即可。

作为优选方案，所述tsDNA溶液的制备方法包括如下步骤：

将各条单链DNA溶解，在紫外分光光度计下测定260nm处的吸收，并参考每条单链DNA的摩尔消光系数，确定其浓度；

将四条单链DNA以等比例混合于TM缓冲液中，加入三(2-氯乙基)磷酸酯后，转入聚合酶链式反应仪中，在90～98℃下持续10～15min后，迅速降温至0～5℃，得到tsDNA溶液。

一种基于前述构建方法制备的单颗粒LSPR探针针对核酸内切酶检测的逻辑运算方法，其包括如下步骤：

制备Au@AgNC-tsDNA₁₇探针分子和靶分子miR-21的纳米复合物；

定义当在所述纳米复合物中加入核酸内切酶KpnI和/或StuI时，输入为“1”，当核酸内切酶KpnI或StuI不存在时，输入为“0”；

以所述纳米复合物LSPR散射λ_max的蓝移量Δλ_max-blue作为输出，并设定输出的临界值，当Δλ_max-blue大于该临界值时，输出为“1”，反之，输出为“0”。

一种基于前述构建方法制备的生物识别探针针对miR-21和核酸内切酶检测的逻辑运算方法，其包括如下步骤：

设定以单个Au@AgNC-tsDNA₁₇探针分子中加入靶分子miR-21作为一种输入，加入核酸内切酶(KpnI和StuI)作为另一种输入，以单个Au@AgNC-tsDNA₁₇探针分子在加入靶分子miR-21和/或核酸内切酶后的LSPR散射λ_max的红移量Δλ_max-red作为输出；

设定输出的临界值；当Δλ_max-red大于所述临界值时，输出为“1”；当Δλ_max-red小于所述临界值时，输出为“0”。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：

由于两种核酸内切酶KpnI和StuI在tsDNA₁₇相应的两条边(l₂和l₃)上的识别位点到Au@AgNC表面距离的不同，在相同反应条件下，分别由核酸内切酶KpnI和StuI引起的Au@AgNC-tsDNA₁₇-miR-21纳米复合物的LSPR散射λ_max的蓝移有2nm的区别。基于这种Au@AgNC-tsDNA₁₇-miR-21纳米复合物LSPR散射λ_max变化构建的OR逻辑运算已经达到0.5nm每个碱基对的高检测分辨率，为设计更为复杂的逻辑运算提供了可能。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1为本发明的Au@AgNC-tsDNA₁₇探针分子识别靶分子miR-21的原理示意图；

图2为本发明的基于Au@AgNC-tsDNA₁₇-miR-21纳米复合物的核酸内切酶活性检测的示意图

图3为本发明中实施例1制备得到的tsDNA的电泳分析图；

图4为本发明中实施例2制备的Au@AgNCs的TEM图片；

图5为本发明中实施例2制备的单个Au@AgNCs的HAADF-STEM图片以及元素扫描图片；

图6为本发明中实施例2制备的Au@AgNCs的紫外吸收光谱图；

图7为本发明中实施例3设计的tsDNA₁₇的结构示意图；

图8为本发明中实施例3得到的Au@AgNCs表面修饰tsDNA₁₇前后的(a)暗场照片和(b)典型的LSPR散射光谱图；

图9为本发明中实施例3得到的Au@AgNC-tsDNA₁₇的(a)暗场照片和(b)统计的LSPR散射光谱图；

图10为利用本发明中实施例3得到的Au@Ag NC-tsDNA₁₇探针分子识别靶分子miR-21前后的(a)暗场照片和(b)典型的LSPR散射光谱图；

图11为图10中Au@AgNC-tsDNA₁₇探针分子识别靶分子miR-21前后的原位SEM图；

图12为Au@Ag NC-tsDNA₇，Au@Ag NC-tsDNA₁₇和Au@Ag NC-tsDNA₂₆三种探针分子在相同条件下识别1pM靶分子miR-21引起颗粒LSPR峰的红移量；

图13为Au@AgNC-tsDNA₁₇探针分子识别靶分子miR-21不同时间对应的LSPR散射光谱图，其中曲线1到7分别是反应0，30，60，90，120，150，180min时颗粒的LSPR散射光谱；

图14为Au@Ag NC-tsDNA₁₇探针分子识别不同浓度的靶分子miR-21前后对应的LSPR散射光谱图，其中曲线1到11分别对应miR-21的浓度为0，1，10¹，10²，10³，10⁴，10⁵，10⁶，10⁷，10⁸和10⁹aM；

图15为Au@AgNC-tsDNA₁₇探针分子LSPR散射光谱改变量与靶分子miR-21浓度的线性关系图；

图16为(a)Au@Ag NC-tsDNA₁₇探针分子识别不同浓度的靶分子miR-21(1aM到1nM)在不同的时间的LSPR峰的移动曲线；(b)Au@AgNC-tsDNA₁₇探针分子识别单个靶分子miR-21的LSPR峰的时间动态曲线；

图17为Au@AgNC-tsDNA₁₇探针分子的特异性检测能力；

图18为Au@AgNC-tsDNA₁₇探针分子在复杂体系中的检测能力；

图19为tsDNA17在核酸内切酶KpnI和StuI作用前后的电泳分析图；

图20为Au@AgNC-tsDNA₁₇-miR-21纳米复合物在核酸内切酶KpnI和StuI作用前后典型的LSPR散射光谱图及颗粒的DFM图像；

图21为Au@AgNC-tsDNA₁₇探针分子对核酸内切酶KpnI和StuI的选择性；

图22为(a)基于Au@AgNC-tsDNA₁₇-miR-21纳米复合物的核酸内切酶活性检测以及OR逻辑运算的示意图；(b)OR逻辑运算信号输出及真值表；

图23为Au@AgNC-tsDNA₁₇探针分子在靶分子miR-21以及核酸内切酶KpnI和StuI作用前后典型的LSPR散射光谱图及颗粒的DFM图像；

图24为(a)基于Au@AgNC-tsDNA₁₇探针分子的XOR逻辑运算的示意图；(b)XOR逻辑运算信号输出及真值表。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。

本发明中涉及的主要药品如下：

硝酸银(AgNO₃，99.9％)，氯金酸(HAuCl₄·3H₂O，99％)，抗坏血酸(AA，99％)，硼氢化钠(NaBH₄，99％)，十六烷基三甲基溴化铵(CTAB，98％)，十六烷基三甲基氯化铵(CTAC)购自Sigma-Aldrich公司。乙二胺四乙酸(EDTA)，三羟甲基氨基甲烷(Tris)，焦炭酸二乙酯(DEPC)购自上海阿拉丁试剂公司，其他试剂均为分析纯购买于国药集团化学试剂有限公司。

本发明中涉及的主要仪器如下：紫外-可见吸收光谱在岛津(日本)UV-3600分光光度计上进行测试；扫描电镜图片使用S-4800(日本)扫描电子显微镜(SEM)拍摄；透射电镜图片使用JEM 2010(日本)透射电子显微镜(TEM)拍摄；恒温混匀仪是Thermomixer comfort(Eppendorf，Germany)；聚丙烯酰胺凝胶电泳仪(Bio-Rad，USA)；暗场图片和单颗粒散射光谱使用装备了暗场聚光镜(0.8<NA<0.95)的Nikon Ti-U型倒置显微镜(日本)拍摄。激发光光源为100W卤素灯，照片通过Nikon DS-fi真彩数码成像CCD采集，光谱通过装备有PIXIS400BR-excelon的光谱CCD的Acton SP2300i型单色仪采集，其光栅密度为300L/mm，闪耀波长为500nm，均由Princeton Instruments提供。暗场图片和单颗粒散射光谱均通过60倍放大的显微物镜采集(NA＝0.8)，采集时间全部为20秒。

实施例1

本实施例涉及一种tsDNA的制备方法，包括如下步骤：

tsDNA的设计以碱基互补配对，以尽可能少的二级结构和GC含量在50％以上等条件为原则，设计了边长分别为7bp，17bp和26bp三种不同尺寸的tsDNA。tsDNA的合成，制备方法可参考“A DNA nanostructure-based biomolecular probe carrier platform forelectrochemical biosensing，Pei H,Lu N,Wen Y,et al.Advanced Materials,2010,22(42):4754-4758”，具体方法如下：

一、将各条单链DNA溶解，在紫外分光光度计下测定260nm处的吸收，从大连宝生物公司得到每条单链DNA的摩尔消光系数，确定每条单链DNA的实际浓度；

二、将形成tsDNA的四条单链DNA以等比例混合在TM缓冲液中，加入终浓度为1～10mM的三(2-氯乙基)磷酸酯，配成终浓度为1～10μM的混合液；

三、将配好的混合液放入聚合酶链式反应仪中90～98℃持续10～15min，然后迅速降温至0～5℃，即可得到tsDNA溶液。

采用聚丙烯凝胶电泳(PAGE)来验证tsDNA的形成。实验方法如下：首先，将形成好的tsDNA和单链、两条链以及三条链形成的对照结构上样到1×TBE缓冲液配制的PAGE里，在60V电压下运行；然后将胶在1％的gel-red水溶液里染色10～30min；最后在G:Box里拍摄，保存。

表1

分别将每一套的tsDNA的组成链(4条)等比例混合、退火，形成tsDNA。用聚丙烯凝胶电泳来验证四面体纳米结构是否形成。图3a、3b和3c分别给出了边长为17bp，7bp和26bp的tsDNA形成的胶图，从图中可以看出，每一种尺寸的tsDNA都能成功的合成，且产率都在85％以上。从同一张胶图中可以看出，tsDNA与其他几种未完全加入四条链的DNA结构相比由于具有三维立体结构，受到更大的阻力，其迁移速率最慢；通过比较不同张的胶图可以看出，tsDNA的尺寸越小，其迁移所在的位置对应于20bp的Marker越靠前面。胶图结果还表明，巯基修饰对DNA四面体结构的形成没有影响，可用于Au@AgNCs表面的组装。

实施例2

本实施例涉及一种表面固定有Au@AgNCs的氧化铟锡导电膜玻璃基底的制备方法，包括如下步骤：

一、纳米金种子的合成：我们采用一个常见的种子生长法制备直径20～40nm的金种子。为了制备直径1～5nm金纳米颗粒，首先将0.2～0.8mL冰水配制的新鲜的5～15mM硼氢化钠溶液快速搅拌下加入到5～15mL的50～150mM CTAB和0.2～0.5mL的5～10mM氯金酸的混合溶液中，得到棕色溶液在20～30℃水浴中保温2～5h以保证多余的硼氢化钠分解完全后待用。然后，金种子溶液通过以下方法制得，将2～5mL的50～200mM抗坏血酸溶液加入到5～15mL的100～200mM CTAC溶液和5～10mL的0.2～0.5mM的氯金酸混合溶液中得到无色透明溶液，搅拌均匀后加入0.2～0.5mL稀释2～6倍的1～5nm金纳米颗粒溶液，溶液的颜色由无色透明变为亮红色，在20～40℃水浴中保温0.5～2.5h后待用。接着，将2～5mL的50～200mM的抗坏血酸溶液、5～15mL的10～200mM CTAC溶液和5～10mL的0.2～0.5mM氯金酸溶液混合，然后向其中加入1～5mL先前制备的10～15nm金种子溶液，溶液的颜色由无色透明慢慢变为红色，在20～40℃水浴中保温1～3h，用于Au@AgNCs的生长。所得的溶胶采用日本岛津公司的UV-3600紫外-可见分光光度计进行表征，在520～540nm处会有金溶胶强烈的吸收峰出现。TEM表征后发现其粒径为25～35nm(统计100个粒子)制备的金溶胶即为金种子，存储在棕色瓶中，于冰箱中在0～5℃条件下保存。

二、Au@AgNCs的合成：合成直径在40～60nm的Au@AgNCs的方法主要经过以下几个步骤。将2～5mL先前制备的20～40nm的金种子溶液和5～10mL的100～200mM CTAC在20mL反应瓶中配成5～20mL金胶溶液，向其中加入2～5mL的50～200mM抗坏血酸溶液搅拌1～5min后50～70℃保温，接着，将0.5～2.0mL的5～20mM的硝酸银溶液以0.5～2.0mL/15min的速率通过加液泵滴加到恒温50～70℃反应瓶中，溶液的颜色由红色变成橙色后变成黄色。所得的Au@AgNCs溶液经过4000～7000rpm 5min洗涤2～3次后分散至1～3mL超纯水中，采用日本岛津公司的UV-3600紫外-可见分光光度计进行表征，在450～500nm处会有Au@AgNCs强烈的吸收峰出现。TEM表征后发现其直径约为55nm(统计100个粒子)，制备的溶胶即为Au@AgNCs，存储在棕色瓶中，于冰箱中在0～5℃条件下保存，通常在一个月内用完。

三、玻璃基底的清洗：实验中使用的氧化铟锡导电膜玻璃在使用前分别用洗洁精溶液、去离子水、丙酮、无水乙醇、超纯水超声清洗，并用氮气吹干。最后，将氧化铟锡导电膜玻璃放置于紫外臭氧清洗器中照射10～30min使氧化铟锡导电膜玻璃表面活化，产生大量的硅氧基以利于进行下一步Au@AgNCs的固定实验。

四、Au@Ag NCs的固定和分析：我们采用物理吸附的方法将Au@AgNCs固定到清洗干净的氧化铟锡导电膜玻璃表面，具体修饰方法如下：将清洗干净的氧化铟锡导电膜玻璃浸入到稀释40～60倍的先前制备的直径约为55nm的Au@AgNCs溶胶中，1～5min后将氧化铟锡导电膜玻璃取出用超纯水冲洗其表面除去多余的Au@AgNCs溶液，并用氮气吹干，即可制得Au@AgNCs均匀分布的检测界面。将氧化铟锡导电膜玻璃固定在暗场倒置显微镜平台上，可见光源通过暗场聚光镜汇集在纳米粒子上即可观察单颗粒的散射光谱。

本实施例中制备的Au@Ag NCs溶胶的TEM照片如图4所示，从图中可以看出，合成的Au@AgNCs形貌、尺寸均一，直径约55nm。进一步地，图5a证实了Au@AgNCs的核壳结构和元素分布。图5b～5d给出了单个Au@Ag NC元素面扫描图，从图中可以看出，Ag覆盖在Au核的外表面，两者的元素分布不重叠，证实了Au@AgNCs的壳核结构。其紫外-可见光谱数据如图6所示，吸收峰出现位于478nm，表明在此波长下，Au@AgNCs表面最易发生等离子共振现象。

实施例3

本实施例涉及一种tsDNA对Au@AgNCs的修饰方法，包括如下步骤：

取100～200μL的1pM实施例1合成好的tsDNA溶液滴加到实施例2固定好Au@Ag NCs的氧化铟锡导电膜玻璃的表面，在室温下孵育2～6h。然后用超纯水将多余的tsDNA溶液除去，并用氮气吹干，即可制得基于tsDNA的单个Au@AgNC LSPR探针。

依据四面体边长的大小命名，三种不同7bp，17bp和26bp边长的四面体分别为tsDNA₇，tsDNA₁₇和tsDNA₂₆。由于银和硫之间具有很强的共价作用，以17bp边长的tsDNA₁₇为例，如图7所示，在tsDNA₁₇的三个顶点上修饰巯基，其中一条边(l₁)空出一段单链DNA分子用于捕获miR-21分子，在另外的两条边(l₂和l₃)上分别设计核酸内切酶KpnI和StuI的识别位点。

为了验证巯基修饰的tsDNA可以组装在Au@AgNCs表面，以tsDNA₁₇为例，用暗场光谱显微镜平台来观察其在Au@AgNCs表面的组装。图8a和8b分别给出了Au@Ag NCs表面修饰tsDNA₁₇前后的暗场照片和典型的LSPR散射光谱图。从图中可以看出，在未加入tsDNA₁₇之前，Au@Ag NCs的LSPR散射峰位置(λ_max)于505nm处，颗粒的LSPR散射光呈蓝色；在加入1pM的tsDNA₁₇后，Au@AgNCs的LSPR散射λ_max发生明显的红移，对100个经过tsDNA₁₇修饰后的Au@AgNCs的LSPR散射λ_max进行统计，发现颗粒的λ_max至556nm左右(如图9a和9b所示)，并且颗粒LSPR散射光变为绿色，表明tsDNA₁₇可以在Au@AgNCs的表面固定，用于miR-21的检测以及核酸内切酶(KpnI和StuI)活性检测的研究。

实施例4

本实施例涉及一种利用四面体结构DNA修饰Au@AgNCs生物识别探针对miR-21的检测，包括如下步骤：

将100μL不同浓度的miR-21滴加到上述四面体结构DNA修饰的Au@AgNCs的检测界面，在室温下反应3h。然后用超纯水冲洗，并用氮气吹干，用于散射光谱的测量。实验中对miRNA检测所用的试剂均用DEPC处理过的Milli-Q水配制，并且实验操作都在超净台里进行。

选取LSPR散射初始峰位置在556nm处的Au@AgNC-tsDNA₁₇探针分子为研究对象，考察了在加入靶分子miR-21前后颗粒的LSPR散射光颜色和散射λ_max的变化。图10给出了典型的Au@Ag NC-tsDNA₁₇探针分子识别靶分子miR-21前后的暗场照片和LSPR散射λ_max光谱图。从图中可以看出，在没有靶分子miR-21存在时，Au@Ag NCs的LSPR散射光谱和散射光颜色基本保持不变；在1pM的靶分子miR-21存在时，Au@Ag NCs的LSPR散射光颜色由绿色变到黄绿色，其LSPR散射λ_max由原来的556nm红移至587nm，发生了31nm的红移。同时，对图10(a)中选取的Au@AgNC-tsDNA₁₇探针分子进行了原位SEM的分析。如图11所示，在Au@AgNC-tsDNA₁₇探针分子与靶分子miR-21杂交过程中，Au@AgNCs的形貌并未发生变化。通过上述实验结果可以推断出，Au@AgNC-tsDNA₁₇探针分子识别靶分子miR-21后，杂交形成DNA双螺旋结构，DNA分子间隙中的部分水分子被排出，导致Au@AgNCs表面折射率的增大，引起颗粒LSPR散射光颜色的变化及其LSPR散射λ_max的红移，从而实现对靶分子miR-21的检测。

DNA探针分子的密度对于其识别靶分子的过程具有严重的影响。为了获得最佳的检测性能，申请人研究了不同尺寸的tsDNA对miRNA的检测效果。机理如图1所示，我们分别选用tsDNA₇，tsDNA₁₇和tsDNA₂₆修饰到单个Au@AgNC表面构建了Au@Ag NC-tsDNA₇，Au@Ag NC-tsDNA₁₇和Au@AgNC-tsDNA₂₆三种探针分子，考察了三种探针分子与靶分子miR-21的杂交。其结果如图12所示，在相同条件下，上述三种探针分子在单个Au@AgNC表面与1pM靶分子miR-21杂交，对应的引起了颗粒的LSPR散射光谱红移量(Δλ_max-red)分别为15nm，31nm和25nm，其中Au@AgNC-tsDNA₁₇与靶分子miR-21杂交引起颗粒的LSPR散射Δλ_max-red最大，检测效果最明显，为单粒子miRNA纳米传感器探针分子的选择提供了依据。

基于前面的研究结果，我们选择使用边长为17bp的tsDNA₁₇作为识别靶分子miR-21的探针。为了研究Au@AgNC-tsDNA₁₇探针分子与靶分子miR-21在单个Au@Ag NC表面杂交的动力学过程，我们实时的记录了颗粒LSPR散射光谱λ_max的变化。图13给出了Au@AgNC-tsDNA₁₇探针分子识别靶分子miR-21不同时间段对应的LSPR散射光谱图。从图中可以看出，在没有miR-21存在时，Au@Ag NC的LSPR散射光谱λ_max基本保持不变；当具有1pM靶分子miR-21存在时，Au@Ag NC的LSPR散射光谱λ_max会随着时间的增加发生明显的红移，并且Δλ_max-red在初始阶段快速增加，当反应时间达到2h后，其反应速率趋于平缓，反应3h后Δλ_max-red达到定值31nm，可以认为反应基本结束。

通过考察金属纳米颗粒LSPR散射光谱λ_max及散射光颜色的变化，可以很灵敏的对靶分子进行检测，所以采用这种方法对一系列不同浓度的靶分子miR-21进行测定。图14给出了Au@AgNC-tsDNA₁₇探针分子识别不同浓度的靶分子miR-21对应的LSPR散射光谱图。从中可以看出，颗粒的LSPR散射Δλ_max-red随着靶分子miR-21浓度的增大而增加，检测动态范围从1aM到1nM，横跨10个数量级，当检测低至1aM时，颗粒的LSPR散射Δλ_max-red为4nm，信噪比在5.0以上(图15)。基于单个Au@AgNC-tsDNA₁₇探针分子构建的等离子体纳米生物传感器的检测灵敏度要优于以前报道的很多单颗粒水平的生物传感器。

选取初始LSPR散射λ_max在556nm处的Au@Ag NC-tsDNA₁₇探针分子作为研究对象，利用LSPR光谱仪对Au@AgNC-tsDNA₁₇探针分子识别不同浓度的靶分子miR-21的过程进行了实时光谱追踪。如图16(a)所示，在加入不同浓度的靶分子miR-21(1aM到1nM)后，Au@AgNC-tsDNA₁₇探针分子的LSPR散射λ_max发生不同程度的红移，随着靶分子miR-21浓度的增大而增加，其最大值达到40nm之多。如前所述，Δλ_max-red在初始阶段快速增加，当反应时间达到2h后，其反应速率趋于平缓，Δλ_max-red达到最大值的95％以上，可以认为反应基本结束。图16(b)给出了Au@AgNC-tsDNA₁₇探针分子识别1pM的靶分子miR-21在110min到120min的LSPR散射λ_max的时间动态曲线。从图中可以看出，由于靶分子miR-21与Au@AgNC-tsDNA₁₇探针分子界面的碰撞作用，导致颗粒的LSPR散射λ_max在一定范围内(小于0.2nm)跳动；当Au@AgNC-tsDNA₁₇探针分子与单个靶分子miR-21发生杂交反应时，在113min和117min处分别引起了颗粒的LSPR散射λ_max的一个约0.4nm的红移。

对靶分子检测的特异性和选择性是衡量一个探针分子的重要指标。图17和图18分别给出了Au@AgNC-tsDNA₁₇探针分子对靶分子miR-21的特异性检测能力和在复杂体系中的检测能力。从图17中可以看出，当Au@AgNC-tsDNA₁₇探针分子与相同浓度(1pM)的靶分子miR-21、单个碱基错配的miRNA以及随机miRNA发生作用时，随机miRNA对颗粒LSPR散射λ_max的影响几乎可以忽略不计；Au@AgNC-tsDNA₁₇探针分子识别靶分子miR-21引起颗粒LSPR散射Δλ_max-red是单个碱基错配的miRNA引起的Δλ_max-red的2倍之多。结果表明，Au@AgNC-tsDNA₁₇探针分子对靶分子miR-21具有特异性检测能力。另外，四面体结构DNA具有很好的抗蛋白吸附和在血清中抗降解的能力，可以用于复杂体系靶分子的检测。如图18所示，当这种Au@AgNC-tsDNA₁₇探针分子检测胎牛血清(FBS)和人血清(HS)里的靶分子miR-21时，既不会增加背景信号，也不会丢失信号分子。比较结果发现，在50％胎牛血清内和50％的人血清内与纯溶液中测得的1pM靶分子miR-21的信号相比，颗粒的LSPR散射Δλ_max-red波动在10％以内。表明Au@AgNC-tsDNA₁₇探针分子可以选择性识别复杂体系里的靶分子，对应用于临床样本的检测带来了希望。

实施例5

本实施例涉及一种利用四面体结构DNA修饰Au@AgNCs生物识别探针对核酸内切酶活性的检测，包括如下步骤：

参考大连宝生物公司提供的核酸内切酶的使用说明书，将2μL的酶溶液与酶切缓冲液以及超纯水混合得到100μL的反应液，然后将其滴加到上述四面体结构DNA修饰的Au@AgNCs的检测界面，37℃反应15min，超纯水冲洗，并用氮气吹干，用于散射光谱的测量。

为了实现以单个Au@AgNC-tsDNA₁₇作为探针分子的等离子体纳米生物传感器的多功能性，我们将其应用于核酸内切酶KpnI和StuI活性的检测。用聚丙烯凝胶电泳来验证核酸内切酶KpnI和StuI是否对tsDNA₁₇有剪切作用。图19给出了tsDNA₁₇在核酸内切酶KpnI和StuI作用前后的电泳分析图。从图中可以看出，经过核酸内切酶KpnI或StuI作用后的tsDNA₁₇的迁移速率比作用前的快，并且经过核酸内切酶KpnI和StuI同时作用后的tsDNA₁₇，被切割成2条片段，成功的说明了核酸内切酶KpnI和StuI对tsDNA₁₇都具有明显的剪切作用。我们利用LSPR光谱仪和暗场倒置显微镜(DFM)以初始LSPR散射λ_max位于587nm的Au@AgNC-tsDNA₁₇-miR-21纳米复合物为研究对象，如图20所示，在没有核酸内切酶KpnI或StuI存在时，Au@AgNC-tsDNA₁₇-miR-21纳米复合物的LSPR散射λ_max基本保持不变(I)；在核酸内切酶KpnI或StuI存在时，Au@AgNC-tsDNA₁₇-miR-21纳米复合物的LSPR散射λ_max发生了一定的蓝移(Δλ_max-blue)，分别为8nm(II，Δλ_{max-blue-miR-21@KpnI}＝8nm)和10nm(III，Δλ_{max-blue-miR-21@StuI}＝10nm)，其LSPR散射光颜色由橘色变到黄绿色；当核酸内切酶KpnI和StuI同时存在时，Au@AgNC-tsDNA₁₇-miR-21纳米复合物的LSPR散射光颜色由橘色变到绿色，其LSPR散射λ_max由原来的587nm蓝移至569nm，发生了18nm的蓝移(IV，Δλ_{max-blue-miR-21@KpnI@StuI}＝18nm)。说明当分别加入核酸内切酶KpnI或StuI时，tsDNA₁₇的边(l₂或l₃)会分别被破坏；当同时加入核酸内切酶KpnI和StuI时，tsDNA₁₇的两条边(l₂和l₃)会同时被破坏，使tsDNA₁₇-miR-21的结构由原来的“拉紧”(Taut)的状态(T状态)变成“松弛”(Relaxed)的状态(R状态)，此时tsDNA₁₇边(l₂或l₃)上DNA分子的位置就会被周围的水分子取代，导致颗粒附近的RI的减小，从而使探针分子的LSPR散射λmax发生蓝移。

为了进一步验证以单个Au@Ag NC-tsDNA₁₇作为探针分子的等离子体纳米生物传感器可以特异性的检测核酸内切酶KpnI和StuI的活性，我们另外选择了两种核酸内切酶HindIII和SalI作为对照。图21给出了Au@AgNC-tsDNA₁₇-miR-21纳米复合物识别不同核酸内切酶KpnI、StuI、HindIII和SalI前后LSPR散射λ_max的变化。从图中可以看出，在相同反应条件下，与Au@AgNC-tsDNA₁₇-miR-21纳米复合物本身的LSPR散射λ_max相比，识别核酸内切酶KpnI或StuI后，Au@AgNC-tsDNA₁₇-miR-21纳米复合物的LSPR散射λ_max分别发生了一定的蓝移，而识别核酸内切酶HindIII或SalI后，Au@AgNC-tsDNA₁₇-miR-21纳米复合物的LSPR散射λ_max并没有发生明显的变化。这些结果表明，构建的等离子体纳米生物传感器对测核酸内切酶KpnI和StuI具有良好的选择性。

实施例6

本实施例涉及一种利用四面体结构DNA修饰Au@AgNCs生物识别探针对核酸内切酶检测设计的逻辑运算方法，具体包括如下步骤：

利用Au@Ag NC-tsDNA₁₇-miR-21纳米复合物对核酸内切酶KpnI和StuI的响应行为，构建了基于单个Au@AgNC-tsDNA₁₇-miR-21纳米复合物LSPR散射λ_max变化的OR逻辑运算。OR逻辑运算可以被理解为当分别或同时加入输入(input)时，输出(output)为“1”。定义当加入核酸内切酶KpnI或StuI时，输入为“1”，当核酸内切酶KpnI或StuI不存在时，输入为“0”。以Au@AgNC-tsDNA₁₇-miR-21纳米复合物LSPR散射λ_max的蓝移量Δλ_max-blue作为输出，Δλ_max-blue＝3nm作为临界值，当Δλ_max-blue大于3nm时，输出为“1”；反之，输出为“0”。图22a和图22b所示分别给出了基于Au@AgNC-tsDNA₁₇-miR-21纳米复合物的核酸内切酶活性检测以及OR逻辑运算的示意图和OR逻辑运算信号输出及真值表。从图中可以看出，当不存在核酸内切酶KpnI和StuI时(input＝0/0)，Au@AgNC-tsDNA₁₇-miR-21纳米复合物的LSPR散射λ_max基本不发生改变(output＝0)，以单个Au@Ag NC-tsDNA₁₇探针分子与靶分子miR-21杂交形成Au@Ag NC-tsDNA₁₇-miR-21纳米复合物作为OR逻辑运算的初始状态，此时tsDNA₁₇-miR-21的结构处于“拉紧”的T3状态(I)；当分别存在核酸内切酶KpnI或StuI时(input＝1/0or 0/1)，tsDNA₁₇的边(l2或l3)分别被破坏，此时tsDNA₁₇-miR-21的结构相应的处于“松弛”的R₂状态(II)和R₃状态(III)，Au@AgNC-tsDNA₁₇-miR-21纳米复合物的LSPR散射λ_max相应的发生了8nm的蓝移(Δλ_max-blue-miR-21@KpnI＝8nm，output＝1)和10nm的蓝移(Δλ_max-blue-miR-21@StuI＝10nm，output＝1)；当同时存在核酸内切酶KpnI和StuI时(input＝1/1)，tsDNA₁₇的两条边(l₂和l₃)同时被破坏，tsDNA₁₇-miR-21的结构由最初“拉紧”的T₃状态变为“松弛”的R_2/3状态(IV)，Au@AgNC-tsDNA₁₇-miR-21纳米复合物的LSPR散射λ_max发生了18nm的蓝移(Δλ_max-blue-miR-21@KpnI@StuI＝18nm，output＝1)。因此，单个Au@AgNC-tsDNA₁₇-miR-21纳米复合物LSPR散射λmax的变化特性可以作为一种OR逻辑运算。

实施例7

本实施例涉及一种利用四面体结构DNA修饰Au@AgNCs生物识别探针同时对miR-21和核酸内切酶的检测设计的逻辑运算方法，具体包括如下步骤：

以加入靶分子miR-21作为一种输入，以加入核酸内切酶(KpnI和StuI)作为另一种输入，单个Au@AgNC-tsDNA₁₇探针分子LSPR散射λ_max的红移量作为输出，设计和构建了基于单个Au@AgNC-tsDNA₁₇探针分子LSPR散射λ_max的变化的XOR逻辑运算。XOR逻辑运算可以被理解为当且仅当加入一种输入时，输出为“1”。

定义当加入靶分子miR-21或核酸内切酶(KpnI和StuI)时，输入为“1”，反之，输入为“0”。

以单个Au@AgNC-tsDNA₁₇探针分子λ_max的红移量Δλ_max-red作为输出，Δλ_max-red＝20nm作为临界值，当Δλ_max-red大于20nm时，输出为“1”；当Δλ_max-red小于20nm时，输出为“0”。图23给出了Au@AgNC-tsDNA₁₇探针分子在靶分子miR-21以及核酸内切酶KpnI和StuI作用前后典型的LSPR散射光谱图。从图中可以看出，当不存在靶分子miR-21或核酸内切酶(KpnI和StuI)时，Au@AgNC-tsDNA₁₇探针分子的LSPR散射λ_max基本不发生改变(I)；当存在靶分子miR-21时(1pM)，Au@AgNC-tsDNA₁₇探针分子的LSPR散射λ_max发生了明显的红移(Δλ_{max-red-miR-21}＝31nm)，其LSPR散射光颜色由绿色变到橘色(II)；当存在核酸内切酶KpnI和StuI时，Au@AgNC-tsDNA₁₇探针分子的LSPR散射光颜色由绿色变到黄色(III)，其LSPR散射λ_max由原来的556nm红移至584nm，发生了28nm的红移(Δλ_{max-red-KpnI@StuI}＝28nm)；当靶分子miR-21(1pM)以及核酸内切酶KpnI和StuI同时存在时，Au@AgNC-tsDNA₁₇探针分子的LSPR散射λ_max发生了13nm的红移(Δλ_{max-red-miR-21@KpnI@StuI}＝13nm)。

基于上述实验结果，图24a和24b分别给出了基于Au@AgNC-tsDNA₁₇探针分子的XOR逻辑运算的示意图和XOR逻辑运算信号输出及真值表。

从图中可以看出，当靶分子miR-21以及核酸内切酶KpnI和StuI不存在时(input＝0/0)，以单个Au@AgNC-tsDNA₁₇探针分子作为XOR逻辑运算的初始状态，此时tsDNA₁₇的结构处于“拉紧”的T₀状态(I)，Au@AgNC-tsDNA₁₇探针分子的LSPR散射λ_max基本保持不变(output＝0)；当靶分子miR-21存在时(1pM，input＝1/0)，tsDNA₁₇和靶分子miR-21杂交，此时tsDNA₁₇-miR-21的结构处于“拉紧”的T₃状态(II)，Au@AgNC-tsDNA₁₇探针分子的LSPR散射λ_max发生了31nm的红移(Δλ_{max-red-miR-21}＝31nm，output＝1)；当核酸内切酶KpnI和StuI(input＝0/1)存在时，tsDNA₁₇的刚性结构被完全破坏，四面体结构DNA的顶部倒塌至Au@AgNCs的表面，此时tsDNA₁₇的结构处于“松弛”的R₀状态(III)，由于DNA分子取代了Au@AgNCs表面的部分水分子，导致Au@AgNCs表面折射率的增大，从而使Au@AgNC-tsDNA₁₇探针分子的LSPR散射λ_max发生了28nm的红移(Δλ_{max-red-KpnI@StuI}＝28nm，output＝1)；当靶分子miR-21(1pM)以及核酸内切酶KpnI和StuI同时存在时(input＝1/1)，tsDNA₁₇的两条边(l₂和l₃)同时被破坏，tsDNA₁₇的结构由最初“拉紧”的T0状态变为“松弛”的R_2/3状态(IV)，Au@Ag NC-tsDNA₁₇探针分子的LSPR散射λ_max发生了13nm的红移(Δλ_{max-red-miR-21@KpnI@StuI}＝13nm，output＝0)。因此，单个Au@Ag NC-tsDNA₁₇探针分子的LSPR散射λ_max的变化特性可以作为一种XOR逻辑运算。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

Claims (5)

1.一种生物识别探针的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

1）.分别制备金银核壳纳米立方体Au@AgNCs溶胶和四面体结构DNA溶液，并将所述Au@AgNCs固定于氧化铟锡导电膜玻璃表面；

2）. 将所述四面体结构DNA溶液滴加到固定有Au@AgNCs的氧化铟锡导电膜玻璃表面，室温下孵育2~6 h后，用超纯水洗涤，并用氮气吹干，得到基于tsDNA的单颗粒局域表面等离子体共振LSPR探针；

所述四面体结构DNA溶液的制备方法包括如下步骤：

2.1）将各条单链DNA溶解，在紫外分光光度计下测定260 nm处的吸收，并参考每条单链DNA的摩尔消光系数，确定其浓度；

2.2.）将四条单链DNA以等比例混合于TM缓冲液中，加入三（2-氯乙基）磷酸酯后，转入聚合酶链式反应仪中，在90~98℃下持续10~15 min后，迅速降温至0~5℃，得到tsDNA溶液。

2.如权利要求1所述的生物识别探针的构建方法，其特征在于，所述Au@AgNCs溶胶的制备方法包括如下步骤：

1.1）.合成纳米金种子；

1.2）.将所述纳米金种子与十六烷基三甲基氯化铵进行反应，得到金溶胶；

1.3）.将所述金溶胶与抗坏血酸在40~80℃下进行反应后，加入硝酸银，反应后得到Au@AgNCs溶胶。

3.如权利要求1所述的生物识别探针的构建方法，其特征在于，所述Au@AgNCs在氧化铟锡导电膜玻璃表面的固定方法为：

将氧化铟锡导电膜玻璃的表面清洗干净后，浸入到Au@AgNCs溶胶中，静置1~5 min后取出，用超纯水清洗并用氮气吹干，即可。

4.一种基于权利要求1所述构建方法制备的生物识别探针对核酸内切酶检测的逻辑运算方法，其特征在于，包括如下步骤：

3.1）制备Au@Ag NC-tsDNA₁₇探针分子和靶分子MicroRNA-21的纳米复合物；

3.2）定义当在所述纳米复合物中加入核酸内切酶KpnI和/或StuI时，输入为“1”，当核酸内切酶KpnI或StuI不存在时，输入为“0”；

3.3）以所述纳米复合物LSPR散射λ_max的蓝移量∆λ_max-blue作为输出，并设定输出的临界值，当∆λ_max-blue大于该临界值时，输出为“1”，反之，输出为“0”。

5.一种基于权利要求1中所述构建方法制备的生物识别探针针对MicroRNA-21和核酸内切酶检测的逻辑运算方法，其特征在于，包括如下步骤：

设定以单个Au@Ag NC-tsDNA₁₇探针分子中加入靶分子MicroRNA-21作为一种输入，加入核酸内切酶KpnI和StuI作为另一种输入，以单个Au@Ag NC-tsDNA₁₇探针分子在加入靶分子miR-21和/或核酸内切酶后的的LSPR散射λ_max的红移量∆λ_max-red作为输出；

设定输出的临界值；当∆λ_max-red大于所述临界值时，输出为“1”；当∆λ_max-red小于所述临界值时，输出为“0”。

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