CN110055245A - 一种dna四面体结构、制备方法及其应用 - Google Patents

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王露露
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Abstract

本发明公开了一种DNA四面体结构、制备方法及其应用。本发明公开了一种构建DNA四面体结构的序列。四面体结构由四条DNA单链组成；每条单链折叠形成三角形，组成四面体结构的其中一个面，所述四面体结构的每条边由两段DNA单链组成，每条边上的两段DNA链互补结合；所述四面体结构其中一条边不完全互补，由第一段双链DNA以及一段单链DNA组成。本发明制备一个完整的且尺寸控制、具有刚性的DNA四面体结构。基于该DNA四面体纳米结构开发的生物传感器在生物检测、活体成像、基因载体、药物传送等方面显示出良好的应用前景。

Description

一种DNA四面体结构、制备方法及其应用
技术领域
本发明属于纳米生物材料，特别涉及一种DNA四面体结构、制备方法及其应用。
背景技术
DNA分子是自然界储存重要遗传信息的载体，几乎编码了整个生物体。DNA分子遵循经典的Watson-Crick原则，通过碱基互补配对形成双螺旋，这一独特的分子特异性赋予了DNA可编程性以及作为工程材料的能力。在过去的三十年，正是因为来自化学、材料科学、生物学、物理学乃至计算机科学等领域的研究人员共同投身于DNA纳米技术领域，设计并发展了由简单到复杂、从一维到三维、由静态到动态的多种DNA纳米结构，极大提升了DNA纳米结构的数目和复杂性，为实现多种功能奠定了物质基础。
在DNA纳米结构各方面潜在的研究应用中，其在生物学以及生物医药学方面的应用更具吸引性，主要因为这些DNA纳米结构具备细胞膜通透性、低细胞毒性以及抗酶降解特性等，而这些特性恰恰是活体细胞研究中所具备的条件。其中一种纳米结构——DNA四面体纳米结构(Tetrahedral DNA Nanostructures,TDNs)，这种结构是由四条单链DNA组成，每条DNA单链形成该三维结构的其中一个面，而每条边上的两条DNA链又能够两两配对连接一起。相对于其他的DNA纳米结构，DNA四面体作为一种最简单而又最牢固的金字塔形三维结构模型之一，其制备较为简单并且产率高、尺寸以及动态性均可以调节，同时DNA四面体具有高度的机械刚性和稳定性，丰富的功能化修饰位点单一尺寸结构分布等。这些特性都说明了DNA四面体在生物检测、活体成像、基因载体、药物传送等方面显示出良好的应用前景。例如在药物载体研究方面，Li jiang等利用DNA四面体载带免疫激活的CpG核普酸序列，激活免疫信号的通路提高细胞体的免疫活性。在生物检测方面，Pei hao等在DNA四面体边长上设计三种不同的DNA序列，通过分别与氢离子、汞离子和ATP的作用形成的结构的变化，使得序列两段的荧光信号随之改变，以此在体外检测靶分子。
发明内容
发明目的：本发明的目的为提供了一种DNA四面体结构。本发明的另一目的为提供了该DNA四面体结构的制备方法。此外，本发明还提供了该DNA四面体结构的其应用。
技术方案：本发明第一方面提供了一种DNA四面体结构，由四条DNA单链(ss-DNA)组成；每条单链折叠形成三角形，组成四面体的其中一个面，所述四面体的每条边由两段DNA单链组成，四面体结构每条边上的两段DNA链互补结合；所述DNA四面体其中一条边不完全互补，由第一段双链DNA以及一段单链DNA组成。
所述四面体结构中的四条DNA单链，其中三条DNA单链由88个碱基组成，另外一条DNA单链由为72-82个碱基组成。
所述四条单链DNA的序列，如SEQ ID NO.1～4所示。
从本发明的单链设计可以看出，本发明通过四条ss-DNA中设计的碱基分布，使得单链组合而成的四面体每条边均通过碱基互补配对作用，搭建形成的三维立体。
通过SEQ ID NO.1～4序列得到一个五个边长为26对碱基且最后一个边不完全互补的DNA四面体结构，通过在三条DNA链顶点引入功能性基团，另一条短DNA链引入一个特异性互补DNA单链，可制备一个完整的且尺寸控制、具有刚性的DNA四面体结构。基于该DNA四面体纳米结构开发的生物传感器在生物检测、活体成像、基因载体、药物传送等方面显示出良好的应用前景。
所述具有88个碱基的DNA单链的5’端连接功能基团R，所述R选自巯基、氨基、羧基、PolyA和PolyC DNA中的任一种。本发明进一步功能化修饰或组装得到DNA一个完整的且尺寸控制、具有刚性的DNA四面体结构。
本发明第二方面提供了一种DNA四面体结构的制备方法，包括以下步骤：
(1)设计四条DNA单链，如SEQ ID NO.1～4所示；
(2)将四条DNA单链按摩尔浓度为0.99-1.02:0.99-1.02:0.99-1.02:0.99-1.02的比例混合于缓冲液中，在90-95℃变性5-10min，随后，迅速降低至4℃并保持30min，获得DNA四面体结构。
优选地，步骤(1)中，SEQ ID NO.1～3的5’端连接功能基团R，所述R选自巯基、氨基、羧基、PolyA和PolyC DNA中的任一种。
优选地，步骤(2)中，每条所述DNA单链的浓度为1-1.05μM。
本发明第三方面提供了一种用于生物检测的试剂盒，包含上述DNA四面体结构。
本发明第四方面提供了DNA四面体结构在生物检测、活体成像、基因载体和药物传递中的应用。
本发明第五方面提供了DNA四面体结构在miRNA检测中的应用。
有益效果：本发明的DNA四面体结构利用DNA单链与单链互补时形成的缺口，可与靶分子特异性识别，从而制备一个完整的且尺寸控制、具有刚性的DNA四面体结构生物传感器，该结构在纳米生物传感、成像、载药领域具有良好的应用前景。
附图说明
图1为使用NUPACK理论分析四条序列自组装成DNA四面体的理论产率；
图2为本发明DNA四面体结构聚丙烯酞胺凝胶电泳(PAGE)图；
图3为本发明DNA四面体结构示意图是聚丙烯酞胺凝胶电泳(PAGE)图。
具体实施方式
实施例1：
第一步：设计四条DNA序列，在TakaRa生物公司合成如下所示的四条单链：
A链：SEQ ID NO.1
5’-R-TTTGAGTCCGTCGGACGATGCGTAGATTCCTTTCGCGCACCTGAGACCTTCTAATAGGGTTTGCGACAGTCGTTCAACTAGAATGCCC-3’
B链：SEQ ID NO.2
5’-R-TTTCAATCTGCCAGGCCATAGCTTATCAGATTTGGGCTGTTCCGAGTGTGGCTCGTCGGTTTGGGCATTCTAGTTGAACGACTGTCGC-3’
C链：SEQ ID NO.3
5’-R-TTTGGAATCTACGCATCGTCCGACGGACTCTTTCCGACGAGCCACACTCGGAACAGCCCTTTGGCGAACTGGTCCCGTCTACTTACCG-3’
D链：SEQ ID NO.4
5’-TTTTGGCCTGGCAGATTGTTTCCCTATTAGAAGGTCTCAGGTGCGCGTTTCGGTAAGTAGACGGGACCAGTTCGCC-3’
第二步：使用TM buffer(20mM Tris+50mM MgCl2)作为缓冲溶液，通过紫外可见光分光光度仪精确定量DNA引物单链，然后将四条DNA单链按1:1:1:1的比例混合于TM Buffer中，其中每条引物单链的浓度为1μM；通过PCR仪中设定的95度变性10分钟，迅速降低至4度并保持30min的程序，即可获得所需的DNA四面体结构。
用上述方法分别A链与B链双链结合样品、A链、B链以及C链三条链结合样品，将合成好的DNA四面体结构、双链结合样品、三链结合样品，以及单独的A链，使用8％的聚丙烯酞胺凝胶电泳(Polyacrylamide GelElectrophoresis,PAGE)进行结构的表征。
DNA四面体结构的理论产率分析：基于NUPACK理论分析四条链组装成四面体结构的产率，如图1所示，其产率高达85％。
如图2所示，图2中的标记①为A链电泳条带，图2中的标记②为A链与B链双链结合样品电泳条带，图2中的标记③为A链、B链及C链三条链结合样品电泳条带，图2中的标记④为本实施例制备的DNA四面体电泳条带，该结构成功组装。
从条带④可以看出四面体结构的条带清晰且亮度高较亮,而其他杂条带亮度非常低,在DNA链的总量确定的情况下，可以看出本发明的四面体结构产率高。
如图3所示，A链、B链、C链三条链的碱基数为88个，而D链仅有76个碱基，四条链自组装得到的结构是一个五个边长为26对碱基且最后一个边条不完全互补的DNA四面体结构，且D链的碱基数可以在76-82之间选择，均可以使得最终制备的四面体结构含有缺口。
本发明四面体结构由四条DNA单链组成，每条单链折叠形成开口三角形，组成四面体结构的其中一个面，所述四面体结构的每条边由两段DNA单链组成，每条边上的两段DNA链互补结合，四面体结构其中一条边不完全互补，由于碱基数较少的D链在折叠形成三角形，形成的一条边短于其他链形成的边，故形成的四面体其中一条边有一段是由两段DNA链，另一段仅为DNA单链结构。
从图3可以看出，本发明制备的DNA四面体结构引入的D链可完全与部分B链特异性互补杂交，利用空余的单链B结构单元可与靶分子特异性识别。
本发明中的A、B和C链5’端可进行生物功能化修饰，连接功能基团R，包括巯基、氨基、羧基、PolyA或PolyC DNA等，可用于进一步功能化修饰或组装得到DNA一个完整的且尺寸控制、具有刚性的DNA四面体结构。这种纳米生物传感器在生物检测、活体成像、基因载体、药物传送等方面显示出良好的应用前景。
序列表
<110> 南京邮电大学
<120> 一种DNA四面体结构、制备方法及其应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 88
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tttgagtccg tcggacgatg cgtagattcc tttcgcgcac ctgagacctt ctaatagggt 60
ttgcgacagt cgttcaacta gaatgccc 88
<210> 2
<211> 88
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tttcaatctg ccaggccata gcttatcaga tttgggctgt tccgagtgtg gctcgtcggt 60
ttgggcattc tagttgaacg actgtcgc 88
<210> 3
<211> 88
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tttggaatct acgcatcgtc cgacggactc tttccgacga gccacactcg gaacagccct 60
ttggcgaact ggtcccgtct acttaccg 88
<210> 4
<211> 76
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ttttggcctg gcagattgtt tccctattag aaggtctcag gtgcgcgttt cggtaagtag 60
acgggaccag ttcgcc 76

Claims (10)

1.一种DNA四面体结构，其特征在于，所述四面体结构由四条DNA单链组成；每条单链折叠形成三角形，组成四面体结构的其中一个面，所述四面体结构的每条边由两段DNA单链组成，每条边上的两段DNA链互补结合；所述四面体结构其中一条边不完全互补，由第一段双链DNA以及一段单链DNA组成。
2.根据权利要求1所述的DNA四面体结构，其特征在于，所述四面体结构中的四条DNA单链，其中三条DNA单链由88个碱基组成，另外一条DNA单链由为72-82个碱基组成。
3.根据权利要求2所述的DNA四面体结构，其特征在于，所述四条单链DNA的序列，如SEQID NO.1～4所示。
4.根据权利要求2所述的DNA四面体结构，其特征在于，所述具有88个碱基的DNA单链的5’端连接功能基团R，所述R选自巯基、氨基、羧基、PolyA和PolyC DNA中的任一种。
5.根据权利要求1-4任一所述的DNA四面体结构的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)设计四条DNA单链，如SEQ ID NO.1～4所示；
(2)将四条DNA单链按摩尔浓度为0.99-1.02:0.99-1.02:0.99-1.02:0.99-1.02的比例混合于缓冲液中，在90-95℃变性5-10min，随后，迅速降低至4℃并保持30min，获得DNA四面体结构。
6.根据权利要求5所述的DNA四面体结构的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，SEQ IDNO.1～3的5’端连接功能基团R，所述R选自巯基、氨基、羧基、PolyA和PolyC DNA中的任一种。
7.根据权利要求5所述的DNA四面体结构的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，每条所述DNA单链的浓度为1-1.05μM。
8.一种用于生物检测的试剂盒，其特征在于，包含如权利要求1-4任一所述的DNA四面体结构。
9.根据权利要求1-4任一所述的四面体结构或如权利要求5或6所述的制备方法制备的四面体结构在生物检测、活体成像、基因载体和药物传递中的应用。
10.根据权利要求1-4任一所述的四面体结构在miRNA检测中的应用。
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