CN113134093A

CN113134093A - 一种dna四面体纳米结构作为治疗内耳疾病药物的载体的应用

Info

Publication number: CN113134093A
Application number: CN202110402559.7A
Authority: CN
Inventors: 潘林强; 孙宇; 徐飞; 陈森; 陈奎廷; 谢乐; 金媛
Original assignee: Huazhong University of Science and Technology
Current assignee: Huazhong University of Science and Technology
Priority date: 2021-04-14
Filing date: 2021-04-14
Publication date: 2021-07-20
Anticipated expiration: 2041-04-14
Also published as: CN113134093B

Abstract

本发明提供一种DNA四面体纳米结构作为治疗内耳疾病药物的载体的应用；其中，所述DNA四面体纳米结构通过圆窗注射达到内耳功能细胞。本发明中，通过小鼠圆窗给药技术成功证实了DNA四面体纳米结构可以进入内耳功能细胞。因此，本发明首次实现了DNA四面体纳米结构在内耳听力毛细胞部位的富集，为输送内耳疾病药物提供了新途径。同时，核酸分子天然具有低毒、生物相容性优异等优点，以及框架核酸合成价格低廉(每次注射成本约人民币几元钱)，因而，本发明提供的DNA四面体纳米结构是治疗内耳疾病的理想药物载体。

Description

一种DNA四面体纳米结构作为治疗内耳疾病药物的载体的应用

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及一种DNA四面体纳米结构作为治疗内耳疾病药物的载体的应用。

背景技术

据世卫组织统计，全球超过5％的人口遭受听力损失的影响，其中绝大部分患者涉及听觉神经元或耳蜗感觉细胞等内耳组织的损伤。因此，针对内耳疾病的研究是耳科疾病的重点研究领域。

在目前的研究中，对内耳疾病的治疗大多采用手术给药方式。利用药物输送载体，通过脉管系统将具有针对性的药物输送到内耳，已成为目前治疗内耳疾病的常用方法。其中，合成药物输送载体的发展，为内耳组织损伤类疾病的治疗提供了新途径。例如，修饰了靶向肽的纳米颗粒能够选择性的富集在内耳特定类型的细胞周围，从而将药物靶向输送给内耳组织细胞。这些纳米颗粒通常由聚合物在水中自组装，形成纳米级的囊泡，通过工程改造使其具有包括生物相容性、免疫逃逸、可控释放等一系列特性，成为潜在的药物载体。并且，已有的研究中公开了将Tet1靶向机制(结合神经元受体的梭菌毒素的三唾液酸神经节苷脂)整合到基于PEG的聚合物囊泡上，再通过耳蜗造口手术进入耳蜗后靶向耳蜗神经。

然而，这些纳米材料通常具有一定的生物毒性，且成本较高。因此，加快研究低成本、生物相容性好的内耳药物载体已经成为治疗内耳疾病的一项紧迫和高技术含量的任务。

发明内容

针对现有技术中存在的上述问题，本发明提供了一种DNA四面体纳米结构作为治疗内耳疾病药物的载体的应用。以有效的解决现有载体成本高、具有生物毒性的问题。

本发明提供一种DNA四面体纳米结构作为治疗内耳疾病药物的载体的应用；其中，所述DNA四面体纳米结构通过内耳圆窗注射达到内耳功能细胞(耳蜗内外毛细胞)。

优选地，所述应用的具体操作包括：通过内耳圆窗注射的方式，将所述DNA四面体纳米结构注入内耳。

优选地，所述DNA四面体纳米结构作为治疗内耳疾病药物的载体，可用于合成DNA四面体-内耳药物载体复合物。

优选地，所述DNA四面体纳米结构的制备方法，包括：

将编号为T1、T2、T3、T4-Cy5的四条DNA单链等比例混合，然后加入1×TM溶液，混合均匀后，至于PCR仪内，经PCR变温反应自组装制得DNA四面体纳米结构。

优选地，所述编号为T1的DNA单链的核苷酸序列见SEQ ID NO:1；所述编号为T2的DNA单链的核苷酸序列见SEQ ID NO:2；所述编号为T3的DNA单链的核苷酸序列见SEQ IDNO:3；所述编号为T4-Cy5的DNA单链的核苷酸序列见SEQ ID NO:4。

优选地，所述1×TM溶液的pH＝8，由10mM Tris-HCl和5mM MgCl₂组成；

优选地，所述PCR变温反应包括：将温度升到95℃维持5min，然后降至54℃维持30min，再降至4℃维持30sec，最后升温至24℃保持。

优选地，所述四条DNA单链的浓度均为250nM。

与现有技术相比，本申请包括以下优点：

第一点，本发明提供的DNA四面体纳米结构可以通过细胞内吞作用穿透细胞膜进入活细胞，而无需使用任何配体或转染剂，具有优异的细胞膜通透性；

第二点，基于DNA序列的高度可编程性，本发明提供的四面体框架核酸可与其他材料结合，为内耳药物-DNA四面体纳米结构复合物的合成提供了技术基础。同时，也为DNA四面体纳米结构作为药物输送载体提供了新的应用场景；

第三点，现有技术中采用的纳米材料做药物载体，大多具有细胞毒性，而DNA则具有天然的生物相容性，因而，本发明提供的四面体框架核酸是一种无细胞毒性的药物载体；

第四点，本发明提供的DNA四面体纳米结构以DNA双链为主体。因此，在用作管脉输送内耳药物的载体时，可抵抗核酸酶和蛋白酶的攻击而不被其水解，具有长时间保持结构完整性和稳定性的能力；

第五点，得益于DNA合成技术的发展，DNA四面体纳米结构的框架核酸结构简单容易获取，且合成成本低廉，因此，基于DNA四面体纳米结构，研究制备内耳药物-DNA四面体纳米结构药物输送复合物，能够有效降低内耳疾病治疗的成本。

附图说明

图1示出了本发明实施例提供的DNA四面体纳米结构由制备到验证其进入内耳毛细胞过程的过程示意图；

图2示出了本发明实施例提供的乳鼠圆窗注射具有Cy5修饰的DNA四面体纳米结构共聚焦显微镜图；

图3示出了本发明实施例提供的乳鼠圆窗注射Cy5荧光基团共聚焦显微镜图；

图4示出了本发明实施例提供的DNA四面体纳米结构框架结构示意图；

图5示出了本发明实施例提供的DNA四面体纳米结构聚丙烯酰胺凝胶电泳表征图。

具体实施方式

提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。

实施例中未注明具体实验步骤或者条件，按照本领域内的现有技术所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂以及其他仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。

首先，本发明的发明人发现，现有的治疗内耳疾病方法，其主要手段是手术给药。现有的针对内耳疾病的药物输送载体，如腺相关病毒、细胞移植等，通常价格昂贵，且具有一定毒性。因此，如何设计制备价廉的、无毒性的纳米载体，实现纳米载体圆窗注射内耳富集，是目前内耳疾病治疗的研究重点。

发明人基于上述发现的问题，提出的技术构思为：基于核酸分子天然具有低毒、生物相容性优异等优点，加之框架核酸合成价格低廉(每次注射成本约人民币几元钱)，研究设计并制备出具有框架核酸结构的DNA四面体纳米结构。并且，发明人通过实验证明，制备的框架核酸四面体结构能够穿过内耳圆窗组织细胞，实现小鼠圆窗注射，内耳耳蜗内外毛细胞富集。基于上述技术构思，发明人通过大量实验，提供了一种DNA四面体纳米结构作为治疗内耳疾病药物的载体的应用。具体实施内容如下：

首先，在应用方面，本发明提供一种DNA四面体纳米结构作为治疗内耳疾病药物的载体的应用；其中，所述DNA四面体纳米结构通过内耳圆窗注射到达内耳。

图1示出了本发明实施例提供的DNA四面体纳米结构由制备到验证其进入内耳毛细胞过程的过程示意图。参考图1，本发明是利用4条DNA单链构造出四面体框架核酸结构。并且，通过小鼠手术圆窗给药，观察纳米结构在内耳内外毛细胞等部位的富集情况，验证了纳米载体对内耳功能细胞的透过性，得出本发明提供的DNA四面体纳米结构可以作为输送内耳疾病药物的载体，通过圆窗注射方式应用于内耳疾病的治疗。

接下来，发明人通过实施例来验证，本发明提供的DNA四面体纳米结构可以穿过内耳圆窗细胞，在内耳毛细胞部位富集。继续参考图1，本发明专利使用带有Cy5荧光修饰后的DNA单链，通过自组装过程，构成四面体框架核酸结构，通过小鼠手术圆窗给药，利用荧光显微镜等表征手段，观察到内耳荧光染料富集现象。首次实现了DNA四面体纳米结构，在内耳部位的富集成像。具体过程如下实施例所示：

实施例1：乳鼠圆窗注射

P2至P3的新生小鼠采用低温麻醉2-3min直到失去意识，然后移到冰垫上进行后续手术。手术时间限制在5-10min，对每只动物左耳进行手术。麻醉后，耳后切口显露耳大泡，并观察耳蜗。根据颞骨与面神经的相对位置，暴露圆窗。手术过程中要特别注意避免损伤面神经。使用超微量泵控制的玻璃微管(25μm)，通过圆窗注射DNA四面体纳米结构溶液。注射量控制在1.5～2μL/耳蜗。阴性对照注射等量的Cy5荧光基团溶液。注射后，使用兽医组织粘合剂缝合皮肤切口。随后，幼崽被放回38℃的暖垫中复温10min，然后再回到它们的母亲身边继续哺乳。

实施例2：耳蜗组织制备及共聚焦成像

小鼠麻醉后颈椎脱臼处死，断头后小心取出内耳，转移至含4％多聚甲醛固定液，体视显微镜下去除内耳多余组织，用针头挑开圆窗、卵圆窗、蜗顶骨壁，吸取轻柔吹入耳蜗中阶。室温固定2h，PBS溶液冲洗两次去除残余固定液后，转移至10％EDTA-2Na脱钙液中4℃放置72h，每日换液。小鼠内耳充分脱钙后，转移至盛有PBS缓冲液的玻璃皿中，体视显微镜下小心去除脱钙蜗壳，由顶回至顶回逐步分离基底膜，并进一步去除周围无关组织。将分理出的基底膜转移至EP管中。移除浸泡基底膜的PBS溶液，配置含1％Triton X-100的10％的驴血清室温浸泡基底膜组织破膜、封闭1h。用DAPI对细胞核进行染色，常温避光浸泡15min。移除DAPI染色液，用PBS浸泡5min重复三次。用荧光标记的鬼笔环肽染色，常温避光浸泡15min。移除鬼笔环肽染色液，用PBS浸泡5min重复三次。将基底膜转移至载玻片上，吸取多余的PBS缓冲液，滴加1-2滴抗荧光淬灭封片剂封片观测。激光共聚焦显微镜拍照观察免疫荧光染色结果，根据免疫荧光照片，统计相应结果。并运用激光共聚焦显微镜配套软件三维重建Corti器细胞骨架和Cy5荧光图像。图2示出了本发明实施例提供的乳鼠圆窗注射具有Cy5修饰的DNA四面体纳米结构共聚焦显微镜图。参考图2，手术圆窗注射具有Cy5修饰的DNA四面体纳米结构，小鼠耳蜗组织共聚焦图像。作为参考对比，内耳手术注射组的小鼠耳蜗内毛细胞、外毛细胞部位可以观察到明显的Cy5荧光信号，说明Cy5修饰的DNA四面体在此处有明显富集。

图3示出了本发明实施例提供的乳鼠圆窗注射Cy5荧光基团共聚焦显微镜图。图3为圆窗注射阴性对照组。等量注射Cy5荧光基团，未能观察到耳蜗部分的荧光信号，表示Cy5只有修饰在DNA四面体上，才能够由四面体带入耳蜗内外毛细胞。

最后，本发明实施例提供了本发明上述实施例使用的DNA四面体纳米结构的制备方法，包括：

本发明实施例中，优选地，编号为T1的DNA单链的核苷酸序列见SEQ ID NO:1；编号为T2的DNA单链的核苷酸序列见SEQ ID NO:2；编号为T3的DNA单链的核苷酸序列见SEQ IDNO:3；编号为T4-Cy5的DNA单链的核苷酸序列见SEQ ID NO:4。

本发明实施例中，优选地，1×TM溶液的pH＝8，由10mM Tris-HCl和5mM MgCl₂组成；

本发明实施例中，优选地，PCR变温反应包括：将温度升到95℃维持5min，然后降至54℃维持30min，再降至4℃维持30sec，最后升温至24℃保持。

本发明实施例中，优选地，四条DNA单链的浓度均为250nM的方法，

为使本领域技术人员更好地理解本发明实施例中DNA四面体纳米结构的制备方法，以下通过具体的实施例来说明。

实施例3：DNA四面体纳米结构的制备本发明提供的框架核酸四面体由4条DNA单链合成，DNA单链由上海生工公司合成，分别命名为T1、T2、T3、T4-Cy5。其中，T1、T2、T3为普通核苷酸序列，无任何化学基团修饰。T4-Cy5的5’端口有Cy5荧光基团修饰，以便使用共聚焦荧光显微镜观测四面体结构的位置。DNA单链的编号分别为T1、T2、T3、T4-Cy5，具体序列如表1所示：

表1:DNA四面体序列设计

具体的制备方法为：

(1)对订购的，编号为T1、T2、T3、T4-Cy5的，干粉状态的DNA单链进行溶解和浓度测量。

首先，将干分状的，编号为T1的DNA分子离心，具体操作为，以8000rpm的转速离心3min。离心后小心取出样品管，加入适量去离子水(添加量在包装管壁有标明)，涡旋震荡3min，使用手握式离心机将溶液收集至管底，用于测量溶解DNA的浓度。

然后，使用Thermo

NanoDrop微量分光光度计测量溶液O.D.值。首先，用无水乙醇清洁样品台，滴2μL去离子水作为空白对照。测试每条DNA序列在260nm波长处的O.D.值并根据寡核苷酸分子量，计算每条DNA单链的浓度。

最后，对编号为T2、T3、T4-Cy5的DNA单链，使用上述对编号为T1的DNA单链相同的方法进行溶解和浓度测量。

(2)DNA四面体的制备及表征

等比例混合编号为T1、T2、T3、T4-Cy5的4条DNA单链，每条DNA终浓度为250nM，混合在1×TM溶液(10mM Tris-HCl,5mM MgCl2,pH＝8)中。混合物分装至PCR管(容积200μL的EP管)，按照表2的变温程序完成退火，具体的，将温度升到95℃维持5min，然后降至54℃维持30min，再降至4℃维持30sec，最后升温至24℃保持。DNA序列遵循碱基互补配对原则，自组装成如图4的四面体结构。

表2:制备DNA四面体PCR退伙程序

步骤	温度	持续时间
			1	95℃	5min
2	54℃	30min
			3	4℃	30sec
4	24℃	保持

制备好的DNA四面体纳米结构通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)表征，图5示出了本发明实施例提供的DNA四面体纳米结构聚丙烯酰胺凝胶电泳表征图。参考图5，泳道1代表单独的DNA单链T1；泳道2代表T1和T2两条DNA链的混合物，相较于单独的DNA链T1，两条DNA链的杂交产物拥有更大的分子量，在等时间的电泳中具有较小的分子迁移量，表现为混合物条带高于单条DNA链条带；泳道3代表T1、T2、T3三条链DNA杂交产物，因为分子量进一步增加，条带也进一步向上移动；泳道4代表制备好的DNA四面体纳米结构，在凝胶电泳中，除了分子量外，分子的形貌特征也会影响条带的位置，四面体结构均一，在凝胶电泳迁移中具有较小的阻力。综合考虑四面体结构分子量的变化和形貌特征，四面体条带向上移动量较小是合理的。DNA四面体纳米结构合成成功。

Claims

1.一种DNA四面体纳米结构作为治疗内耳疾病药物的载体的应用，其特征在于，所述DNA四面体纳米结构通过内耳圆窗注射达到内耳功能细胞。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用的具体操作包括：基于内耳圆窗注射的方式，将所述DNA四面体纳米结构注入内耳。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述DNA四面体纳米结构作为治疗内耳疾病药物的载体，用于合成DNA四面体-内耳药物载体复合物。

4.根据权利要求1-3任意一项所述的应用，其特征在于，所述DNA四面体纳米结构的制备方法，包括：

将编号为T1、T2、T3、T4-Cy5的四条DNA单链在1×TM溶液中等比例混合，混合均匀后，置于PCR仪内，经PCR变温反应自组装制得DNA四面体纳米结构。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述编号为T1的DNA单链的核苷酸序列见SEQ ID NO:1；所述编号为T2的DNA单链的核苷酸序列见SEQ ID NO:2；所述编号为T3的DNA单链的核苷酸序列见SEQ ID NO:3；所述编号为T4-Cy5的DNA单链的核苷酸序列见SEQID NO:4。

6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述1×TM溶液的pH＝8，由10mMTris-HCl和5mM MgCl₂组成。

7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述PCR变温反应包括：将温度升到95℃维持5min，然后降至54℃维持30min，再降至4℃维持30sec，最后升温至24℃保持。

8.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述四条DNA单链的浓度均为250nM。