CN110917121A - 一种apd杂化纳米系统及其构建方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种APD杂化纳米系统及其构建方法和应用，该杂化系统是由含巯基的阳离子聚合物修饰的纳米金棒与左旋DNA四面体混合，孵育得到。本发明使用无修饰的DNA，避免使用昂贵的巯基化DNA，更有利于降低纳米级药物载体的成本。发明人发现，并通过试验证明了，使用左旋DNA，能够耐核酶降解，同时聚合物与DNA复合后，可保护DNA，双重作用提高体系的稳定性。该APD杂化纳米系统还具有高效入胞的能力。可用于负载药物，特别是化疗药物，在肿瘤热疗和化疗联合治疗领域具有应用前景。

Description

一种APD杂化纳米系统及其构建方法和应用
技术领域
本发明属于纳米级药物载体领域，涉及杂化纳米系统，同时涉及该杂化纳米系统的构建方法和应用。
背景技术
英国牛津大学Russell P.Goodman教授发明了“一步法”合成DNA四面体(TDNs)，该技术操作简便、产率极高。DNA四面体具有生物相容性好、负载能力强、结构可设计、尺寸均一等优势，DNA四面体可负载多种化疗药物、DNA、RNA和寡核苷酸等，可用于生物传感器、生物分子检测、药物载体等生物医学领域。
金纳米棒具有各向异性的形状，显示出横向和纵向两个等离子共振(SPR)效应。通过改变金纳米棒的长径比，可在可见光区和近红外光区(650-1100纳米)精确调控纵向SPR峰(LSPR)。生物组织对近红外光吸收率很低，但金纳米棒对近红外光的吸收率很高，并且能将吸收的光能转化为热能，因此金纳米棒在光热治疗等生物医学领域备受关注。
晶种生长法是目前制备金纳米棒最常用的方法之一，能够制备出稳定的CTAB包覆金纳米棒(CTAB-AuNRs)。然而CTAB对细胞有毒性，并且不利于金纳米棒表面功能化，因此金纳米棒表面功能化对其在生物医学领域的应用有重要促进作用。
已有研究将右旋DNA四面体(D-TDNs)与金棒结合，用于药物递送。通常利用右旋DNA四面体末端的巯基与金棒表面的金原子形成金-巯键，制备金棒/DNA杂化纳米系统。
在实现本发明过程中，发明人发现现有技术中至少存在如下问题中的至少一个问题：
1)现有方法合成制备DNA四面体所用巯基化DNA，合成成本远高于无修饰的DNA。
2)右旋DNA四面体会被脱氧核糖核酸酶降解，稳定性较差，不利于其长期稳定地发挥作用。
3)巯基化TDNs与金纳米棒的结合反应存在操作繁琐、耗时、金棒易聚沉等问题；金纳米棒修饰过程操作复杂、繁琐，需要试验人员具备一定的经验和技能，否则，容易导致金纳米棒修饰失败；金纳米棒修饰过程耗时长，短则数小时，长则一两天，耗费试验人员大量宝贵时间；同时，在依赖于DNA修饰的金纳米棒的试验或治疗工作中，需要花大量时间来准备DNA修饰的金纳米棒，及时性差，工作效率低。
4)TDNs修饰的金纳米棒表面电荷呈负电性，不利于细胞内吞。
本申请中，APD杂化纳米系统是指基于金纳米棒、阳离子聚合物、DNA的杂化纳米系统。
发明内容
鉴于此，本发明目的在于提供一种新型纳米级药物载体，在金纳米棒表面修饰阳离子聚合物，利用阳离子聚合物与负电性的左旋DNA四面体(L-TDNs)复合，构建三元杂化纳米结构，该纳米系统可负载化疗药物，用于肿瘤治疗领域；同时也丰富了多功能杂化纳米粒种类。
本发明的另一目的在于提供前述新型纳米级药物载体的构建方法。
本发明的又一目的在于提供前述新型纳米级药物载体的具体应用。
发明人通过长期的探索和尝试，以及多次的试验和努力，不断的改革创新，为解决以上技术问题，本发明提供的技术方案是，提供一种APD杂化纳米系统，该杂化系统是由含巯基的阳离子聚合物修饰的金纳米棒与左旋DNA四面体混合，孵育得到。
根据本发明APD杂化纳米系统的一个具体实施方式，所述离子聚合物修饰的金纳米棒通过以下步骤得到：
1)通过晶种生长法制备CTAB包覆的金纳米棒；
2)取金纳米棒离心，除去上清液，用超纯水重悬沉淀；加入含巯基的阳离子聚合物溶液，旋涡混合，低温冷冻，室温解冻成溶液，离心，弃去上清液，超纯水重悬沉淀，得到阳离子聚合物修饰的金纳米棒。
根据本发明APD杂化纳米系统的一个具体实施方式，所述离子聚合物修饰的金纳米棒通过以下步骤得到：
1)通过晶种生长法制备特定尺寸CTAB包覆的金纳米棒；
2)取0.5ml金纳米棒以12000转/分的速度离心10分钟，除去上清液，用0.5ml超纯水重悬沉淀，重复上述离心操作，除去上清液；加入含巯基的阳离子聚合物溶液0.5ml，阳离子聚合物与金纳米棒的摩尔比为500:1～20000:1，旋涡混合30秒后，于-20～-196℃冷冻至少5分钟；然后室温解冻成溶液后，离心，弃去上清液，超纯水重悬沉淀；重复上述过程3次，得到阳离子聚合物修饰的金纳米棒。
根据本发明APD杂化纳米系统的一个具体实施方式，所述含巯基的阳离子聚合物为含有伯氨基、仲胺基、叔氨基、咪唑基、胍基、季铵离子、氮杂环中一种或多种官能团。
根据本发明APD杂化纳米系统的一个进一步的具体实施方式，所述含巯基的阳离子聚合物为聚赖氨酸、含巯基的聚组氨酸、含巯基的聚精氨酸、含巯基的鱼精蛋白、含巯基的二硫键交联聚乙烯亚胺中的一种或多种，所述聚乙烯亚胺为重均分子量小于5000Da的低分子量聚乙烯亚胺。
根据本发明APD杂化纳米系统的一个具体实施方式，所述左旋DNA四面体通过以下步骤得到：
取四种左旋DNA单链，分别溶于TM缓冲液中，取等体积等摩尔浓度的四种DNA溶液于试管中，旋涡混合30秒至2分钟；
将混合溶液置于PCR仪中，95℃退火5分钟至15分钟，冷却至4℃过夜。
根据本发明APD杂化纳米系统的一个具体实施方式，所述四种左旋DNA单链碱基序列如序列表1，分别为序列S1、序列S2、序列S3、序列S4。
根据本发明APD杂化纳米系统的一个具体实施方式，所述孵育的时长为15-60分钟。
本发明还提供了前述APD杂化纳米系统的构建方法，包括如下步骤：
1)通过晶种生长法制备特定尺寸的金纳米棒；
2)取四种的左旋DNA单链，分别溶于TM缓冲液中；四种左旋DNA单链碱基序列如序列表1；所述TM缓冲液为20mMTris碱，5mMMgCl2，pH＝8；取等体积相同摩尔浓度的四种DNA溶液于试管中，旋涡混合30秒至2分钟；随后将混合溶液置于PCR仪中，95℃退火5至15分钟，冷却至4℃过夜，制备得到L-TDNs；
3)取0.5ml金纳米棒以12000转/分的速度离心10分钟，除去上清液，用0.5ml超纯水重悬沉淀，重复上述离心操作，除去上清液；加入含巯基的阳离子聚合物溶液0.5ml，聚合物与金纳米棒的摩尔比为500:1～20000:1，旋涡混合30秒后，于-20～-196℃冷冻至少5分钟；然后室温解冻成溶液后，离心，弃去上清液，超纯水重悬沉淀；重复上述过程3次，得到含巯基阳离子聚合物修饰的金纳米棒；
4)将步骤3)中制备得到的含巯基聚合物修饰的金纳米棒与L-TDNs混合，孵育15～60分钟；然后离心，弃去上清液，得到棕色沉淀为APD纳米粒。
根据本发明APD杂化纳米系统的构建方法的一个具体事实方式，所述晶种生长法制备特定尺寸金纳米棒的具体步骤：
1)将3.7mL0.1摩尔/升CTAB和150μL0.01摩尔/升HAuCl4混合后加0.85mL去离子水，冰浴状态下再加入0.3mL0.01摩尔/升冰NaBH4水溶液，1200转/分快速搅拌2分钟，静置2～5h将立即生成CTAB包覆的金种子；
2)将已制备的金种子溶液1.4mL加入到金纳米棒生长液中，450转/分钟快速搅拌2分钟，静置12h后以10000转/分转速离心10分钟，用0.01摩尔/升CTAB溶液重悬金纳米棒，常温保存备用。
本发明还提供了一种APD杂化纳米系统的应用，用于负载药物，特别是化疗药物。
与现有技术相比，上述技术方案中的一个技术方案具有如下优点：
a)本发明使用无修饰的DNA，避免使用昂贵的巯基化DNA，更有利于降低纳米级药物载体的成本。
b)发明人发现，并通过试验证明了，使用左旋DNA，能够耐核酶降解，同时聚合物与DNA复合后，可保护DNA，双重作用提高体系的稳定性。
c)本发明的一个实施例中，采用冰冻法制备阳离子聚合物包覆的金纳米棒，无需使用额外试剂就能有效防止金纳米棒聚沉，具有制备方法简单、成本低廉的优势。
d)本发明APD杂化系统中，阳离子聚合物包覆的金棒表面有较多活性官能团，比如氨基，有利于键合靶向分子RGD、叶酸、抗体等其它功能分子。
e)本发明的一个实施例中，制备得到的L-TDNs每条边含有至少30个碱基，能负载多种化疗药物，且按照重量百分比计，载药量高达85％。
f)本发明制备的纳米体系表面呈正电荷，利于细胞内吞，入胞效率高。
附图说明
图1是DNA标准样、DNA双链、DNA三链和DNA四面体的聚丙烯酰胺凝胶电泳图。
图2(A)是CTAB包覆的金纳米棒透射电镜图。
图2(B)是APD杂化纳米系统透射电镜图。
图3是APD杂化纳米系统与CTAB包覆的金纳米棒紫外-可见吸收光谱对比图。
图4是APD杂化纳米系统与CTAB包覆的金纳米棒zeta电位对比图。
图5是载体与酶孵育后的聚丙烯酰胺凝胶电泳图。条带1：没有与酶孵育的L-TDNs，条带2：与酶孵育8小时后的L-TDNs，条带3：与酶孵育8小时后的APD，条带4：与酶孵育8小时后的D-TDNs。
图6是盐酸阿霉素和不同纳米级阿霉素载体的细胞摄取效果对比图。
具体实施方式
下面结合具体实施例进行说明。
为使本发明实施方式的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施方式，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。因此，以下对在附图中提供的本发明的实施方式的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施方式。
以下实施例中，所使用的生长液为：300mLCTAB，物质的量浓度为0.1摩尔/升；16mLHAuCl4，物质的量浓度为0.01摩尔/升；3mLAgNO3，物质的量浓度为0.01摩尔/升；6mLH2SO4，物质的量浓度为0.5摩尔/升；2.4mL抗坏血酸，物质的量浓度为0.1摩尔/升。
以下实施例中，使用的TM缓冲液为20mMTris碱，5mMMgCl2，pH＝8。
以下实施例中，使用的DNA单链碱基序列如序列表1，包括四条DNA序列，分别是序列S1、序列S2、序列S3、序列S4。
本实施方式中，APD是指基于金纳米棒、阳离子聚合物、DNA的杂化纳米系统的简称。L-DNA为左旋DNA。L-TDNs未左旋DNA四面体。
实施例1
本实施例中，左旋DNA也表示为L-DNA，用“L-”表示左旋。
本实施例中，APD杂化纳米系统通过以下步骤制得。
(1)将3.7mL0.1摩尔/升CTAB和150μL0.01摩尔/升HAuCl4混合后加0.85mL去离子水，冰浴状态下再加入0.3mL0.01摩尔/升的冰NaBH4水溶液，1200转/分快速搅拌2分钟，静置2h将立即生成CTAB包覆的金种子。将已制备的金种子溶液1.4mL加入到金纳米棒生长液中，450转/分快速搅拌2分钟，静置12h后以10000转/分转速离心10分钟，用0.01摩尔/升CTAB溶液重悬金纳米棒，常温保存备用。所述生长液为：300mLCTAB，物质的量浓度为0.1摩尔/升；16mLHAuCl4，物质的量浓度为0.01摩尔/升；3mLAgNO3，物质的量浓度为0.01摩尔/升；6mLH2SO4，物质的量浓度为0.5摩尔/升；2.4mL抗坏血酸，物质的量浓度为0.1摩尔/升。
(2)取四种L-DNA单链，分别为序列S1、序列S2、序列S3和序列S4。序列S1、序列S2、序列S3和序列S4分别代表4种不同的L-DNA单链，四种左旋DNA单链碱基序列如序列表1。四种左旋DNA单链分别溶于TM缓冲液中。TM缓冲液为20mMTris碱，5mMMgCl2，pH＝8。取等体积等摩尔浓度的四种L-DNA溶液于试管中，旋涡混合30秒。随后将混合溶液置于PCR仪中，95℃退火5分钟，冷却至4℃过夜，制备得到L-TDNs，即左旋DNA四面体。
(3)取0.5ml金纳米棒溶液，以12000转/分的速度离心10分钟，除去上清液，用0.5ml超纯水重悬沉淀，重复上述离心操作1次，除去上清液。加入含巯基的二硫键交联聚乙烯亚胺溶液0.5ml，所述聚乙烯亚胺分子量1800Da，聚合物与金纳米棒的摩尔比为500:1，旋涡混合30秒后，于-196℃冷冻5分钟。然后室温解冻成溶液后，离心，弃去上清液，超纯水重悬沉淀；重复上述过程3次，得到二硫键交联聚乙烯亚胺修饰的金纳米棒。
(4)将步骤(3)中制备的二硫键交联聚乙烯亚胺修饰的金纳米棒与L-TDNs溶液孵育15分钟，即得APD杂化纳米系统。
为说明本发明构建得到的APD杂化纳米系统的技术效果，发明人通过以下检测手段逐一对APD杂化纳米系统进行检测，同时与现有纳米级药物载体进行对比。
发明人采用聚丙烯酰胺凝胶电泳试验观察DNA双链(S1+S2)、DNA三链(S1+S2+S3)和DNA四面体(L-TDNs)的移动行为。结果如图1所示，图1示出了DNA标准样、DNA双链、DNA三链和DNA四面体的聚丙烯酰胺凝胶电泳图。图1中，条带1为DNA标准样，条带2为DNA双链(S1+S2)，条带3为DNA三链(S1+S2+S3)，条带4为DNA四面体(L-TDNs)。从图1聚丙烯酰胺凝胶电泳结果可以看出，L-TDNs移动距离最短，因为DNA四面体由四条DNA链组成，分子量最大，所以移动速度最慢、移动距离最短。该结果证明本实施例已成功制备了DNA四面体。
发明人采用透射电子显微镜观察CTAB包覆的金纳米棒和APD三元纳米粒的微观形貌，TEM结果如图2(A)和图2(B)所示。图2(A)是CTAB包覆的金纳米棒透射电镜图。图2(B)是APD杂化纳米系统透射电镜图。CTAB包覆的金纳米棒和APD都呈棒状，分散性好，没有出现聚集现象。
发明人采用紫外可见分光光度计检测上述两种金棒的吸收光谱，结果如图3所示。图3是APD杂化纳米系统与CTAB包覆的金纳米棒紫外-可见吸收光谱对比图。从图3可以看出，CTAB包覆的金棒纵向等离子共振吸收峰位于808纳米，APD的纵向等离子共振吸收峰蓝移8纳米，说明制备操作没有改变金纳米棒吸收近红外光的性质。
发明人采用动态激光粒度仪检测CTAB包覆金纳米棒和APD的表面电荷，结果如图4所示。图4是APD杂化纳米系统与CTAB包覆的金纳米棒zeta电位对比图。图4表明，两种金棒表面电荷均呈正电性，APD zeta电位值略低于CTAB包覆的金纳米棒。
实施例2
本实施例主要说明APD纳米系统的抗核酶降解能力。
采用相同方法制备左旋DNA四面体和右旋DNA四面体，制备方法同实施例1步骤(2)。采用右旋DNA(D-DNA)制备右旋DNA四面体(D-TDNs)，D-DNA碱基序列与L-DNA相同。APD的制备方法同实施例1，本实施例不再赘述。将D-TDNs、L-TDNs和APD与脱氧核糖核苷酸酶混合，37℃孵育8h，加入EDTA终止酶降解反应。随后，APD与酶中加入肝素钠，破坏静电作用，释放出D-TDNs。其余样品不用加肝素钠处理。
采用聚丙烯酰胺凝胶电泳试验观察样品的移动情况，结果如图5所示。图5中，条带1为左旋DNA四面体(L-TDNs)，条带2为左旋DNA四面体与脱氧核糖核酸酶共孵育8小时，条带3为APD纳米粒与脱氧核糖核酸酶共孵育8小时，条带4为右旋DNA四面体(D-TDNs)与脱氧核糖核酸酶共孵育8小时。从图5可以看出：条带4，即D-TDNs出现荧光减弱和弥散现象，说明D-TDNs组部分DNA被核酶降解；条带2(L-TDNs)和条带3(APD)的荧光条带明亮且集中，没有出现弥散现象，说明这两个样品降解很少，具有抗核酶降解的能力。
实施例3
本实施例为靶向APD纳米系统制备实施例。
合成叶酸-含巯基聚赖氨酸结合物：将叶酸、含巯基聚赖氨酸、EDC和NHS按摩尔比1:1:1.5:1.5投料，溶于二甲基亚砜20ml，室温下磁力搅拌24小时。然后将反应液转移到透析袋中，截止分子量6000Da，浸入超纯水中透析24小时。透析时间届满，采用冷冻干燥法除去样品中的水分，得到叶酸-聚赖氨酸结合物。
按照以下步骤制备纳米系统：
(1)通过晶种生长法制备特定尺寸的金纳米棒。将3.7mL0.1摩尔/升CTAB和150μL0.01摩尔/升HAuCl4混合后加0.85mL去离子水，冰浴状态下再加入0.3mL0.01摩尔/升冰NaBH4水溶液，1200rpm快速搅拌2min，静置5h。立即生成CTAB包覆的金种子。将已制备的金种子溶液1.4mL加入到金纳米棒生长液中，450rpm快速搅拌2min，静置12h。届时，12000g离心10分钟，然后用0.01摩尔/升CTAB溶液重悬金纳米棒，常温保存。
(2)取四种的L-DNA，分别为S1、S2、S3和S4。S1、S2、S3和S4分别代表4种不同的L-DNA单链，四种左旋DNA单链碱基序列如序列表1。四种左旋DNA单链分别溶于TM缓冲液中。TM缓冲液为20mMTris碱，5mMMgCl2，pH＝8。接着，取等体积等摩尔浓度的四种DNA溶液于试管中，旋涡混合2分钟。随后将混合溶液置于PCR仪中，95℃退火15分钟，冷却至4℃过夜，制备得到L-TDNs。
(3)取0.5ml金纳米棒溶液，以12000转/分的速度离心10分钟，除去上清液，用0.5ml超纯水重悬沉淀，重复上述离心操作1次，除去上清液。加入叶酸-聚赖氨酸溶液0.5ml，聚合物与金纳米棒的摩尔比为20000:1旋涡混合30秒后，于-20℃冷冻2h。然后室温解冻成溶液后，离心，弃去上清液，超纯水重悬沉淀；重复上述过程3次，得到阳离子聚合物修饰的金纳米棒。
(4)将步骤(3)中制备的叶酸-聚赖氨酸修饰的金纳米棒与L-TDNs溶液孵育60分钟，离心即得具有主动靶向性的叶酸-APD杂化纳米系统。
实施例4
本实施例主要目的是说明纳米杂化系统的载药效果。
按照以下步骤制备纳米系统：
(1)通过晶种生长法制备特定尺寸的金纳米棒。将3.7mL0.1摩尔/升CTAB和150μL0.01摩尔/升HAuCl4混合后加0.85mL去离子水，冰浴状态下再加入0.3mL0.01摩尔/升冰NaBH4水溶液，1200rpm快速搅拌2min，静置2-5h。立即生成CTAB包覆的金种子。将已制备的金种子溶液1.4mL加入到金纳米棒生长液中，450rpm快速搅拌2min，静置12h。届时，12000g离心10分钟，然后用0.01摩尔/升CTAB溶液重悬金纳米棒，常温保存。
(2)取四种的DNA单链，分别溶于TM缓冲液中。接着取等体积相同摩尔浓度的四种DNA溶液于试管中，旋涡混合30秒至2分钟。随后将混合溶液置于PCR仪中，95退火15分钟，冷却至4℃过夜，制备得到DNA四面体溶液。将1M的DNA四面体溶液与500mM的阿霉素盐酸盐水溶液等体积旋涡混合1分钟，37℃孵育3小时。然后以5000转/分的速度离心10分钟，弃上清液，得到橙红色沉淀即为载阿霉素的DNA四面体。用荧光分光光度计检测上清液的荧光，计算上清液中游离阿霉素的质量。通过下列等式计算L-TDNs的载药量。通过计算得到阿霉素载药量为86％。
载药量＝(阿霉素初始质量-游离阿霉素质量)/(L-TDNs质量+阿霉素初始质量-游离阿霉素质量)*100％。
(3)取0.5ml金纳米棒溶液，以12000转/分的速度离心10分钟，除去上清液，用0.5ml超纯水重悬沉淀，重复上述离心操作1次，除去上清液。加入含巯基的鱼精蛋白溶液0.5ml，聚合物与金纳米棒的摩尔比为10000:1，旋涡混合30秒后，于-196℃冷冻10分钟。然后室温解冻成溶液后，离心，弃去上清液，超纯水重悬沉淀；重复上述过程3次，得到聚氨酸修饰的金纳米棒。
(4)将步骤(3)中制备的鱼精蛋白修饰的金纳米棒与L-TDNs溶液孵育40分钟，即得载阿霉素的APT杂化纳米系统。
实施例5
本实施例为细胞摄取试验。
将游离阿霉素盐酸水溶液(DOX)、实施例4制备的载药APD和载药L-TDNs与细胞共培养，采用流式细胞仪检测细胞摄取情况。
步骤如下：
将对数生长期的4T1(小鼠乳腺癌)细胞用胰蛋白酶消化，用培养基稀释成1×106/ml的细胞悬液，将该悬液按2ml/孔均匀加入6孔培养板中，置于37℃孵箱中培养24小时。
培养时间届满，弃去细胞培养基，加入含对照组样品或试验组样品的细胞培养基，DOX在培养基浓度为2M。继续培养4小时后，弃去培养基，用新鲜磷酸盐缓冲液清洗两次。然后加入胰蛋白酶消化细胞，制作单细胞悬液，用流式细胞仪检测细胞内阿霉素的荧光。激发波长488nm，检测波长580nm，结果见图6。图6示出了流式细胞仪检测结果。**代表t检验p<0.01。
由图6可见，载药APD组细胞内荧光最强，载药L-TDNs组细胞内荧光最弱，说明APD能提高肿瘤细胞对阿霉素的摄取量。
实施例6
本实施例为肿瘤细胞增殖抑制试验。
阿霉素盐酸水溶液作为试验组1、实施例5制备的载药APD+近红外光照(808nm，2W/cm2，1分钟)作为试验组2、实施例5制备的载药APD-近红外光照作为试验组3，采用CCK-8试剂盒检测上述样品处理后细胞内乳酸脱氢酶活性。试验步骤如下：
将对数生长期的4T1(小鼠乳腺癌)细胞用胰蛋白酶消化，用培养基稀释成3×104/ml的细胞悬液，将该细胞悬液按100μl/孔加入96孔细胞培养板中，每孔细胞数为3000～4000个。将细胞培养板置于37℃孵箱中，孵育24h，显微镜下观察可见细胞融合贴壁生长。分别将试验组样品溶于培养基中，所有溶液以其中盐酸阿霉素的含量为基准，稀释成不同浓度，折算成盐酸阿霉素浓度分别为0.001μg/ml，0.01μg/ml，0.1μg/ml，0.25μg/ml，0.5μg/ml，1μg/ml，10μg/ml，50μg/ml。向上述96孔细胞培养板中分别加入不同浓度的各样品100μl/孔，每个浓度设3个复孔，培养48h。不加药物的细胞作为阴性对照组，不加细胞只加培养基的孔作为空白对照组。48h后，每孔加入10μlCCK-8溶液，继续培养4h。然后用酶标仪检测570nm处的吸光值，用IC50.exe软件计算半数抑制浓度(IC50)，结果见表2。
表2：
Figure BDA0002313809830000091
由表2可知，载药APD加上近红外光热效应能有效抑制肿瘤细胞增殖，抑制效果显著优于阿霉素盐酸盐和无近红外光照的APD组。
本发明使用了正电荷的聚合物可以缩合DNA，避免使用昂贵的SH-DNA。使用聚合物修饰金纳米棒，可避免金纳米棒聚沉，避免使用表面活性剂如TWEEN80等，正电荷聚合物利于纳米粒子入胞。现有技术中用DNA置换SH-PEG制备得到的金纳米棒上DNA密度小于本申请制备得到的金纳米棒，导致单一金纳米棒颗粒上载药量更小，而本申请单一金纳米棒颗粒上载药量更大。阳离子聚合物上有较多的活性官能团如氨基，有利于通过氨基羧基酰胺化反应与其他功能分子键合，例如靶向分子RGD、叶酸、抗体等。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 四川大学
<120> 一种APD杂化纳米系统及其构建方法和应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 92
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ctcaactgcc tcagacggac aggtgatacg agagccggat gggcatgctc ttcccgtaga 60
gatagtacgg tattggaccg agtcctcgca tg 92
<210> 2
<211> 92
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 2
cgtatcacct gtccgtctga ggcagttgag agatctcgaa cattcctaag tctgaagatc 60
catttatcac cagctgctgc acgccatagt ag 92
<210> 3
<211> 92
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ggatcttcag acttaggaat gttcgagatc acatgcgagg actcggtcca ataccgtact 60
aacgattaca gatcaaagct acttgctaca cg 92
<210> 4
<211> 92
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ctctacggga agagcatgcc catccggctc actactatgg cgtgcagcag ctggtgataa 60
aacgtgtagc aagtagcttt gatctgtaat cg 92

Claims (10)

1.一种APD杂化纳米系统，其特征在于，该杂化系统是由含巯基的阳离子聚合物修饰的金纳米棒与左旋DNA四面体混合，孵育得到。
2.根据权利要求1所述的APD杂化纳米系统，其特征在于，所述阳离子聚合物修饰的金纳米棒通过以下步骤得到：
1)通过晶种生长法制备CTAB包覆的金纳米棒；
2)取金纳米棒离心，除去上清液，用超纯水重悬沉淀；加入含巯基的阳离子聚合物溶液，旋涡混合，低温冷冻，室温解冻成溶液，离心，弃去上清液，超纯水重悬沉淀，得到阳离子聚合物修饰的金纳米棒。
3.根据权利要求1或2所述的APD杂化纳米系统，其特征在于，所述阳离子聚合物修饰的金纳米棒通过以下步骤得到：
1)通过晶种生长法制备特定尺寸CTAB包覆的金纳米棒；
2)取0.5ml金纳米棒以12000转/分的速度离心10分钟，除去上清液，用0.5ml超纯水重悬沉淀，重复上述离心操作，除去上清液；加入含巯基的阳离子聚合物溶液0.5ml，阳离子聚合物与金纳米棒的摩尔比为500:1～20000:1，旋涡混合30秒后，于-20～-196℃冷冻至少5分钟；然后室温解冻成溶液后，离心，弃去上清液，超纯水重悬沉淀；重复上述过程3次，得到阳离子聚合物修饰的金纳米棒。
4.根据权利要求3所述的APD杂化纳米系统，其特征在于，所述含巯基的阳离子聚合物为含有伯氨基、仲胺基、叔氨基、咪唑基、胍基、季铵离子、氮杂环基中一种或多种官能团；优选地，所述含巯基的阳离子聚合物为含巯基的聚赖氨酸、含巯基的聚组氨酸、含巯基的聚精氨酸、含巯基的鱼精蛋白、含巯基的二硫键交联聚乙烯亚胺中的一种或多种，所述聚乙烯亚胺为重均分子量小于5000Da的低分子量聚乙烯亚胺。
5.根据权利要求1所述的APD杂化纳米系统，其特征在于，所述左旋DNA四面体通过以下步骤得到：
取四种左旋DNA单链，分别溶于TM缓冲液中，取等体积等摩尔浓度的四种DNA溶液于试管中，旋涡混合30秒至2分钟；
将混合溶液置于PCR仪中，95℃退火5分钟至15分钟，冷却至4℃过夜。
6.根据权利要求5所述的APD杂化纳米系统，其特征在于，所述四种左旋DNA单链碱基序列如序列表1，分别为序列S1、序列S2、序列S3、序列S4。
7.根据权利要求1所述的APD杂化纳米系统，其特征在于，所述孵育的时长为15-60分钟。
8.根据1-7任一权利要求所述APD杂化纳米系统的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)通过晶种生长法制备特定尺寸的金纳米棒；
2)取四种的左旋DNA单链，分别溶于TM缓冲液中；四种左旋DNA单链碱基序列如序列表1；所述TM缓冲液为20mMTris碱，5mMMgCl2，pH＝8；取等体积相同摩尔浓度的四种DNA溶液于试管中，旋涡混合30秒至2分钟；随后将混合溶液置于PCR仪中，95℃退火5至15分钟，冷却至4℃过夜，制备得到L-TDNs；
3)取0.5ml金纳米棒以12000转/分的速度离心10分钟，除去上清液，用0.5ml超纯水重悬沉淀，重复上述离心操作，除去上清液；加入含巯基的阳离子聚合物溶液0.5ml，聚合物与金纳米棒的摩尔比为500:1～20000:1，旋涡混合30秒后，于-20～-196℃冷冻至少5分钟；然后室温解冻成溶液后，离心，弃去上清液，超纯水重悬沉淀；重复上述过程3次，得到含巯基阳离子聚合物修饰的金纳米棒；
4)将步骤3)中制备得到的含巯基聚合物修饰的金纳米棒与L-TDNs混合，孵育15～60分钟；然后离心，弃去上清液，得到棕色沉淀为APD纳米粒。
9.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述晶种生长法制备特定尺寸金纳米棒的具体步骤：
1)将3.7mL0.1摩尔/升CTAB和150μL0.01摩尔/升HAuCl4混合后加0.85mL去离子水，冰浴状态下再加入0.3mL0.01摩尔/升冰NaBH4水溶液，1200转/分快速搅拌2分钟，静置2～5h将立即生成CTAB包覆的金种子；
2)将已制备的金种子溶液1.4mL加入到金纳米棒生长液中，450转/分钟快速搅拌2分钟，静置12h后以10000转/分转速离心10分钟，用0.01摩尔/升CTAB溶液重悬金纳米棒，常温保存备用。
10.根据1-7任一权利要求所述APD杂化纳米系统的应用，其特征在于，用于负载药物，特别是化疗药物。
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