CN110455761A - 一种基于共轭聚合物纳米粒子和金纳米棒的荧光探针及其应用 - Google Patents

一种基于共轭聚合物纳米粒子和金纳米棒的荧光探针及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种基于共轭聚合物纳米粒子（PBOC）和金纳米棒的荧光探针和HA作为猝灭剂连接两者的检测HAase的新型荧光方法。通过将课题组设计的一种共轭聚合物PBOC与聚乙烯亚胺（PEI）进行纳米共沉淀，得到一种表面富含氨基基团（带正电）的新型共轭聚合物纳米粒子（CPNs‑PBOC‑NH2）。并利用氯金酸和抗坏血酸等通过晶种生长法制备出一种金纳米棒（Au NPs）。因为静电吸附作用，CPNs‑PBOC‑NH2、HA和金纳米棒先后自组装成纳米探针（CPNs‑PBOC‑NH2‑HA‑Au），通过FRET作用，使得CPNs‑PBOC‑NH2的荧光猝灭。随着HAase的引入，HA被降解成小片段，导致CPNs‑PBOC‑NH2的释放即荧光恢复。经过实验证明，这种基于共轭聚合物纳米粒子和金纳米棒的荧光探针对HAase具有很高的选择性和敏感性，具有良好的实际应用之价值。

Description

一种基于共轭聚合物纳米粒子和金纳米棒的荧光探针及其 应用
技术领域
本发明属于荧光探针技术领域，具体涉及一种基于共轭聚合物纳米粒子和金纳米棒的荧光探针及其应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
透明质酸(HA)是一种基本结构由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰葡糖胺组成的大型多糖类。HA直接调节几种重要的生物过程，例如细胞粘附，迁移和增殖。透明质酸酶(HAase)是一种将HA降解为小片段的酶。HAase与多种生理和病理过程有关，包括受精、胚胎生长、炎症和肿瘤生长。最近，越来越多的证据表明HAase在许多癌症中过度表达，包括结肠癌，膀胱癌，前列腺癌等。因此，开发简便易行的HAase检测方法极为重要，这对于临床诊断和早期治疗至关重要。
已经开发了各种用于HAase检测的方法，例如比浊法，荧光法，比色法，分光光度法，和免疫测定法等。在HAase测定策略中，这些方法通常是“时间-消耗”的，需要昂贵的设备，并且缺乏实际应用所需的选择性。因此，利用更简单和高灵敏度的检测来检测HAase是非常有必要。利用良好的灵敏度，实时响应和操作简便性，荧光方法正成为生物分析和生物成像领域的有用分析技术。最近报道了一些荧光方法用荧光团标记的HA检测HAase。虽然这些荧光方法比其他传统方法更敏感，但它们的缺点，如金纳米粒子在高盐生物环境中不稳定，荧光团或生物素标记不稳定。HA可能会影响HAase的活性。因此，开发具有高灵敏度，易操作性和良好生物相容性的新型荧光纳米探针已变得越来越重要和迫切。
最近，基于纳米材料的探针基于其固有的优点，例如简单性，灵敏度和良好的光稳定性，已经引起了生物成像、生物和生物医学应用的广泛关注。在过去几年中，聚合物纳米粒子已成为光学传感纳米材料，由于其高量子产率和良好的光稳定性，因此常用于生物成像、生物标记和生物医学研究。然而，聚合物纳米粒子的水溶性差和生物相容性差限制了它们对生物领域的进一步分析应用。因此，研究人员正在开发使聚合物纳米粒子具有水溶性和生物相容性的方法。共轭聚合物纳米粒子是生物医学和纳米技术中最受欢迎和最重要的材料之一。其具有优异的特性，包括卓越的荧光亮度，快速发射率高，光稳定性好，不闪烁，无毒，易于表面功能化的特点。
发明内容
基于上述现有技术的不足，本发明提供一种基于共轭聚合物纳米粒子和金纳米棒的荧光探针及其应用，本发明通过纳米沉淀法将共轭聚合物(PBOC)制备成共轭聚合物纳米粒子，并将其进行氨基化处理(CPNs-PBOC-NH2)。根据测试，因为静电吸附作用，CPNs-PBOC-NH2、HA和金纳米棒先后自组装成纳米探针(CPNs-PBOC-NH2-HA- Au)，通过荧光共振能量转移(FRET)作用，使得CPNs-PBOC-NH2的荧光猝灭。随着HAase的引入，HA被降解成小片段，导致CPNs- PBOC-NH2的释放即荧光恢复。经过实验证明，这种基于共轭聚合物纳米粒子和金纳米棒的荧光探针对HAase具有很高的选择性和敏感性，具有良好的实际应用之价值。
本发明的一个方面，提供一种基于共轭聚合物纳米粒子和金纳米棒的荧光探针，所述荧光探针包括氨基化的共轭聚合物纳米粒子(CPNs-PBOC-NH2)和金纳米棒；
其中，所述羧基化的共轭聚合物纳米粒子CPNs-PBOC-NH2，其制备方法如下：
PBOC和功能聚合物PEI溶于四氢呋喃；经过超声，形成均匀溶液，然后，在超声的条件下快速倒入超纯水超声，旋蒸除去四氢呋喃，过滤即得；
进一步的，所述PBOC结构式如下：
n为大于0的自然数，优选为大于45的自然数，进一步优选为 50，所述PBOC结构单元分子量为689；
进一步的，所述PEI结构式如下：
其中，n为大于0的自然数，优选为大于850的自然数，进一步优选为864，所述PEI的结构单元分子量为202。
其中，所述金纳米棒，其制备方法如下：
首先，利用CTAB、HAuCl4·4H2O和强还原剂NaBH4制备金种溶液老化2～3h；然后利用CTAB、HAuCl4·4H2O和AgNO3配置生长溶液；最后利用弱还原剂抗坏血酸得到金纳米棒。
本发明的第二个方面，提供上述基于共轭聚合物纳米粒子和金纳米棒的荧光探针在检测透明质酸酶中的应用。
本发明的第三个方面，提供一种透明质酸酶的检测方法，所述方法包括：
将CPNs-PBOC-NH2溶液和透明质酸钠溶液在室温下孵育处理；
然后将金纳米棒加入到孵育中的溶液继续孵育；
向孵育完成后的溶液中加入待测样品进行荧光定量检测。
本发明的有益技术效果：
(1)本申请提供了一种结构新颖的基于共轭聚合物纳米粒子和金纳米棒的荧光探针，可作为检测透明质酸酶的荧光探针进行应用；该探针具有结构稳定性和良好的光学特性。
(2)本申请中的荧光探针能够实现对透明质酸酶的检测，并且进行了多种干扰物质的测试。该探针具有非常好的选择性和灵敏性，检测的HAase的浓度在1U/mL～45U/mL范围内呈线性关系，且其对透明质酸酶的LOD为0.017U/mL，因此特别适于对微量透明质酸酶的检测，因此具有良好的实际应用之价值。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明共轭聚合物纳米粒子荧光探针制备及检测HAase 原理图；
图2为本发明CPNs-PBOC-NH2与金纳米棒的TEM图像(左图： CPNs-PBOC-NH2；右图：金纳米棒)；
图3为本发明CPNs-PBOC-NH2与金纳米棒对不同浓度的透明质酸的荧光响应图；
图4为本发明共轭聚合物纳米粒子荧光探针对HAase的荧光检测图；
图5为本发明共轭聚合物纳米粒子荧光探针与HAase浓度的线性拟合曲线。
图6为本发明共轭聚合物纳米粒子荧光探针对HAase的选择性测试图。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本发明使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
如前所述，已经开发了用于HAase检测的方法，例如比浊法，荧光法，比色法，分光光度法，和免疫测定法等。在HAase测定策略中，这些方法通常是“时间-消耗”的，需要昂贵的设备，并且缺乏实际应用所需的选择性。
有鉴于此，本发明提供一种结构新颖的基于共轭聚合物纳米粒子和金纳米棒的荧光探针，其作用机理如下：
因为静电吸附作用，CPNs-PBOC-NH2、HA和金纳米棒先后自组装成纳米探针(CPNs-PBOC-NH2-HA-Au)，通过FRET作用，使得CPNs-PBOC-NH2的荧光猝灭。随着HAase的引入，HA被降解成小片段，导致CPNs-PBOC-NH2的释放即荧光恢复。经过实验证明，这种基于共轭聚合物纳米粒子和金纳米棒的荧光探针对HAase 具有很高的选择性和敏感性，其LOD为0.017U/mL。
本发明的一个典型实施方式中，提供一种基于共轭聚合物纳米粒子和金纳米棒的荧光探针，所述荧光探针包括氨基化的共轭聚合物纳米粒子(CPNs-PBOC-NH2)和金纳米棒；
在本发明的一个具体实施方式中，所述氨基化的共轭聚合物纳米粒子CPNs-PBOC-NH2，其制备方法如下：
将溶于四氢呋喃的PBOC和溶于超纯水的功能聚合物PEI；进行超声，形成均匀溶液，然后，在超声的条件下快速加入超纯水超声，除去四氢呋喃，过滤即得。
在本发明的一个具体实施方式中，所述PBOC结构式如下：
n为大于0的自然数，优选为大于45的自然数，进一步优选为 50，所述PBOC结构单元分子量为689；
在本发明的一个具体实施方式中，提供所述PBOC的制备方法，包括：
将四乙基(2,5’-二(乙基己基)-1,4’-亚苯基)二(亚甲基)二磷酸酯加入到除水的四氢呋喃中，并氮气保护，反应混合物保持在冷浴下；然后将叔丁醇钾加入到混合物中，并持续氮气保护，继续搅拌后移至油浴，加入N-正辛基-3,6’-二甲酰基-咔唑，继续氮气保护反应；反应完成后倒入水中，并用二氯甲烷萃取，减压蒸馏除去二氯甲烷，残渣用四氢呋喃和正己烷分级沉淀法提纯，得橘黄色固体即 PBOC。
在本发明的一个具体实施方式中，所述四乙基(2,5’-二(乙基己基)-1,4’-亚苯基)二(亚甲基)二磷酸酯、叔丁醇钾与N-正辛基-3,6’- 二甲酰基-咔唑的质量比为0.4～1：0.1～0.4：0.1～0.5(优选为0.6： 0.25：0.35)；
在本发明的一个具体实施方式中，所述PEI结构式如下：
其中，n为大于0的自然数，优选为大于850的自然数，进一步优选为864，所述PEI的结构单元分子量为202；
在本发明的一个具体实施方式中，所述PBOC与PEI的浓度比为20～30μg·mL-1:10μg·mL-1(优选为25μg·mL-1:10μg·mL-1)；PBOC 与PEI的浓度及其比例关系影响后续共轭聚合物纳米粒子荧光探针的制备以及对HAase的检测。
在本发明的一个具体实施方式中，所述过滤采用0.2μm过滤器进行过滤。
在本发明的一个具体实施方式中，提供上述金纳米棒的制备方法
首先，利用CTAB、HAuCl4·4H2O和强还原剂NaBH4制备金种溶液老化2～3h；然后利用CTAB、HAuCl4·4H2O和AgNO3配置生长溶液；最后利用弱还原剂抗坏血酸得到金纳米棒。
在本发明的一个具体实施方式中，提供上述共轭聚合物纳米粒子荧光探针在检测透明质酸酶中的应用。
在本发明的一个具体实施方式中，提供一种透明质酸酶的检测方法，所述方法包括：
将CPNs-PBOC-NH2溶液和透明质酸钠溶液在室温下孵育处理；
然后将金纳米棒加入到孵育中的溶液继续孵育；
向孵育完成后的溶液中加入待测样品进行荧光定量检测。
在本发明的一个具体实施方式中，所述CPNs-PBOC-NH2与金纳米棒的质量摩尔比为1μg：1.86～14.88μmol(优选为1μg：7.44μmol)；
在本发明的一个具体实施方式中，所述荧光定量检测具体条件为：荧光光谱测定范围为440～700nm，激发波长为430nm，激发/发射狭缝设置为10nm。
以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1共轭聚合物PBOC的合成
取四乙基(2,5’-二(乙基己基)-1,4’-亚苯基)二(亚甲基)二磷酸酯(0.5g，0.74mmoL)加入到除水的四氢呋喃中，并氮气保护，反应混合物保持在冷浴下，然后将叔丁醇钾(0.2g，1.78mmoL)加入到混合物中，并持续氮气保护，继续搅拌30分钟后移至油浴，加入N-正辛基-3,6’-二甲酰基-咔唑(0.3g，0.96mmoL)，在25℃条件下继续氮气保护反应72小时，反应完成后倒入水中，并用二氯甲烷萃取，减压蒸馏除去二氯甲烷，残渣用四氢呋喃和正己烷分级沉淀法提纯，得到橘黄色固体。其结构单元分子量为689，聚合度为50。
实施例2氨基功能化共轭聚合物纳米粒子(CPNs-PBOC-NH2)的合成
荧光共轭聚合物PBOC溶于THF中、功能聚合物PEI(聚合度为864)溶于超纯水中分别制备1mg·mL-1储备液。THF混合溶液 (10mL)包括25μg·mL-1PBOC以及超纯水溶液(5mL)包括20 μg·mL-1PEI分别超声5分钟，混合形成均匀溶液，然后，在超声的条件下快速加入15mL超纯水中超声15分钟，最后用旋转蒸发法除去四氢呋喃蒸至10mL。最后通过0.2微米的过滤器过滤，即为 CPNs-PBOC-NH2。
实施例2金纳米棒的合成
首先制备金种溶液:取37μL配置好的的HAuCl4·4H2O(24.28 mM)溶液加入到2.7mL的CTAB(0.10M)溶液中，混合均匀，再快速加入220μL NaBH4(0.01M)溶液，混合均匀，将此溶液至于25℃条件下水浴2h,备用。
生长液配制:向14.6mL的CTAB(0.10M)溶液中加入186μL HAuCl4·4H2O(24.28mM)溶液，然后依次加入100μL AgNO3 (0.01M)溶液和65μL抗坏血酸(0.10M)溶液，此时溶液变成无色透明，最后加入配制好的35μL种子溶液，将此溶液置于水浴条件下生长15min.得到生长好的金纳米棒，离心去上清液分散于水中，置于冰箱中待用。
实施例3荧光探针的合成
CPNs-PBOC-NH2溶液(100μL、10μg·mL-1)、透明质酸溶液(100 μL、20μg·mL-1)在室温下孵化10分钟，再向其中加入金纳米棒溶液 (200μL、0.44μM))继续孵育10分钟，得到荧光明显淬灭的荧光探针(CPNs-PBOC-NH2@HA-Au)。荧光测试显示三者在此配比下的荧光猝灭效果最好，即为荧光探针最好的组合。
实施例4荧光探针对HAase的选择性及检测。
将不同浓度的HAase溶液加入纳米荧光探针系统中,荧光测量前温育(37℃)30分钟，即可得到随不同浓度的HAase溶液的加入呈现荧光变化的荧光光谱。荧光光谱测定范围为440～700nm激发波长为430nm激发/发射狭缝设置为10nm。该检测系统在HAase 存在的情况下出现荧光恢复，并且具有很好的线性检测关系。随着 HAase浓度升高从1U/mL-45U/mL,荧光强度逐渐增强，并得其检测极限(LOD)值为0.017U/mL。
实施例5荧光探针对HAase的检测的选择性
HAase的选择性检测实验采用检测HAase同样的方法，通过添加其他干扰物质在荧光测量前温育30分钟，来研究HAase检测的选择性。荧光光谱测定范围为440～700nm激发波长为430nm激发/发射狭缝设置为10nm。事实证明，基于CPNs-PBOC-NH2@HA-Au的荧光探针对HAase具有较高的选择性。
最后应该说明的是，以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。上述虽然对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。

Claims (9)

1.一种共轭聚合物纳米粒子荧光探针，其特征在于，所述共轭聚合物纳米粒子荧光探针包括羧基化的共轭聚合物纳米粒子(CPNs-PBOC-NH2)和金纳米棒；
其中，所述羧基化的共轭聚合物纳米粒子CPNs-PBOC-NH2，其制备方法如下：
PBOC和功能聚合物PEI溶于四氢呋喃；经过超声，形成均匀溶液，然后，在超声的条件下快速倒入超纯水超声，旋蒸除去四氢呋喃，过滤即得；
所述PBOC结构式如下：
所述PEI结构式如下：
2.如权利要求1所述的共轭聚合物纳米粒子荧光探针，其特征在于，所述PBOC的n为大于0的自然数，优选为大于45的自然数，进一步优选为50，所述PBOC结构单元分子量为689。
3.如权利要求1所述的共轭聚合物纳米粒子荧光探针，其特征在于，所述PBOC的制备方法，包括：
将四乙基(2,5’-二(乙基己基)-1,4’-亚苯基)二(亚甲基)二磷酸酯加入到除水的四氢呋喃中，并氮气保护，反应混合物保持在冷浴下，然后将叔丁醇钾加入到混合物中，并持续氮气保护，继续搅拌后移至油浴，加入N-正辛基-3,6’-二甲酰基-咔唑，继续氮气保护反应，反应完成后倒入水中，并用二氯甲烷萃取，减压蒸馏除去二氯甲烷，残渣用四氢呋喃和正己烷分级沉淀法提纯，得橘黄色固体即PBOC。
4.如权利要求3所述的共轭聚合物纳米粒子荧光探针，其特征在于，所述四乙基(2,5’-二(乙基己基)-1,4’-亚苯基)二(亚甲基)二磷酸酯、叔丁醇钾与N-正辛基-3,6’-二甲酰基-咔唑的质量比为0.4～1：0.1～0.4：0.1～0.5(优选为0.6：0.25：0.35)。
5.如权利要求1所述的共轭聚合物纳米粒子荧光探针，其特征在于，所述PEI的n为大于0的自然数，优选为大于800的自然数，进一步优选为864，所述PEI的结构单元分子量为202。
6.如权利要求1所述的共轭聚合物纳米粒子荧光探针，其特征在于，所述共轭聚合物纳米粒子荧光探针包括羧基化的共轭聚合物纳米粒子(CPNs-PBOC-NH2)和金纳米棒；
其中，所述金纳米棒，其制备方法如下：
首先，利用CTAB、HAuCl4·4H2O和强还原剂NaBH4制备金种溶液老化2～3h；然后利用CTAB、HAuCl4·4H2O和AgNO3配置生长溶液；最后利用弱还原剂抗坏血酸得到金纳米棒。
7.权利要求1-6任一项所述共轭聚合物纳米粒子荧光探针在检测透明质酸酶中的应用。
8.一种透明质酸酶的检测方法，其特征在于，所述方法包括：
将CPNs-PBOC-NH2溶液和透明质酸钠溶液在室温下孵育处理；
然后将金纳米棒加入到孵育中的溶液继续孵育；
向孵育完成后的溶液中加入待测样品进行荧光定量检测。
9.如权利要求8所述的检测方法，其特征在于，所述CPNs-PBOC-NH2与金纳米棒的质量摩尔比为1μg：1.86～14.88μmol(优选为1μg：7.44μmol)。
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